專利名稱：：基于ip-10的免疫學(xué)監(jiān)測(cè)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明主要涉及一種免疫學(xué)分析，并且特別涉及一種用于測(cè)量細(xì)胞介導(dǎo)免疫(cell-mediatedimmune,CMI)反應(yīng)性的分析。更具體地說(shuō)，本發(fā)明提供了一種使用全血或其它合適的生物樣品來(lái)測(cè)量細(xì)胞介導(dǎo)對(duì)抗原的應(yīng)答的分析和試劑盒。這種分析在對(duì)人類、牲畜的治療和診斷方案以及獸醫(yī)學(xué)和野生動(dòng)物應(yīng)用上是有利的。對(duì)細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答的測(cè)量對(duì)多種傳染性疾病和自身免疫疾病的免疫診斷是很重要的，這種對(duì)細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答的測(cè)量作為對(duì)免疫活性的標(biāo)記，并用作對(duì)T細(xì)胞對(duì)內(nèi)源抗原和外源抗原(即，感染和疫苗)的應(yīng)答進(jìn)行的檢測(cè)。本發(fā)明提供了一種通過(guò)孵育來(lái)自哺乳動(dòng)物的樣品來(lái)測(cè)量哺乳動(dòng)物內(nèi)的CMI的方法，所述哺乳動(dòng)物的樣品含有具有抗原的T細(xì)胞或者其它免疫系統(tǒng)細(xì)胞。隨后檢測(cè)到干擾素誘導(dǎo)蛋白10(IP-10)的產(chǎn)生。這種免疫效應(yīng)物的存在或水平進(jìn)而表示了細(xì)胞介導(dǎo)對(duì)物體的應(yīng)答度水平。技術(shù)背景肺結(jié)核結(jié)核分枝桿菌(MTB)特異性免疫顯性抗原的發(fā)現(xiàn)引領(lǐng)了用于肺結(jié)核(TB)診斷的新途徑。早期的工作已顯示出通過(guò)對(duì)測(cè)定的MTB抗原做出應(yīng)答的T-細(xì)胞來(lái)測(cè)定體外干擾素y(IFN-y)的產(chǎn)生的試驗(yàn)來(lái)代替結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)的潛能。與此同時(shí)，一個(gè)重大的進(jìn)步就是發(fā)現(xiàn)了顯著地提高了特異性的高度免疫原性抗原、早期分泌性抗原靶6(ESAT-6)以及培養(yǎng)濾液蛋白10(CFP-10)和的發(fā)現(xiàn)結(jié)核菌7.7(TB7.7)。這些抗原在病原體的差異區(qū)1(RD1)內(nèi)進(jìn)行編碼，況包括堪薩斯分枝桿菌(Mycobacteriumk印sasii)、海分枝桿菌(Mycobacteriummarinum)、蘇加分枝桿菌(Mycobacteriumszulgai))。對(duì)RD1編碼的抗原ESAT-6、CFP-IO、TB7.7的重疊的肽的IFN-Y應(yīng)答形成了在兩種獲得許可并且商業(yè)可利用的試驗(yàn)中對(duì)MTB感染進(jìn)行檢測(cè)的基礎(chǔ)。一種全血酶聯(lián)免疫測(cè)定(ELISA)-康提伏朗-結(jié)核金(QuantiFERON-TBGold)(塞勒斯提有限公司，卡內(nèi)基，維多利亞，澳大利亞(CellestisLimited,Carnegie,Victoria,Australia))具有歐洲CE標(biāo)志認(rèn)證，并且最近得到了美國(guó)食品與藥品管理局(FDA)的用于纟企測(cè)潛伏的TB感染和疾病的iU正。一種使用外周血單個(gè)核細(xì)胞的酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定(ELISPOT)——結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-SPOT.TB)(牛津免疫科技，牛津，英國(guó)(OxfordImmunotec,Oxford,UK)具有歐洲CE認(rèn)證并且在2005年得到在加拿大使用的許可。T-SPOT.TB僅使用ESAT-6和CFPIO。然而，目前可用的試-瞼存在以下限制1)可能削弱在免疫抑制個(gè)體中的靈敏度(例如，人體免疫缺陷病毒(mv)陽(yáng)性或者接受免疫抑制藥物治療的患者)，2)在某些情況下需要相對(duì)大量的血液(3ml每QuantiFERON試驗(yàn)以及8ml用于T-SPOT.TB)，這可能限制了其對(duì)嬰兒和重病以及貧血兒童的使用，3)這些試驗(yàn)沒有區(qū)別對(duì)待活動(dòng)性感染、潛伏性感染以及近期感染(recentinfection)4)沒有證實(shí)這些試驗(yàn)?zāi)軌蝾A(yù)言誰(shuí)將從新近TB或潛伏性TB發(fā)展為活動(dòng)性TBo大多的試驗(yàn)限制是由于測(cè)量非常低水平的效應(yīng)參數(shù)IFN-y，這種低水平甚至接近最敏感的方法的極限(在QuantiFERON試驗(yàn)中低至0.35IU/ml(17.5pg/ml)并在T-SPOT.TB中為5點(diǎn)/單位面積(spots/field))。為了增強(qiáng)靈敏度而減少截止點(diǎn)(cut-off)將最終導(dǎo)致?lián)p害試驗(yàn)的特異性。目前基于QuantiFERON測(cè)試的出版物表示了對(duì)人們進(jìn)行的具有較低范圍的IFN-"y的試驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)試驗(yàn)在截止點(diǎn)水平附近有不同，這強(qiáng)調(diào)了QuantiFERON(QFT)測(cè)試的假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果的潛在風(fēng)險(xiǎn)(拜，M等人(Pai,M.etal))。