估算煙草n導(dǎo)入片段右端長度的分子標(biāo)記、引物及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別是設(shè)及估算煙草N導(dǎo)入片段右端長度的分 子標(biāo)記、引物及方法。本發(fā)明還設(shè)及擴(kuò)增該分子標(biāo)記的引物、該分子標(biāo)記和引物在煙草TMV 抗病基因定位或選育煙草抗TMV品種中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 煙草花葉病毒?。═obaccomosaicvirus,TMV)是我國煙草上的重要病害，每年造 成的損失位列十大煙草侵染性病害名單前列。生產(chǎn)上主要采取培育無毒苗、藥劑防治和銷 毀田間病殘體等措施進(jìn)行防治，在控制TMV的發(fā)生流行上取得了一定的效果，但TMV在局部 田塊爆發(fā)的情況仍然時有發(fā)生，造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，種植TMV抗病品種依然是防控 TMV最根本同時也是最經(jīng)濟(jì)有效的手段?？共∑贩N的推廣需要抗性高、且無產(chǎn)量劣勢和農(nóng)藝 性狀劣勢的品種。
[0003] 目前煙草的TMV抗源主要來源于煙草野生種屯、葉煙（N.glutinosa)，其抗性由一 個顯性單基因（腳控制。N基因在1994年被克隆，是植物中克隆的第一個NBS類抗病基因。 N基因抗TMV-U1株系。N基因的基因組序列大小為6656bp，包括5個外顯子和4個內(nèi)含子， 屬于TIR-NBS-LRR類型抗病基因。N基因的抗病機(jī)理為在病毒侵染位點(diǎn)出現(xiàn)過敏性壞死斑 (枯斑），通過誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞過敏性死亡限制TMV在植物體內(nèi)的移動。在介導(dǎo)了過敏反應(yīng) 后，煙草植株能夠獲得系統(tǒng)性抗性，對TMV或其它類似病原的再次入侵產(chǎn)生廣譜抗性。通過 一系列的常規(guī)雜交和回交轉(zhuǎn)育，N基因的抗性從屯、葉煙轉(zhuǎn)育至香料煙中，然后轉(zhuǎn)育至煙草品 種中。采用雜交育種轉(zhuǎn)育N基因的抗性，實際上是轉(zhuǎn)育包含N基因的野生煙染色體片段（簡 稱為N導(dǎo)入片段）。世界上抗TMV煙草育種利用的幾乎都是N導(dǎo)入片段。代表性品種是較 早商業(yè)化種植的包含N導(dǎo)入片段的抗TMV煙草品種Cokerl76和Spei曲t肥0。由于產(chǎn)量較 低、上部葉落黃較慢等連鎖累寶，包含N導(dǎo)入片段的煙草品種不能滿足生產(chǎn)的迫切需要。已 有研究證明N基因本身無產(chǎn)量和產(chǎn)值的連鎖累寶，連鎖累寶來源于N導(dǎo)入片段上的其他基 因。N導(dǎo)入片段較短的枯斑資源，推測其連鎖累寶可能較小，育種利用潛力較大。盡管N基 因在20年前被克隆，但N導(dǎo)入片段的長度和伴隨的累寶基因一直不清楚，限制了的N基因 在商業(yè)品種中的應(yīng)用。常規(guī)育種技術(shù)無法估算N導(dǎo)入片段的長度，產(chǎn)量、落黃和烘烤等性狀 為數(shù)量性狀，在育種早期難W選擇。估算煙草N導(dǎo)入片段長度的技術(shù)手段缺乏，導(dǎo)致抗TMV 煙草育種缺乏突破性進(jìn)展。因此如何克服現(xiàn)有技術(shù)的不足是目前煙草抗TMV育種技術(shù)領(lǐng)域 亟需解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種估算煙草N導(dǎo)入片段右端長 度的分子標(biāo)記、引物及方法，該分子標(biāo)記、引物及方法可用于篩選N導(dǎo)入片段較短的資源和 育種單株，達(dá)到減少N導(dǎo)入片段的連鎖累寶的效果，為選育出高抗TMV，且無明顯產(chǎn)量和質(zhì) 量劣勢的煙草品種提供技術(shù)手段。
[0005] 本發(fā)明的目的是提供估算煙草N導(dǎo)入片段右端長度的分子標(biāo)記。
