eqIDNo. 1和SeqIDNo. 2)。
[0031] 番茄和煙草同為茄科作物，番茄的基因組大小為800Mb，二倍體煙草祖先種的基因 組大小約為2. 5抓。煙草基因組大小為番茄的3倍左右。番茄N基因同源體在番茄11號染 色體的4. 39M處，番茄N基因同源體右側1. 5Mb范圍內，在煙草染色體距離按照番茄距離的 3倍計算，對應煙草N基因所在染色體的范圍為4. 5Mb。因此，本發(fā)明公開的分子標記距離N 基因的物理距離可遠達4. 5Mb左右。與N基因的物理距離較遠的分子標記，適宜用于估算 N導入片段的長度。本發(fā)明公開的分子標記SeqIDNo. 1和SeqIDNo. 2在番茄染色體上 對應的物理位置分別為化rll-5. 51Mb和化rll-5. 34Mb，在番茄上距離N基因同源體的物理 距離分別為1. 12Mb、0. 95Mb。在煙草染色體距離按照番茄距離的3倍計算，在煙草上距離N 基因的物理距離分別為3. 36Mb、2. 85Mb。
[0032] 在本發(fā)明的一個實施方案中，所述分子標記為煙草基因組中SeqIDNo. 1和Seq IDNo. 2所示核巧酸序列的DM片段，即所包含的SeqIDNo. 1和SeqIDNo. 2的5'端 和/或3'端W外的核巧酸序列也是煙草基因組中的序列，優(yōu)選的，為煙草基因組中SeqID No. 1和SeqIDNo. 2的5'端和/或3'端的上下游序列。本領域技術人員可W理解，只要 擴增或者檢測包含N導入片段的煙草基因組DNA中的該分子標記，必然能夠檢測或擴增到 含有SeqIDNo. 1 和SeqIDNo. 2 所示的序列。SeqIDNo. 1 和SeqIDNo. 2 的 5' 端和 /或3'端的上下游序列的長度為適當長度，并不特別限定，例如，滿足分子標記的長度小于 10, 00化P、小于5, 00化P、小于2, 00化P、小于1, 20化P、小于1, 20化P、小于1, 00化P、或者小 于 800bp。
[0033] 對本領域技術人員而言，可W理解，也可WDM化學合成的方法得到本發(fā)明的分 子標記。
[0034] 本發(fā)明還公開了上述的估算煙草N導入片段右端長度的方法在選育煙草抗TMV品 種中的應用。
[0035] 本發(fā)明還公開了上述的估算煙草N導入片段右端長度的分子標記在煙草TMV抗病 基因定位或選育煙草抗TMV品種中的應用。本發(fā)明的分子標記可用于選育煙草抗TMV品 種中中，本領域技術人員可W理解，比如通過檢測是否存在本發(fā)明的分子標記來篩選估算N 導入片段的長度。含有所述分子標記表明N導入片段在該分子標記位置與抗病對照材料 Cokerl76無差異，不含有所述分子標記表明N導入片段在該分子標記位置比抗病對照材料 Cokerl76短。所述檢測可W是PCR檢測的方法，具體地，可W使用TN5. 51引物對或TN5. 34 引物對進行PCR擴增。所述檢測還可W通過測序方法進行。該煙草育種輔助選擇方法具有 簡便、快速、高通量的優(yōu)點。
[0036] 本發(fā)明還公開了上述的估算煙草N導入片段右端長度的PCR擴增方法所用的引物 對在煙草TMV抗病基因定位或選育煙草抗TMV品種中的應用。
[0037] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，其有益效果為：
[0038] 本發(fā)明提供了估算煙草N導入片段右端長度的分子標記，與N基因緊密連鎖但與N 基因的物理距離較遠，與煙草N基因的物理距離在2MbW上。與文獻已報道的N基因抗性 相關分子標記相比，本發(fā)明所述分子標記是用于估算N導入片段長度，而不是用于評價N基 因介導抗性的有無。選擇N導入片段較小的材料或育種單株，可望減少與N基因緊密連鎖 的累寶，如減少產(chǎn)量降低幅度。本發(fā)明的分子標記、PCR擴增方法所用的引物對及估算方法 可W簡便、快速、高通量地應用于煙草TMV抗病基因定位、選育煙草抗TMV品種及育種材料 N導入片段長度鑒定，有利于減少與N基因連鎖的累寶。
【附圖說明】
[0039] 圖1是本發(fā)明WTN5. 34為引物對的擴增產(chǎn)物電泳檢測結果；
[0040] 圖2為本發(fā)明WTN5. 51為引物對的擴增產(chǎn)物電泳檢測結果；
[0041] 其中，1為Cokerl76 ;2為屯、葉煙；3為Samsun順；4為K326 ;泳道M為marker,其 為lOObpDNALadder。
【具體實施方式】
[0042] 下面結合實施例對本發(fā)明作進一步的詳細描述。
[0043] 本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應視為限定本發(fā) 明的范圍。實施例中未注明具體技術或條件者，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件 或者按照產(chǎn)品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可W通過購買獲得的 常規(guī)產(chǎn)品。
[0044] 本發(fā)明公開了引物對W及估算煙草N導入片段右端長度的分子標記。利用本發(fā)明 的引物對，W待檢測的包含N導入片段的煙草基因組DNA為模板進行PCR，可W得到估算煙 草N導入片段右端長度的分子標記。需要指出的是，本領域技術人員可W理解，除了通過上 述PCR擴增獲得本發(fā)明的分子標記外，還可W通過化學合成獲得本發(fā)明的分子標記。