為了克服這些測(cè)試的明顯的弱點(diǎn)，能夠通過(guò)使用另外的結(jié)核分枝桿菌特異性抗原來(lái)提高靈敏度，并且這已經(jīng)在第三代QuantiFERON(QFT)試驗(yàn)中實(shí)現(xiàn)，QuantiFERON管內(nèi)試驗(yàn)(QFT-IT)目前含有^皮命名為TB7.7(p4)的增加的抗原，并且能夠提高靈敏度，但是它仍然取決于在非常低的IFN-y水平上的測(cè)量。其他人已經(jīng)嘗試了這種方法，即，最近所表示的是IFN-y誘生單核因子(MIG/CXCL9)在用結(jié)核分枝桿菌特異性抗原(ESAT-6/CFP10)和純蛋白衍生物(PPD)刺激后的體外被特異性地表達(dá)。然而CXCL9的靈敏度非常低，而且比IFN-y的還要低。另一個(gè)較小的研究是基于在ESAT-6刺激后的CD4+T細(xì)胞內(nèi)的胞內(nèi)細(xì)胞因子細(xì)胞計(jì)數(shù)，如果IFN-y、IL-2、IL-4、IL-10或激活標(biāo)記物CD40L能將TB與非TB疾病區(qū)別開來(lái)，則對(duì)上述胞內(nèi)細(xì)胞因子細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行試驗(yàn)。這些標(biāo)記物中能沒有發(fā)現(xiàn)能與IFN-y相比或者優(yōu)于IFN-y的(阿布拉莫C等人(AbramoC,etal))(休斯，A等人(Hughes,A.etal))。在目前出版的文獻(xiàn)中仍然沒有測(cè)定用來(lái)取代用于診斷TB感染的IFN-y的敏感且特異的標(biāo)記物。各種出版物公開了IP-10與感染相關(guān)，但I(xiàn)P-10并不是作為在現(xiàn)有抗原刺激的感染診斷中的標(biāo)記物而被公開。衣原體對(duì)生殖道衣原體感染的診斷從二十世紀(jì)90年代開始得到了迅速發(fā)展。例如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增(TMA)以及脫氧核糖核酸鏈置換分析法(DNAstranddisplacementassay(SDA))的核酸擴(kuò)增試驗(yàn)(NAAT)目前是主流。在美國(guó)和其它工業(yè)國(guó)家中使用最普遍并且研究最廣泛的衣原體NAAT是阿普提瑪(Aptima)(基因探針(Gen-Probe))、保力科技(Probe-Tec)(貝迪醫(yī)療(Becton畫Dickinson))以及愛普力克(Amplicor)(羅氏(Roche))。Aptima組合II測(cè)定試驗(yàn)同時(shí)用于沙眼衣原體以及引發(fā)淋病的淋病奈氏菌(Neisseriagonorrhoeae)。用于衣原體的NAAT可以在從子宮頸(女性)或尿道(男性)中采集的分泌物樣本上進(jìn)行。目前,NAAT僅在對(duì)泌尿生殖器樣本的試驗(yàn)具有限制性的認(rèn)證。所述NAAT具有大量代替培養(yǎng)、用于衣原體診斷的歷史性的黃金標(biāo)準(zhǔn)，以及諸如化學(xué)熒光增強(qiáng)探針檢測(cè)法2型II(PACEII)(基因探針(Gen-Probe))的非擴(kuò)增的探針試驗(yàn)。后一試驗(yàn)相對(duì)地不敏感，僅能在無(wú)臨床癥狀的婦女中成功檢測(cè)到60-80%的感染，并且通常給出假陽(yáng)性的結(jié)果。培養(yǎng)在選擇的環(huán)境下保持了有效，并且它是目前唯一認(rèn)證的對(duì)非生殖器樣本進(jìn)行試驗(yàn)的測(cè)定。因此，對(duì)衣原體的診斷是建立在復(fù)雜的且資源需求的技術(shù)上，例如PCR，7而難以在發(fā)展中國(guó)家得到利用。一種快速而簡(jiǎn)單的技術(shù)將提高對(duì)這種重要疾病的i貪斷測(cè)量。CA2,478,138公開了趨化因子CXCL10多肽的血濃度的提高與呼吸道疾病(例如，非典型性肺炎(SARS)、流行性感冒和社區(qū)獲得性肺炎(community-acquiredpneumonia))有關(guān)，并有用于患者的診斷中。對(duì)忍受呼吸道疾病的患者提供了診斷和治療的方法。WO05/091969公開了用于傳播性海綿狀腦病(TransmissibleSpongiformEncephalopaties，TSE)的標(biāo)記物能在表現(xiàn)出臨床體征之前檢測(cè)到這種感染，該標(biāo)記物在形成可檢測(cè)的病理朊病毒細(xì)胞之前存在。IP-10就是所公開的多種標(biāo)記物中的一種，并且該申請(qǐng)沒有公開任何抗原刺激。的基因表達(dá)程序。IP-10還是其中所提及的許多標(biāo)記物中的一種，并且該申請(qǐng)沒有公開任何抗原刺激。安娜麗莎.安茱莉等人(AnnalisaAzzurrietal.)公開了IFN-y誘導(dǎo)蛋白10以及正五聚蛋白3血漿濃度是用來(lái)監(jiān)測(cè)結(jié)核分枝桿菌感染中的炎癥和疾病活性的工具。該文章表示了IP-10血漿濃度在患有TB的患者中自發(fā)地增加，同樣地，該對(duì)比文件沒有公開任何抗原刺激。WO03/063759公開了從對(duì)診斷或治療有效的肽所獲得的熱休克蛋白(Hsp)的確認(rèn)。該發(fā)明的化合物的效果是在外周血單核細(xì)胞上通過(guò)測(cè)量應(yīng)答于隨后的脂多糖(LPS)刺激的IP-10水平而進(jìn)行試驗(yàn)的。不進(jìn)行隨后的LPS刺激而用試驗(yàn)化合物進(jìn)行的直接刺激不能使IP-10水平增加。WO07/039400公開了用于免疫重建綜合癥(ImmuneRestorationSyndrome)的診斷的方法和試劑盒，所述免疫重建綜合癥與感染了肺結(jié)核的患者和HIV/TB共同感染患者中的肺結(jié)核(TB-IRS)相關(guān)。為了診斷TB-IRS,發(fā)明人檢測(cè)了輔助1型T淋巴細(xì)胞(Thl)對(duì)PPD和/或16千道爾頓(KDA)的蛋白質(zhì)的應(yīng)答水平與該Thl對(duì)ESAT-6、CFP-IO、85B(陰性對(duì)照)的相應(yīng)進(jìn)行比較，并將Thl應(yīng)答的上升用作TB-IRS的指示。為了克服目前使用抗原刺激的可利用的試驗(yàn)中削弱的靈敏度和可檢測(cè)的IFN-y的低水平的問(wèn)題，本發(fā)明的發(fā)明人提出了使用不同于IFN-y的生物標(biāo)記