[0006] 本發(fā)明的另一目的是提供一種估算煙草N導(dǎo)入片段右端長度的PCR擴(kuò)增方法所用 的引物對。
[0007] 本發(fā)明的又一目的是提供一種估算煙草N導(dǎo)入片段右端長度的方法。
[0008] 本發(fā)明的再一目的是提供上述分子標(biāo)記、引物對及估算方法在煙草TMV抗病基因 定位或選育煙草抗TMV品種中的應(yīng)用。
[0009] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了W下技術(shù)方案：
[0010] 本發(fā)明公開了估算煙草N導(dǎo)入片段右端長度的分子標(biāo)記，所述的分子標(biāo)記為Seq IDNo. 1 或SeqIDNo. 2 所示序列。
[0011] 本發(fā)明還公開了估算煙草N導(dǎo)入片段右端長度的PCR擴(kuò)增方法所用的引物對，所 述的引物對為TN5. 51引物對或TN5. 34引物對；
[001引所述的TN5. 51引物對的序列如下：
[0013] TN5. 51-F1 :5，-ttcgggtttttagttcggttt-3，（SeqIDNo. 3)，
[0014] TN5. 51-Rl:5, -aggcaccatgtcacaaaaca-3，(SeqIDNo. 4);
[0015] 所述的TN5. 34引物對的序列如下：
[0016] TN5. ：M-F1 :5, -cactttggcctctcacacaa-3'（SeqIDNo. 5)，
[0017] TN5. ；34-Rl:5，-aaacttgttcatagtctgcgaat-3'（SeqIDNo. 6)。
[0018] N導(dǎo)入片段是指包含TMV抗病基因（腳的野生煙染色體片段。N導(dǎo)入片段較短的 煙株，其連累寶可能較小。
[0019] 本發(fā)明還公開了一種估算煙草N導(dǎo)入片段右端長度的方法，W上述的TN5. 51引物 對或TN5. 34引物對為引物，W待檢測的包含N導(dǎo)入片段的煙草基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，如擴(kuò)增出對應(yīng)大小的DNA片段，則表明被檢測煙草的N導(dǎo)入 片段在該分子標(biāo)記位置與抗病對照材料Cokerl76無差異；如沒有擴(kuò)增出對應(yīng)大小的DNA片 段，則表明被檢測煙草的N導(dǎo)入片段在該分子標(biāo)記位置比抗病對照材料Cokerl76短；
[0020] N導(dǎo)入片段長度估算：根據(jù)N導(dǎo)入片段右端分子標(biāo)記檢測為陰性或陽性，判斷N片 段缺失或者包含該標(biāo)記對應(yīng)的基因。利用N導(dǎo)入片段的右末端鄰近的兩個標(biāo)記檢測結(jié)果估 算其長度。若內(nèi)側(cè)標(biāo)記為陽性，外側(cè)標(biāo)記檢測為陰性，表明該資源的N導(dǎo)入片段末端位于運(yùn) 兩個標(biāo)記之間，N導(dǎo)入片段的長度用其左右末端陽性標(biāo)記的基因組物理距離表示。某資源N 導(dǎo)入片段特異分子標(biāo)記檢測陰性越多，則表明該資源的N導(dǎo)入片段越短。
[002。其中，
[0022] 當(dāng)W權(quán)利要求2所述的TN5. 51引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果擴(kuò)增出845bp大小的 DNA片段，即SeqIDNo. 1所示序列的分子標(biāo)記，則表明被檢測煙草的N導(dǎo)入片段在該分子 標(biāo)記位置與抗病對照材料Cokerl76無差異；如沒有擴(kuò)增出845bp大小的DNA片段，則表明 被檢測煙草的N導(dǎo)入片段在該分子標(biāo)記位置比抗病對照材料Cokerl76短；
[0023] 當(dāng)W權(quán)利要求2所述的TN5. 34引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果擴(kuò)增出648bp大小的 DNA片段，即SeqIDNo. 2所示序列的分子標(biāo)記，則表明被檢測煙草的N導(dǎo)入片段在該分子 標(biāo)記位置與抗病對照材料Cokerl76無差異；如沒有擴(kuò)增出648bp大小的DNA片段，則表明 被檢測煙草的N導(dǎo)入片段在該分子標(biāo)記位置比抗病對照材料Cokerl76短。