[0045] 估算煙草N導入片段右端長度的分子標記，所述的分子標記為SeqIDNo. 1或Seq IDNo. 2所示序列。
[0046] 估算煙草N導入片段右端長度的PCR擴增方法所用的引物對，所述的引物對為 TN5. 51引物對或TN5. 34引物對；
[0047] 所述的TN5. 51引物對的序列如下：
[0048]TN5. 51-F1 :5, -ttcgggtttttagttcggttt-3,，
[0049]TN5. 51-R1 :5，-aggcaccatgtcacaaaaca-3，；
[0050] 所述的TN5. 34引物對的序列如下：
[0051]TN5.；M-F1 :5，-cactttggcctctcacacaa-3,，
[0052]TN5.：M-R1 :5, -aaacttgttcatagtctgcgaat-3,。
[0053] 本領域技術人員熟知，在上述SeqIDNo. 3-6所示序列中，可在其5'端或3'端分 別增加1~30個堿基，所增加的堿基類型可根據(jù)煙草基因組DNA上與SeqIDNo. 3-6相匹 配區(qū)域的堿基類型并依據(jù)堿基配對原則來確定，由此得到的引物對與SeqIDNo. 3-6的擴 增產(chǎn)物基本相同（上游和下游引物之間的DNA序列相同）。因此，上述在SeqIDNo. 3-6的 5'端或3'端分別增加1~30個堿基并能擴增得到基本相同DNA片段的引物對，均包括在 本發(fā)明的引物對中。在本發(fā)明具體的實施方式中，本發(fā)明的引物對優(yōu)選為SeqIDNo. 3-6 所示序列。
[0054] 包含N導入片段的抗TMV煙草材料：屯、葉煙（N.glutinosa)、Coke;rl76、Samsun順、 Coke巧6。未包含N導入片段的感TMV材料SR1和K326。W上煙草材料均為常見的煙草種 質資源，公眾可從煙草種質資源保存單位或云南省煙草農(nóng)業(yè)科學研究院獲得。
[00巧]N.toba州m(TN90)、番茄、N.s}dvest;ris、N.tomensformis的參考基因組序列公眾 可從http://solgenomics.net/ 獲得。
[0056] 瓊脂糖凝膠DM回收試劑盒、DM片段純化試劑盒購自QIAGEN公司。DMMarker、 TaqDM聚合酶均購自大連寶生物公司。其他化學試劑均為市售產(chǎn)品。
[0057] 實施例1
[0058] 一、DNA提取
[0059] 用常規(guī)CTAB法分別提取煙草基因組DNA，方法為：
[0060] (1)稱取煙草葉片lOOmg左右置于1. 5血離屯、管中，加液氮用研棒研磨至粉末狀；
[0061] 似加入900y1預熱到65°C的2XCTAB緩沖液燈ris-肥1抑為7. 5100mM，EDTA 20mM，化Cl1. 4M，CTAB質量百分濃度為2% )，65°C度水浴20分鐘后取出冷卻；
[0062] (3)加入200yl氯仿-異戊醇混合液（氯仿和異戊醇的體積比為24 :1)搖勻，4°C 離屯、10min(7200;rpm)后轉移上清至1. 5血EP管；
[006引（4)再次加入200y1氯仿-異戊醇混合液（氯仿和異戊醇的體積比為24 :1)搖 勻，4°C離屯、10min(7200;rpm);
[0064] (5)取出上清置于新的EP管中，加入是該上清1/10體積3MP冊.2醋酸鋼，同時加 入與該上清等體積異丙醇，搖勻后4°C離屯、20min(1200化pm);
[0065] (6)棄上清，用體積百分濃度為75%乙醇清洗兩次后，干燥，用含RNase的TE緩沖 液融解，放置一20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0066] 二、PCR擴增及電泳檢測
[0067] PCR反應體系如下：
[0068] DNA模板 50ng/uL 2.5 PL， 10XPCRbuffer 2.0 pL， dNTPs2.5mM 1.2 nL, 引物對中的引物10umol/y丄各1.5pL， Ex-TaqDNAI'南：5U/UL 0.3 ftU dd.H,2.〇 余 11;:， 總體積為20
[0069] 所述的引物對為TN5. 51引物對或TN5. 34引物對。
[0070] 本領域技術人員應該理解，"引物對中的引物lOumol/yL各1. 5yL"的具體為： TN5. 51引物對中的上、下游引物的濃度均為lOumol/yL，用量均為1. 5yL?；蛘逿N5. 34引 物對中的上、下游引物的濃度均為1〇11111〇1/^以用量均為1. 5yL。
[0071] 所用試劑購自寶生物公司。
[007引 PCR反應程序如下：94°C預變性5分鐘；94°C變性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸 30秒，運行35個循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘。PCR擴增產(chǎn)物可W在4°C保存。
[007引？0?產(chǎn)物電泳檢測：用質量百分濃度1.2%的瓊脂糖凝膠120乂電泳25111血邸染色lOmin，照膠并記錄。
[0074] 接下來先確定煙草基因是否攜帶N導入片段，然后對陽