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提出了一種新穎的診斷原則。一種能檢測(cè)例如肺結(jié)核利什曼原蟲(tuberculosisleishmania)或衣原體的感染的試驗(yàn)系統(tǒng)，該試驗(yàn)系統(tǒng)建立在用抗原蛋白或抗原肽刺激免疫細(xì)胞后對(duì)趨化因子IP-10進(jìn)行測(cè)量的基礎(chǔ)上。所描述的試驗(yàn)系統(tǒng)IP-IO比基于以IFN-Y作為特效參數(shù)的試驗(yàn)更靈敏，它改進(jìn)了試驗(yàn)和診斷。由于在孵育時(shí)或在進(jìn)行分析之前能稀釋樣品，因此能使用較少量的血液進(jìn)行該試驗(yàn)。該試驗(yàn)?zāi)茉诟痰姆跤龝r(shí)間內(nèi)進(jìn)行。此外，所述試驗(yàn)系統(tǒng)可以允許在不同的感染階段(例如活動(dòng)性TB感染、新近TB感染以及潛伏性TB感染)之間進(jìn)行區(qū)別對(duì)待。簡(jiǎn)而言之，能將本發(fā)明描述為一種免疫學(xué)方法，該方法包括孵育從具有至少一種抗原的哺乳動(dòng)物獲得的樣品的步驟，測(cè)定在所述樣品中的IP-10的水平以及將所述測(cè)定的IP-10的水平與參考水平進(jìn)行比較，從而確定所述哺乳動(dòng)物先前是否遇到過(guò)產(chǎn)生對(duì)該抗原的免疫學(xué)反應(yīng)性的所述抗原，或先前是否遇到過(guò)產(chǎn)生對(duì)該抗原的免疫學(xué)交叉反應(yīng)性的其它抗原。具體實(shí)施方式本發(fā)明提供了一種對(duì)受試者進(jìn)行CMI應(yīng)答的潛能和能力的分析。該分析是建立在測(cè)量由對(duì)抗原刺激做出應(yīng)答的免疫系統(tǒng)的細(xì)胞產(chǎn)生的免疫效應(yīng)物分子的基礎(chǔ)上的?？梢允褂门潴w，例如對(duì)效應(yīng)物有特異性的抗體而檢測(cè)到所述免疫效應(yīng)物，或者通過(guò)測(cè)量由基因編碼的該效應(yīng)物的表達(dá)水平來(lái)4企測(cè)到所述免疫效應(yīng)物。因此，本發(fā)明提供了用來(lái)測(cè)定受試者中CMI的應(yīng)答度的裝置，并且反過(guò)來(lái)，本發(fā)明提供一種用于診斷傳染性疾病、病理狀態(tài)、免疫活性水平以及T細(xì)胞對(duì)內(nèi)源抗原或外源抗原的應(yīng)答度的標(biāo)記物的裝置。本發(fā)明的一個(gè)方面涉及一種對(duì)受試者進(jìn)行IP-10應(yīng)答的潛能和能力的分析。該分析是建立在測(cè)量由對(duì)抗原刺激做出應(yīng)答的免疫系統(tǒng)的細(xì)胞產(chǎn)生的IP-10的基礎(chǔ)上的?？梢允褂门潴w，例如對(duì)IP-10有特異性的抗體檢測(cè)到所述IP-10的產(chǎn)生，或者通過(guò)測(cè)量由基因編碼的IP-10的表達(dá)水平來(lái)檢測(cè)該IP-10的原體的試驗(yàn)原則。在肺結(jié)核的病例中，基于結(jié)核分枝桿菌特異性刺激并且隨后進(jìn)行IP-10測(cè)定的試驗(yàn)?zāi)艽_認(rèn)感染有結(jié)核分枝桿菌的人。在衣原體的病例中，基于沙眼衣原體提取物刺激的試驗(yàn)?zāi)艽_認(rèn)感染有衣原體的人。所描述的試驗(yàn)系統(tǒng)對(duì)生物標(biāo)記物IP-10進(jìn)行了測(cè)量，所述IP-10的水平高于目前可用的分析所基于的標(biāo)記物-IFN-y的水平。這種基于IP-10的試驗(yàn)系統(tǒng)與基于例如IFN-Y作為效應(yīng)參數(shù)的試驗(yàn)具有相同的特異性并更靈敏，它改善了對(duì)無(wú)免疫應(yīng)答個(gè)體(實(shí)施例10)的試驗(yàn)和診斷，由于樣品能夠在孵育期間或者在分析之前進(jìn)行稀釋(實(shí)施例9和13)，該試驗(yàn)?zāi)苁褂幂^少量的血液。如實(shí)施例ll所示地，在數(shù)小時(shí)的孵育后能產(chǎn)生大量的IP-IO,因此它還提高了診斷的速度。在肺結(jié)核的病例中，試驗(yàn)系統(tǒng)可以允許在活動(dòng)性TB感染、新近TB感染以及潛伏性TB感染之間進(jìn)行區(qū)別對(duì)待，此外，該試驗(yàn)系統(tǒng)潛在地能確認(rèn)人們發(fā)展為活動(dòng)性TB的風(fēng)險(xiǎn)。所述試驗(yàn)系統(tǒng)基于使用免疫測(cè)定(即，ELISA或流式熒光技術(shù)(Luminex))對(duì)IP-IO的測(cè)定，并且該試驗(yàn)系統(tǒng)能潛在地開發(fā)為可用于低資源配制的場(chǎng)地友好的免疫色譜法(immunochromatographic)試驗(yàn)，其中，以棵眼可觀察到的顏色反應(yīng)來(lái)表示試驗(yàn)的結(jié)果。本發(fā)明所描述的分析解決了一系列的問(wèn)題。目前可利用的分析對(duì)非常低水平的效應(yīng)參數(shù)IFN-y進(jìn)行測(cè)量，該水平甚至接近最敏感的方法的極限(在肺結(jié)核病例的試驗(yàn)中，QuantiFERON試驗(yàn)對(duì)正檢驗(yàn)的截止點(diǎn)水平為0.35國(guó)際單位/ml(17.5pg/ml),并在T-SPOT.TB試驗(yàn)中為5點(diǎn)形成單位/場(chǎng))。為了增強(qiáng)靈敏度而降低截止點(diǎn)(cut-off)將最終導(dǎo)致?lián)p害試驗(yàn)的特異性?；赒uantiFERON試驗(yàn)的出版物表示了對(duì)人們進(jìn)行的具有較低范圍的IFN-Y的試驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)試驗(yàn)在截止點(diǎn)水平附近有不同，這強(qiáng)調(diào)了QuantiFERON(QFT)測(cè)試的假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果的潛在風(fēng)險(xiǎn)。