[0024] 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解擴(kuò)增產(chǎn)物不僅限于用電泳檢測，還可W采用測序的方法 來確定。
[002引進(jìn)一步，優(yōu)選的是所述的PCR的反應(yīng)體系如下：
[0026] DNA模板 50ng/uL 2.5wU 10XPCRbuffer 2.0uL dNTPs2.5mM 1.2yL, 引物對中的引物10umol/L答1.5其L， 巨x-TaqDNA酶 5U/iiL0.3 口L， 過dH游 徐量，
[0027]總體積為20yL;
[002引所述的引物對為TN5. 51引物對或TN5. 34引物對。
[0029] 進(jìn)一步，優(yōu)選的是所述的PCR反應(yīng)程序：94°C預(yù)變性5min;然后進(jìn)入35個循環(huán)： 94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s;循環(huán)結(jié)束后72°C延伸lOmin;4°C保存。
[0030] 本發(fā)明的分子標(biāo)記序列（SeqIDNo. 1和SeqIDNo.。是通過W下技術(shù)方 案獲得的。利用參考基因組學(xué)的方法，W及已測序的含N基因煙草品種TN90基因組 [Sierro,N. ,Battey,J.N. ,Ouadi,S. ,Bakaher,N. ,Bovet,L. ,Willig,A. ,Goepfert,S. ,Pei tsch,M.C.andIvanov,N.V. (2014)Thetobaccogenomesequenceanditscomparison withthoseoftomatoandpotato.Nat.Commun. , 5,doi:10. 1038/ncomms4833]。 利 用煙草抗TMV的N基因序列（Genbank登錄號U15605. 1)，比對番茄基因組化ttp: // solgenomics.net/)。煙草N基因匹配至番茄基因Solycllg011350. 1. 1，該基因位于番 茄染色體化rll:4, 391，578. .4, 397, 668處。根據(jù)番茄N基因同源體所在11號染色體 4. 39Mb右側(cè)1. 5M周圍的低拷貝基因，采用BLAST方法調(diào)取TN90基因組中的基因序列， 將TN90基因序列與野生祖先N.sylvestris和N.tomensformis基因組進(jìn)行blastn比 對，選取比對identity值最高的兩個基因。根據(jù)TN90的同一位點(diǎn)的兩個拷貝與野生祖 先N.sylvestris和N.tomensformis比對identity值判斷該拷貝是否來自屯、葉煙。一 個拷貝與N.tomensformis中的基因identity大于99 %，另一個拷貝與N.sylvestris和 N.tomensformis中的基因identity小于95%，即該拷貝為來自屯、葉煙的漸滲片段，從而 得知來自屯、葉煙的漸滲片段替代了來自N.sylvestris基因組的片段。若比對的identity 小于95%的序列為來自屯、葉煙的漸滲片段，根據(jù)在TN90基因組數(shù)據(jù)庫中調(diào)取的序列，設(shè)計 TN90特異引物。在Cokerl76,屯、葉煙，Samsun順，SR1 (不含腳中擴(kuò)增，屯、葉煙與不含N 基因普通煙草相比的特異條帶為N位點(diǎn)漸滲片段的特異標(biāo)記。若比對的identity均大于 99%，設(shè)計保守引物，在Cokerl76,屯、葉煙，Samsun順，SR1(不含腳中擴(kuò)增，將擴(kuò)增片段測 序，比對測序結(jié)果，設(shè)計屯、葉煙特異的引物，再次在上述品種中擴(kuò)增，篩選屯、葉煙特異條帶， 開發(fā)為N位點(diǎn)漸滲片段的特異標(biāo)記。將特異條帶的PCR產(chǎn)物回收，送寶生物公司測序。獲 得包含本發(fā)明的分子標(biāo)記序列（S