單采法建立免疫細胞庫及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種細胞庫的構(gòu)建方法及應(yīng)用，特別涉及一種免疫細胞庫的構(gòu)建方法及應(yīng)用。
技術(shù)背景
[0002]外科手術(shù)、化療、放療是治療惡性腫瘤的常用手段，這些治療方法有一定的侵襲性，會損傷正常細胞，毒副作用大。免疫細胞治療腫瘤，能特異性殺傷腫瘤細胞，而不會損傷正常細胞，毒副作用小，因而被稱為抗腫瘤治療的第四種方法。
[0003]2010年，美國FDA批準了世界上第一個免疫細胞治療前列腺癌的藥物，經(jīng)過512例的臨床試驗，可以使前列腺癌患者生存期延長4個月。國內(nèi)很多醫(yī)院也開展免疫細胞治療腫瘤的臨床研究，廣西醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院報道，采用⑶3單克隆抗體、白細胞介素2等激活的免疫細胞，治療23例小細胞肺癌，有效率78%，I年生存率82%，明顯高于對照組的有效率35%，1年生存率47%。
[0004]免疫細胞治療腫瘤的程序是，首先采集腫瘤患者靜脈血，送到細胞工廠，分離靜脈血中的免疫細胞，加入免疫細胞培養(yǎng)液，以及重組人白細胞介素2、r干擾素，CD3單克隆抗體等細胞因子激活免疫細胞，放置于C02培養(yǎng)箱中(或者生物反應(yīng)器)培養(yǎng)，免疫細胞開始增殖，2-3周后，免疫細胞可增殖數(shù)百倍到一千倍，免疫細胞殺傷腫瘤細胞的能力也大大增強，殺傷性免疫細胞⑶3+⑶56+雙陽性細胞比例由1%?2%上升到30%以上，最高可以達到50%，最后收集免疫細胞，通過一系列嚴格的檢測后，將擴增的免疫細胞回輸給腫瘤患者，免疫細胞在腫瘤患者體內(nèi)發(fā)揮殺傷腫瘤細胞的作用，從而達到治療腫瘤的目的。
[0005]但是，現(xiàn)有的免疫細胞治療腫瘤的制備程序存在缺陷，因為，治療腫瘤的免疫細胞來自腫瘤患者，腫瘤患者的免疫細胞功能受損，殺傷腫瘤細胞能力低下，盡管采用CD3單克隆抗體、白細胞介素2等細胞因子激活，免疫細胞殺傷腫瘤細胞的能力獲得增強，但是依然低于健康人免疫細胞殺傷腫瘤細胞的能力?？茖W研究也證明這一點。有學者比較了腫瘤患者和健康人靜脈血免疫細胞，經(jīng)過CD3單克隆抗體、r干擾素、白細胞介素2等細胞因子激活后，第14天，腫瘤患者的免疫細胞擴增95倍，低于健康人145倍；腫瘤患者免疫細胞殺傷腫瘤細胞株K562的能力是44%，低于健康人的62%。這說明，現(xiàn)有的使用腫瘤病人免疫細胞進行免疫細胞治療的程序并不是最優(yōu)的方案。
[0006]為了克服上述的缺點，在健康狀態(tài)下，將健康人高質(zhì)量的免疫細胞儲存起來，保管在免疫細胞庫中，待將來儲存人患腫瘤時用于自體免疫細胞治療，是一種良好的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]人的外周血細胞，包括紅細胞、粒細胞、單個核細胞(主要是淋巴細胞，即免疫細胞)、血小板，它們的比重各不相同，在一定的離心力條件下，它們下降的幅度不一樣。利用此原理，單采機直接從人體靜脈血中采集分離淋巴細胞(即免疫細胞)，同時，將不需要的血細胞，如紅細胞、粒細胞、血小板等回輸?shù)饺梭w中。
[0008]本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下:
[0009](I)采集健康人靜脈血5mL，肝素抗凝，檢測乙型肝炎病毒表面抗原、丙型肝炎病毒抗體、艾滋病病毒抗體、梅毒螺旋體特異性抗體，血細胞三分類檢測。
[0010](2)安裝單采機，穿刺健康人靜脈，按照標準操作規(guī)程，操作單采機，單采淋巴細胞(即免疫細胞)50?100mL，取2?5mL做免疫細胞⑶3、⑶4、⑶56、⑶8檢測，以及厭氧菌培養(yǎng)、需氧菌培養(yǎng)。
[0011](3)步驟(2)所獲得的免疫細胞，離心，離心機轉(zhuǎn)速為1000?1300轉(zhuǎn)/分鐘，時間10?15分鐘，免疫細胞沉淀，棄上清，即獲得免疫細胞。
[0012](4)步驟(3)獲得免疫細胞中，加入冷凍保護劑，經(jīng)過程序降溫，降溫速率為-rc?-3°c /分鐘，溫度降至-80°c?-90°c后，置于液氮中冷凍保存，并建立可供檢索的免疫細胞信息檔案，即構(gòu)建人免疫細胞庫。
[0013]其中，冷凍保護劑是含10% (體積百分比)二甲基亞砜免疫細胞培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基是由90%的(體積百分比)無血清免疫細胞培養(yǎng)基含10% (體積百分比)10%白蛋白構(gòu)成。