此外，目前的試驗(yàn)可能對(duì)不能在截止點(diǎn)水平之上對(duì)IFN-Y做出應(yīng)答的免疫抑制個(gè)體給出假陰性的結(jié)果。由于進(jìn)行抗原刺激后IP-10釋放的量比IFN-Y要高得多，靈敏度更高了，更少的試驗(yàn)被認(rèn)為是假陰性，試驗(yàn)的結(jié)果重復(fù)性更好并對(duì)免疫抑制個(gè)體的不確定的測(cè)試結(jié)果也更少了。此外，由于抗體誘導(dǎo)的IP-10分泌的濃度如此高，因此能夠在孵育步驟之前或之后對(duì)樣品進(jìn)行稀釋。這意味著，能夠減少需要進(jìn)行試驗(yàn)的樣品材料(例如，全血)的量，例如說(shuō)，在全血的例子中，低至或者甚至正好或低于0.25ml，例如為0.20ml,舉例來(lái)說(shuō)為0.15ml，例如為0.1ml，舉例來(lái)說(shuō)為0.05ml。在優(yōu)選實(shí)施方式中，能夠在低至或者甚至低于0.1ml下進(jìn)行試驗(yàn)。因此，能開發(fā)適于具有低血容量的患者(例如，兒童/嬰兒或貧血者)的"迷你分析"。此外，通過(guò)使用例如來(lái)自例如針刺手指(finger-prick)的血液，所述迷你分析由于避免了血管穿刺而能變得更加使用者友好。進(jìn)一步地說(shuō)，在肺結(jié)核的病例中，目前可用的試^r中沒有能區(qū)別對(duì)待活動(dòng)性感染和潛伏感染。本發(fā)明的發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)在未刺激但孵育有樣品的材料，即，空白樣品(nilsample)(例如，全血)中IP-IO的濃度在具有活動(dòng)性疾病的患者中比具有潛伏性疾病的健康個(gè)體要高。本發(fā)明的發(fā)明人提出了能使用與抗原特異性試-驗(yàn)結(jié)合的孵育含有無(wú)活性溶液(空白)樣品材料中的IP-10的濃度來(lái)作為活動(dòng)性感染(例如，肺結(jié)核)對(duì)潛伏性感染(例如，肺結(jié)核)的標(biāo)記物。分析因此，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及免疫學(xué)方法，該方法包括以下步驟a)用至少一種受試抗原孵育從哺乳動(dòng)物獲得的樣品b)測(cè)定所述樣品中的IP-10的水平c)將所述測(cè)定的IP-10的水平與參考水平進(jìn)行比較，從而確定所述哺乳動(dòng)物先前是否遇到過(guò)產(chǎn)生對(duì)所述受試抗原的免疫學(xué)反應(yīng)性的所述受試抗原，或者先前是否遇到過(guò)產(chǎn)生對(duì)所述受試抗原的免疫學(xué)交叉反應(yīng)性的其它抗原。需要理解的是，本發(fā)明所描述的任意一種方法都是不依賴于平臺(tái)的(platformindependent)。因此，本發(fā)明可以使用任何一種免疫學(xué)方法，例如但L不局限于此的ELISA、Luminex、多元操作(Multiplex)、免疫印跡(Immunoblotting)、轉(zhuǎn)4失蛋白分析(TRF-assa夕s)、免疫色譜側(cè)流分析(immunochromatographiclateralflow)、酶才廣》曽免疫測(cè)定才支術(shù)(EnzymeMultipliedImmunoassayTechnique)、放射性過(guò)敏原吸附試驗(yàn)(RASTtest)、力文射性免疫檢定、免疫熒光以及各種免疫學(xué)干燥棒檢定(immunologicaldrystickassays)(例如,色譜棒試驗(yàn)(cromatographicsticktest))。在第二個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種用于診斷感染的方法，該方法包括以下步ii驟a)用至少一種受試抗原孵育從哺乳動(dòng)物獲得的樣品，在所述受試抗原不是PPD或LPS的條件下b)測(cè)定在所述樣品中的IP-10的水平c)將所述測(cè)定的IP-10的水平與參考水平進(jìn)行比4交，如果所測(cè)定的IP-10水平在所述參考水平之上，從而確定哺乳動(dòng)物是否感染了微生物本發(fā)明的發(fā)明人已證實(shí)的是，用所選擇的受試抗原或用于評(píng)價(jià)的抗原進(jìn)行的直接刺激足以獲得能使經(jīng)驗(yàn)豐富的人員推斷出樣品先前是否遇到過(guò)產(chǎn)生對(duì)所述受試抗原的免疫學(xué)反應(yīng)性的所述受試抗原，或者先前是否遇到過(guò)產(chǎn)生的對(duì)所選擇的受試抗原的免疫學(xué)交叉反應(yīng)性其它受試抗原的數(shù)值(readout)。因此，在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明還涉及一種如在此所描述的免疫學(xué)方法，其中，該方法排除了任何進(jìn)一步的刺激或隨后的刺激。隨后的刺激或進(jìn)一步的刺激可以覆蓋任何類型的刺激，例如用生物學(xué)非活性物質(zhì)或具有與炎癥應(yīng)答相關(guān)的生物學(xué)效應(yīng)來(lái)啟動(dòng)或刺激樣品，例如但不限于促細(xì)胞分裂原、細(xì)菌產(chǎn)物或生物活性蛋白。因此，在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種如在此所描述的免疫學(xué)方法，其中，該方法排除了任何用LPS進(jìn)行的進(jìn)一步的刺激或隨后的刺激。因此，所述方法能用于對(duì)例如具有患傳染病的高風(fēng)險(xiǎn)人群的感染的檢測(cè)，所述傳染病例如但不限于結(jié)核病、衣原體感染、利什曼蟲病、錐蟲病以及血吸蟲病。本發(fā)明還涉及一種根據(jù)本發(fā)明的方法，其中，所述樣品被分為至少兩個(gè)部分，并且a)用受試抗原孵育所述樣品的第一部分以產(chǎn)生應(yīng)答樣品b)用無(wú)活性溶液(inactivesolution)孵育所述樣品的第二部分以產(chǎn)生空白才羊品c)測(cè)定在所述兩部分中IP-10的水平d)通過(guò)將從所述應(yīng)答樣品中測(cè)定的IP-10中減去從所述空白樣品中測(cè)定的IP-10水平來(lái)確定樣品的抗原依賴IP-10應(yīng)答e)將所述受試抗原依賴IP-10應(yīng)答或由該應(yīng)答得到的數(shù)值與所述參考水12平或由該參考水平得到的數(shù)值進(jìn)行比較，從而確定所述哺乳動(dòng)物先前是否遇到過(guò)該受試抗原并因而產(chǎn)生對(duì)該受試抗原的免疫學(xué)反應(yīng)性，或者先前是否遇到過(guò)其它抗原產(chǎn)生對(duì)該受試抗原的免疫學(xué)交叉反應(yīng)性和/或?qū)l(fā)展為感染。在一種實(shí)施方式中，能夠通過(guò)伴隨用于評(píng)價(jià)的所選擇的抗原一起加入的免疫刺激分子(immunostimulatorymolecule)而增強(qiáng)分才斤性能，所述免疫刺;敫分子為選自由白細(xì)胞介素-2(IL-2)、白細(xì)胞介素-12(IL-12)、腫瘤壞死因子-a(TNF-a)和免疫反應(yīng)性纖維結(jié)合素-y(IFN-y)所組成的非限定性組的細(xì)胞因子。在另一種實(shí)施方式中，所述免疫刺激分子為可溶性受體(例如，B7分子的二聚體或多聚體(CD80/CD86))或抗體(例如，結(jié)合CD28的抗體)在另一種實(shí)施方式中，所述免疫刺激分子具有向T細(xì)胞提供協(xié)同刺激信號(hào)(本領(lǐng)域技術(shù)人員已知為信號(hào)2)的性質(zhì)，所述協(xié)同刺激信號(hào)不能單獨(dú)誘導(dǎo)IP-10應(yīng)答，但如果細(xì)胞對(duì)選擇用于評(píng)價(jià)的抗原產(chǎn)生CMI應(yīng)答，該協(xié)同刺激信號(hào)將增強(qiáng)IP-10應(yīng)答。在另一種實(shí)施方式中，能夠通過(guò)對(duì)在孵育步驟中發(fā)生的抗炎過(guò)程的抑制來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)分析的增強(qiáng)。在一種實(shí)施方式中，能用抑制性抗體或可溶性受體來(lái)增強(qiáng)分析，所述抑制性抗體或可溶性受體連接有例如但不限于白細(xì)胞介素4(IL-4)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-卩(TGF-卩)的抗炎介導(dǎo)。在另一種實(shí)施方式中，可以由抗炎介導(dǎo)的抑制通過(guò)抑制或消除細(xì)胞群體用作為對(duì)CMI應(yīng)答的抑制劑，例如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，來(lái)對(duì)分析進(jìn)行增強(qiáng)。具體地，當(dāng)術(shù)語(yǔ)純蛋白4汙生物(PurifiedProteinDerivative)(PPD或結(jié)核菌素)使用于此時(shí)，它指非種特異性分子。通過(guò)對(duì)來(lái)自結(jié)核分技桿菌或例如鳥分枝桿菌(M.avium)的其它分枝桿菌的混合物的蛋白質(zhì)進(jìn)行抽提而獲得PPD或結(jié)核菌素。PPD通常使用于對(duì)細(xì)胞免疫或?qū)CG或結(jié)核分枝桿菌所產(chǎn)生的Thl應(yīng)答的存在所進(jìn)行的試驗(yàn)。例如說(shuō)，它可以從由康諾特公司(ConnaughtLaboratoriesLimited)/人大母料(largeMasterBatch)，康諾特結(jié)核菌素(CT68)中制備的結(jié)核菌素純化蛋白衍生物B(Tuberso舊)得到，或者以從國(guó)家血清研究中心(StatensSerumInstitute,SSI，哥本哈根，丹麥)所得到的RT23的形式。ESAT-6蛋白(早期分泌性抗原靶6)是從結(jié)核分枝桿菌短期培養(yǎng)濾液中提純的主要的分泌抗原。當(dāng)使用于此時(shí)，ESAT-6、CFP-10(培養(yǎng)濾液蛋白10)和85B可以從細(xì)胞裂解液和提純通過(guò)重組技術(shù)或作為合成肽和生產(chǎn)而獲得。例如說(shuō)，ESAT可以從國(guó)家血清研究中心作為重組蛋白而獲得。結(jié)核菌素或PPD(純蛋白衍生物)與ESAT-6(早期分泌性抗原靶6)、CFP-10(培養(yǎng)濾液蛋白10)和TB7.7不同，所述ESAT-6、CFP-10和TB7.7僅由位于所述結(jié)核分枝桿菌基因組內(nèi)的基因(在RD-1區(qū)域)進(jìn)行編碼，并且它們不包含在卡介苗(theBacilleofCalmetteetGu6rin,BCG)。結(jié)核菌素或PPD(純蛋白衍生物)與PPD不同，這是因?yàn)镻PD也含有與例如卡介苗亞林以及多種具有低的致病性或沒有致病性的非結(jié)核分枝桿菌種共有的其它抗原。任選地，該方法可以進(jìn)一步包括將所述樣品分成三部分，并將該樣品的第三部分用T細(xì)胞活化劑進(jìn)行孵育以產(chǎn)生陽(yáng)性對(duì)照。在此，免疫細(xì)胞可以在例如三個(gè)分離的群空白對(duì)照(例如，生理鹽水)、抗原刺激(例如，衣原體或肺結(jié)核特異性蛋白或其衍生物)以及陽(yáng)性對(duì)照(例如，植物凝集素)中進(jìn)行孵育。免疫細(xì)胞的形式可以為全血、稀釋的全血或細(xì)胞群的各種提純物，例如外周血單個(gè)核細(xì)胞、單核細(xì)胞或T細(xì)胞。所述細(xì)胞可以從血液、尿液、胸液(pleuralfluid)、支氣管液(bronchialfluid)、》軟口水(oralwashing)、纟且織活4企(tissuebiopsy)、腹K(ascites)、腺(pus)、月鹵骨逸液(cerebrospinalfluid)、才由吸4勿(aspirate)和/或?yàn)V泡液而獲得。