[0014]以上全過程均在無菌環(huán)境中進行操作。
[0015]本發(fā)明所獲得的免疫細胞，解凍后，免疫細胞活力達到90 %以上，按照免疫細胞濃度0.5?I X 106/mL，接種于塑料培養(yǎng)袋，用無血清免疫細胞培養(yǎng)基，加入白細胞介素2、r干擾素、⑶3單克隆抗體，10%白蛋白，置37°C，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，免疫細胞開始擴增，每培養(yǎng)3?4天檢測免疫細胞數(shù)量，添加新鮮免疫細胞培養(yǎng)基，使免疫細胞終濃度0.5?I X 106/mL, 20天后，免疫細胞擴增800?1000倍，在原始免疫細胞接種1X 16情況下，可收集高達I X 101°免疫細胞，用于臨床治療腫瘤。
[0016]本發(fā)明所述的一種免疫細胞庫構(gòu)建方法，可以從健康人靜脈血中獲得免疫細胞，建立免疫細胞儲存庫，根據(jù)本發(fā)明的方法，儲存于庫內(nèi)的免疫細胞，可以經(jīng)過激活、擴增、獲得大量具有強大殺傷腫瘤細胞的能力，用于治療自身腫瘤。并且，能夠長時間保存而不喪失活性，操作簡便，具有應(yīng)用前景。
【具體實施方式】
[0017]以下實施例中，所用的原料或者試劑除特別說明外，均為市售可得。
[0018]實施例1
[0019]免疫細胞采集分離:
[0020](I)采集健康人靜脈血5mL，肝素抗凝，檢測乙型肝炎病毒表面抗原、丙型肝炎病毒抗體、艾滋病病毒抗體、梅毒螺旋體特異性抗體，血細胞三分類檢測。
[0021](2)安裝單采機，穿刺健康人靜脈，按照標準操作規(guī)程，操作單采機，單采淋巴細胞(即免疫細胞)50?100mL，取2?5mL做免疫細胞⑶3、⑶4、⑶56、⑶8檢測，以及厭氧菌培養(yǎng)、需氧菌培養(yǎng)。
[0022](3)步驟⑵所獲得的免疫細胞，離心，離心機轉(zhuǎn)速為1000?1300轉(zhuǎn)/分鐘，時間10?15分鐘，免疫細胞沉淀，棄上清，即獲得免疫細胞。
[0023]以上全過程均在無菌環(huán)境中進行操作。
[0024]免疫細胞庫的構(gòu)建:
[0025]將獲得免疫細胞加入冷凍保護劑，裝入凍存管。冷凍保護劑配方是含10% (體積百分比)二甲基亞砜培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基是由90%的(體積百分比)無血清免疫細胞培養(yǎng)基含10% (體積百分比)10%白蛋白構(gòu)成。采用程序降溫系統(tǒng)(CBS freezer 2100)，降溫速率為-1°C?-3°C /分鐘，溫度降至-80°C?-90 °C，然后將凍存管保存在-196 °C液氮罐中。將其詳細信息(包括姓名、性別、年齡、地址、聯(lián)系方式、免疫細胞數(shù)量、各種檢查結(jié)果等信息)輸入電腦，建立完善的數(shù)據(jù)檔案備查。
[0026]實施例2
[0027]免疫細胞采集分離:
[0028](I)采集健康人靜脈血5mL，肝素抗凝，檢測乙型肝炎病毒表面抗原、丙型肝炎病毒抗體、艾滋病病毒抗體、梅毒螺旋體特異性抗體，血細胞三分類檢測。
[0029](2)安裝單采機，穿刺健康人靜脈，按照標準操作規(guī)程，操作單采機，單采淋巴細胞(即免疫細胞)50?100mL，取2?5mL做免疫細胞⑶3、⑶4、⑶56、⑶8檢測，以及厭氧菌培養(yǎng)、需氧菌培養(yǎng)。
[0030](3)步驟⑵所獲得的免疫細胞，離心，離心機轉(zhuǎn)速為1000?1300轉(zhuǎn)/分鐘，時間10?15分鐘，免疫細胞沉淀，棄上清，即獲得免疫細胞。
[0031]以上全過程均在無菌環(huán)境中進行操作。
[0032]免疫細胞庫的構(gòu)建:
[0033]將獲得免疫細胞用50% DMSO和50%右旋糖苷冷凍保護劑預處理，裝入凍存塑料袋，排除空氣，密封，放入鋁制凍存盒，置-80°C超低溫冰箱，緩慢降溫，2小時后，免疫細胞溫度降至_80°C，然后將凍存盒保存在_196°C液氮罐中。將其詳細信息(包括姓名、性別、年齡、地址、聯(lián)系方式、免疫細胞數(shù)量、各種檢查結(jié)果等信息)輸入電腦，建立完善的數(shù)據(jù)檔案備查。
[0034]實施例3
[0035]免疫細胞分離:
[0036](I)采集健康人靜脈血5mL，肝素抗凝，檢測乙型肝炎病毒表面抗原、丙型肝炎病毒抗體、艾滋病病毒抗體、梅毒螺旋體特異性抗體，血細胞三分類檢測。
[0037](2)安裝單采機，穿刺健康人靜脈，按照標準操作規(guī)程，操作單采機，單采淋巴細胞(即免疫細胞)50?100mL，取2?5mL做免疫細胞⑶3、⑶4、⑶56、⑶8檢測，以及厭氧菌培養(yǎng)、需氧菌培養(yǎng)。