對(duì)免疫細(xì)胞進(jìn)行孵育，例如在37。C下孵育4-24小時(shí)。在一種實(shí)施方式中，所述樣品被分為至少兩個(gè)部分，并且a)用抗原孵育所述樣品的第一部分以產(chǎn)生應(yīng)答樣品b)用無(wú)活性溶液孵育所述樣品的第二部分以產(chǎn)生空白樣品c)測(cè)定在所述兩部分中IP-10的水平d)通過(guò)將從所述應(yīng)答樣品中測(cè)定的IP-10中減去從所述空白樣品中測(cè)定的IP-10水平來(lái)確定樣品的抗原依賴IP-10應(yīng)答e)將所述抗原依賴IP-10應(yīng)答或由該應(yīng)答得到的數(shù)值與所述參考水平或由該參考水平得到的數(shù)值進(jìn)行比較，f)將所述抗原自發(fā)性IP-10應(yīng)答或由該應(yīng)答得到的數(shù)值與所述參考水平或由該參考水平得到的數(shù)值進(jìn)行比較，從而確定所述哺乳動(dòng)物先前是否遇到過(guò)該抗原并因而產(chǎn)生對(duì)該抗原的免疫學(xué)反應(yīng)性，或者先前是否遇到過(guò)產(chǎn)生對(duì)該抗原的免疫學(xué)交叉反應(yīng)性的其它抗原，并且如果哺乳動(dòng)物對(duì)該治療應(yīng)答則由此確定是否該哺乳動(dòng)物具有活動(dòng)性感染、近期感染或潛伏性感染，或者是否會(huì)發(fā)展為感染。更具體地說(shuō)，所述樣品被分為至少3個(gè)部分，并且a)用抗原孵育所述樣品的第一部分以產(chǎn)生應(yīng)答樣品b)用無(wú)活性溶液孵育所述樣品的第二部分以產(chǎn)生空白樣品c)用刺激性溶液(例如，植物凝集素(PHA))孵育所述樣品的第三部分以產(chǎn)生促細(xì)胞分裂原樣品c)測(cè)定在所述三部分中的IP-10的水平d)通過(guò)將從所述應(yīng)答樣品中測(cè)定的IP-10中減去從所述空白樣品中測(cè)定的IP-10水平來(lái)確定樣品的抗原依賴IP-10應(yīng)答e)將所述抗原依賴IP-10應(yīng)答或由該應(yīng)答得到的數(shù)值與所述參考水平或由該參考水平得到的數(shù)值進(jìn)行比較，f)通過(guò)將從所述促細(xì)胞分裂原樣品中測(cè)定的IP-10中減去從所述空白樣品中測(cè)定的IP-10水平來(lái)確定樣品的促細(xì)胞分裂原依賴IP-10應(yīng)答g)將所述細(xì)胞分裂原樣依賴IP-10應(yīng)答或由該應(yīng)答得到的數(shù)值與所述參考水平或由該參考水平得到的數(shù)值進(jìn)行比較，h)將抗原自發(fā)性IP-10應(yīng)答或由該應(yīng)答得到的數(shù)值與所述參考水平或由該參考水平得到的數(shù)值進(jìn)行比較，從而確定哺乳動(dòng)物先前是否遇到過(guò)該抗原并因而產(chǎn)生對(duì)該抗原的免疫學(xué)反應(yīng)性，或者先前是否遇到過(guò)產(chǎn)生對(duì)該抗原的免疫學(xué)交叉反應(yīng)性的其它抗原，并且由此確定該哺乳動(dòng)物是否具有活動(dòng)性感染、近期感染或潛伏性感染，或者如果哺乳動(dòng)物對(duì)該治療進(jìn)行應(yīng)答則確定該哺乳動(dòng)物是否會(huì)發(fā)展為感染，或是否為免疫抑制。術(shù)語(yǔ)"促細(xì)胞分裂原"指的是促進(jìn)細(xì)胞分裂的任何化學(xué)制品或化學(xué)成分。促細(xì)胞分裂原可以分別或同時(shí)地作用于T細(xì)胞和B細(xì)胞。因此，術(shù)語(yǔ)促細(xì)胞分裂原覆蓋了T細(xì)胞活化劑和B細(xì)胞活化劑，并因此可替換地使用于此。152本發(fā)明的促細(xì)胞分裂原覆蓋了本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的所有的促細(xì)胞分裂原，例如但不局限于植物凝集素(PHA)、伴刀豆球蛋白A(conA)、脂多糖(LPS)以及美洲商陸有絲分裂原(pokeweedmitogen,PWM)。在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式中，所述促細(xì)胞分裂原為T細(xì)胞活化劑，并且該促細(xì)胞分裂原更優(yōu)選為PHA。在本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式中，所述促細(xì)胞分裂原為單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞活化劑。然后通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的細(xì)胞因子或趨化因子檢測(cè)方法來(lái)測(cè)定IP-10的產(chǎn)生，所述方法例如但不限于基于抗體的技術(shù)(antibody-basedtechnologies),舉例來(lái)說(shuō)，多指標(biāo)同步分析(xMAP)、多路技術(shù)(multiplexing)、Luminex、ELISA、酶耳關(guān)免疫斑點(diǎn)(ELISPOT)、側(cè)流才奉分4斤(lateralstickassay)或者基于信使RNA(mRNA)技術(shù)，例如實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Realtimepolymerasechainreaction,RT-PCR)或月包內(nèi)流式細(xì)月包術(shù)4企觀'J(Intracellularflowcytometri,IC國(guó)FACS)。對(duì)抗原(例如，衣原體提取抗原或肺結(jié)核特異性蛋白或其衍生物)進(jìn)行響應(yīng)的IP-10的數(shù)量可以通過(guò)減去產(chǎn)生的IP-10的基數(shù)來(lái)確定，并且基于該抗原特異性的IP-10應(yīng)答來(lái)說(shuō)明感染例如結(jié)核分枝桿菌的可能。本申請(qǐng)中的肺結(jié)核的數(shù)據(jù)是通過(guò)使用現(xiàn)有的技術(shù)QuantiFERONTB-GoldIn—Tube試驗(yàn)(Cellestis，Carnegie，Australia)而建立的，其中，全血直接被抽到預(yù)涂敷有生理鹽水(空白)、TB特異性肽抗原(抗原(Ag))或促細(xì)胞分裂原(PHA)中的一種的真空采血管(vacutainertube)內(nèi)。該采血管在本優(yōu)選實(shí)施方式中在37°C下孵育18小時(shí)，其中通過(guò)xMAP技術(shù)在Luminex平臺(tái)(盧米尼克斯公司，美國(guó)(LuminexCorporation,USA))上測(cè)量到細(xì)胞因子的濃度后使用碧歐泉試劑(Biosourcereagents)(碧歐泉，卡瑪利洛，美國(guó)(BiosourceCamarillo,USA))，并因此能夠?qū)⑿?yīng)參數(shù)從傳統(tǒng)的參數(shù)IFN-y轉(zhuǎn)化為在更高的濃度下表達(dá)，并具有更好效果的IP-IO。本發(fā)明的高靈敏度使得該方法成為優(yōu)秀的用來(lái)區(qū)分活動(dòng)性感染、潛伏性感染、近期感染、兒童/新生兒感染和/或長(zhǎng)期潛伏性感染的工具。因此，在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種方法，其中，具有空白的在參考水平之上的抗原依賴IP-10應(yīng)答表示該哺乳動(dòng)物具有活動(dòng)性感染、潛伏性感染、近期感染和/或長(zhǎng)期潛伏性感染。在另一種實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種方法，其中試驗(yàn)中所用的樣品材料(例如，全血)的量減少了。在使用全血的情況下，使用范圍降低到3-0.1ml，并且在使用外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)的情況下，細(xì)胞數(shù)的范圍為lx106-0.05xio6。由于不需要對(duì)供體的血液動(dòng)力學(xué)結(jié)果(haemodynamicconsequence),或者對(duì)非常少量的樣品材料(例如從脊髓液、胸液或臍帶血獲得的細(xì)胞)進(jìn)行分析，這種適合于具有低血容量的病人(特別是兒童/因而或貧血患者)的"迷你分析"是具有創(chuàng)新意義的。與其它標(biāo)記物的結(jié)合對(duì)與一種或多種下述的標(biāo)記物結(jié)合的IP-10的測(cè)量可能減少假陽(yáng)性的數(shù)量，并提高進(jìn)行區(qū)分的能力。因此，在一種實(shí)施方式中，該方法還包括a)確定對(duì)抗原刺激進(jìn)行應(yīng)答的IP-10和單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)水平，b)將所確定的IP-10和MCP-1的水平結(jié)合，并且c)將所述結(jié)合的水平與結(jié)合的參考水平進(jìn)行比較。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的，所述結(jié)合的參考水平是通過(guò)測(cè)量健康人群中的IP-10水平和任何一種建議的組合標(biāo)記物(例如但不限于MCP-1)水平，并將所測(cè)定的IP-10和MCP-1水平通過(guò)計(jì)算(例如當(dāng)不限于加法)而進(jìn)行結(jié)合。根據(jù)所結(jié)合的參考水平的分布來(lái)選擇的截止點(diǎn)上測(cè)定所結(jié)合的參考水平，例如健康人群平均數(shù)上+2標(biāo)準(zhǔn)偏差或者通過(guò)其它本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法。其它可組合的標(biāo)記物包括IL-2和INF-y。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明公開了一種方法，該方法還包括a)測(cè)定對(duì)抗原刺激的進(jìn)行應(yīng)答的INF-y和任選的MCP-1和/或IL-2的水平，b)結(jié)合所測(cè)定的IP-10和INF-y以及任選的MCP-1和/或IL-2的水平，以及c)將所結(jié)合的水平與所結(jié)合的參考水平進(jìn)行比較。在一種實(shí)施方式中，該方法包括a)測(cè)定對(duì)抗原刺激進(jìn)行應(yīng)答的IP-10的水平，b)將IP-10的水平與參考水平或由其得到的數(shù)值進(jìn)行比較，c)確定所述哺乳動(dòng)物先前是否遇到過(guò)所述抗原，并因此產(chǎn)生對(duì)該抗原的IP-10反應(yīng)性d)測(cè)定對(duì)抗原刺激應(yīng)答的MCP-1的水平e)將MCP-1水平與參考水平或由其得到的數(shù)值進(jìn)行比較f)確定所述哺乳動(dòng)物先前是否遇到過(guò)所述抗原，并因此產(chǎn)生對(duì)該抗原的MCP-1反應(yīng)性g)結(jié)合所測(cè)定的IP-10反應(yīng)性和MCP-1反應(yīng)性從而確定該哺乳動(dòng)物先前是否遇到過(guò)該抗原，并因此產(chǎn)生了具有至少一種生物標(biāo)記物的對(duì)該抗原的免疫學(xué)反應(yīng)性。在一種實(shí)施方式中，該方法包括a)測(cè)定對(duì)抗原刺激進(jìn)行應(yīng)答的IP-10的水平，b)將IP-10的水平與參考水平或由其得到的數(shù)值進(jìn)行比較，c)確定所述哺乳動(dòng)物先前是否遇到過(guò)所述抗原，并因此產(chǎn)生對(duì)該抗原的IP-10反應(yīng)性d)測(cè)定對(duì)抗原刺激應(yīng)答的IL-2的水平e)將IL-2水平與參考水平或由其得到的數(shù)值進(jìn)行比較f)確定所述哺乳動(dòng)物先前是否遇到過(guò)所述抗原，并因此產(chǎn)生對(duì)該抗原的IL-2反應(yīng)性g)結(jié)合所測(cè)定的IP-10反應(yīng)性和IL-2反應(yīng)性從而確定該哺乳動(dòng)物先前是否遇到過(guò)該抗原，并因此產(chǎn)生了具有至少一種生物標(biāo)記物的對(duì)該抗原的免疫學(xué)反應(yīng)性。