[0038](3)步驟⑵所獲得的免疫細胞，離心，離心機轉(zhuǎn)速為1000?1300轉(zhuǎn)/分鐘，時間10?15分鐘，免疫細胞沉淀，棄上清，即獲得免疫細胞。
[0039]以上全過程均在無菌環(huán)境中進行操作。
[0040]免疫細胞庫構(gòu)建:
[0041 ] 將獲得免疫細胞用含10 % (體積百分比)DMSO和80 % (體積百分比)RPMI1640培養(yǎng)液以及10% (體積百分比)白蛋白冷凍保護劑預處理，裝入凍存管。采用程序降溫系統(tǒng)(CBS freezer 2100)，降溫速率為_1°C?_3°C /分鐘，溫度降至_80°C?_90°C，然后將凍存管保存在_196°C液氮罐中。將其詳細信息(包括姓名、性別、年齡、地址、聯(lián)系方式、免疫細胞數(shù)量、各種檢查結(jié)果等信息)輸入電腦，建立完善的數(shù)據(jù)檔案備查。
【主權(quán)項】
1.一種單采法建立免疫細胞庫的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟: 第一步，采集分離免疫細胞，其步驟包括: (1)采集健康人靜脈血5mL，肝素抗凝，做相關(guān)檢測。 (2)安裝單采機，穿刺健康人靜脈血，按照標準操作規(guī)程，操作單采機，單采淋巴細胞(即免疫細胞)50?10mL，取2?5mL做相關(guān)檢測。 (3)步驟(2)所獲得的免疫細胞，離心，免疫細胞沉淀，棄上清，即獲得免疫細胞。 第二步，構(gòu)建免疫細胞庫，其步驟包括: 將獲得免疫細胞加入冷凍保護劑，裝入凍存管，程序降溫后，將凍存管保存在-196°C液氮罐中。將其詳細信息(包括姓名、性別、年齡、地址、聯(lián)系方式、免疫細胞數(shù)量、各種檢查結(jié)果等信息)輸入電腦，建立完善的數(shù)據(jù)檔案備查。2.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟(I)中，相關(guān)檢測包括:乙型肝炎病毒表面抗原、丙型肝炎病毒抗體、艾滋病病毒抗體、梅毒螺旋體特異性抗體、血細胞三分類檢測。3.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟(2)中，相關(guān)檢測包括:厭氧菌培養(yǎng)、需氧菌培養(yǎng)、免疫細胞⑶3、⑶4、⑶56、⑶8檢測。4.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟(3)中，離心機轉(zhuǎn)速為1000?1300轉(zhuǎn)/分鐘，時間10?15分鐘。5.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述第二步中，冷凍保護劑配方是含10%(體積百分比)二甲基亞砜，10% (體積百分比)白蛋白，80% (體積百分比)RPMI1640培養(yǎng)液構(gòu)成。6.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述第二步中，程序降溫速率為-1°C?-3°C/分鐘，溫度降至-80 0C?-90 0C。7.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述第二步中，構(gòu)建免疫細胞庫在抗腫瘤方面的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了單采法建立免疫細胞庫構(gòu)建方法和應(yīng)用，本發(fā)明的構(gòu)建步驟包括：(1)采集靜脈血，肝素抗凝，檢測傳染病病毒；(2)安裝單采機，穿刺靜脈，按照標準操作規(guī)程，操作單采機，單采淋巴細胞；(3)取部分淋巴細胞做CD3、CD4、CD56、CD8檢測；(4)步驟(2)所獲得，離心；(5)收集沉淀，獲得所需免疫細胞；(6)加入冷凍保護劑；(7)置液氮中冷凍保存，將免疫細胞詳細信息，包括姓名、性別、年齡、免疫細胞數(shù)量、傳染病病毒結(jié)果等，輸入電腦，建立完善的數(shù)據(jù)檔案，即構(gòu)建出免疫細胞庫。本發(fā)明有抗腫瘤應(yīng)用價值。
【IPC分類】C12N5/078, A01N1/02
【公開號】CN105219709
【申請?zhí)枴緾N201510611028
【發(fā)明人】仇志根, 李春艷
【申請人】上海吉泉生物技術(shù)有限公司
【公開日】2016年1月6日
【申請日】2015年9月23日