在一種實(shí)施方式中，該方法包括，a)測(cè)定對(duì)抗原刺激進(jìn)行應(yīng)答的IP-10的水平，b)將IP-10的水平與參考水平或由其得到的數(shù)值進(jìn)行比較，c)確定所述哺乳動(dòng)物先前是否遇到過(guò)所述抗原，并因此產(chǎn)生對(duì)該抗原的IP-10反應(yīng)性d)測(cè)定對(duì)抗原刺激進(jìn)行應(yīng)答的INF-y的水平e)將INF-Y水平與參考水平或由其得到的數(shù)值進(jìn)行比較f)確定所述哺乳動(dòng)物先前是否遇到過(guò)所述抗原，并因此產(chǎn)生對(duì)該抗原的INF-Y反應(yīng)性g)結(jié)合所測(cè)定的IP-10反應(yīng)性和INF-Y反應(yīng)性從而確定該哺乳動(dòng)物先前是否遇到過(guò)該抗原，并因此產(chǎn)生了具有至少一種生物標(biāo)記物的對(duì)該抗原的免疫學(xué)反應(yīng)性。在一種實(shí)施方式中，該方法包括，a)測(cè)定對(duì)抗原刺激進(jìn)行應(yīng)答的IP-10的水平，b)將IP-IO的水平與參考水平或由其得到的數(shù)值進(jìn)行比較，c)確定所述哺乳動(dòng)物先前是否遇到過(guò)所述抗原，并因此產(chǎn)生對(duì)該抗原的IP-10反應(yīng)性d)測(cè)定對(duì)抗原刺激進(jìn)行應(yīng)答的INF-y和/或MCP-1和/或IL-2的水平e)將INF-y和/或MCP-1和/或IL-2水平與參考水平或由其得到的數(shù)值進(jìn)行比較f)確定所述哺乳動(dòng)物先前是否遇到過(guò)所述抗原，并因此產(chǎn)生對(duì)該抗原的INF-y和/或MCP-1和/或IL-2反應(yīng)性g)結(jié)合所測(cè)定的IP-10反應(yīng)性和/或INF-y和/或MCP-1和/或IL-2反應(yīng)性從而確定該哺乳動(dòng)物先前是否遇到過(guò)該抗原，并因此產(chǎn)生了具有至少一種生物標(biāo)記物的對(duì)該抗原的免疫學(xué)反應(yīng)性。診斷在一種實(shí)施方式中，如以上所描述的，IP-10可以用于對(duì)被懷疑有各種免疫狀態(tài)(例如感染)的受試者的診斷。當(dāng)用于診斷時(shí)，根據(jù)本發(fā)明的方法可以幫助確定例如感染的免疫狀態(tài)的存在，這經(jīng)常通過(guò)評(píng)價(jià)臨床癥狀和進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)來(lái)完成。該試驗(yàn)可以診斷感染的各種階段，例如在沒有任何癥狀的個(gè)體中新近受到的感染、在沒有表現(xiàn)這種感染癥狀的個(gè)體上發(fā)作的多年前所受到的感染、患者具有感染癥狀的活動(dòng)性感染。在另一種實(shí)施方式中，IP-10可以用于對(duì)疑似肺結(jié)核(例如，活動(dòng)性TB感染、潛伏性TB感染或新近TB感染)的受試者的診斷，并且特別用于那些具有從潛伏性發(fā)展為活動(dòng)性肺結(jié)核的增加的風(fēng)險(xiǎn)的患者，即，接受免疫抑制藥物治療的患者(即，單克隆抗體治療(monoclonalantibodytreatment)(抗CD20抗體(例如，美羅華(Rituximab))或TNF-a阻斷治療(TNF-ablockingtreatment)(例如，類克(Remicade)、恩利(Enbrel)、阿達(dá)木單抗(Humira)))),或者接受類固醇或腫瘤化療的患者；或者那些忍受免疫抑制狀況的患者(例如HIV感染、癌癥、胰島素依賴型糖尿病(IDDM)或非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM)、自身免疫性狀況(autoimmunecondition)、營(yíng)養(yǎng)不良、老齡、靜脈吸毒(intravenousdruguse,IVDU)或遺傳性免疫失調(diào))，以及那些近期感染的個(gè)體。實(shí)際上，下面的標(biāo)準(zhǔn)指導(dǎo)應(yīng)該在進(jìn)行藥物治療前將這些患者篩選為活動(dòng)性TB感染、潛伏性TB感染或新近TB感染。目前，強(qiáng)烈推薦的是對(duì)那些參加TNF-a阻斷治療或的患者，或者那些對(duì)結(jié)核菌素皮內(nèi)試驗(yàn)(TST)或結(jié)核分枝桿菌抗原特異性IFN-y試驗(yàn)表現(xiàn)HIV陽(yáng)性的患者進(jìn)行篩選。研究表明，這些試驗(yàn)可能對(duì)上述提及的這類病人而言并不可靠，而IP-IO由于具有更高的靈敏度而是更好的選擇。在另一種實(shí)施方式中，IP-10可以用于篩選疑似感染衣原體的患者(例如，泌尿生殖器感染(urogenitalinfection)、盆腔炎和/或眼睛的感染)。本發(fā)明允許結(jié)合來(lái)自各種傳染原的抗原，這些傳染原能在同一個(gè)器官或解剖部位上繁殖，或者產(chǎn)生相同族的癥狀。通過(guò)結(jié)合不同特異性的抗原，能夠?qū)哂酗L(fēng)險(xiǎn)的患者進(jìn)行篩選，或排除那些會(huì)產(chǎn)生不能進(jìn)行區(qū)分的臨床狀況的普通病原體，例如泌尿生殖器感染；或者對(duì)那些對(duì)相同治療壽文感，例如，抗生素，的患者進(jìn)行篩選。因此，在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種用于同時(shí)對(duì)至少兩種感染進(jìn)行篩選的方法，該方法包括-a)從需要的患者獲得一個(gè)樣品，并將所述樣品分成至少兩個(gè)部分，b)用抗原刺激一個(gè)部分，其中所述抗原與選擇用于評(píng)價(jià)的特異性感染原(specificinfectiousagent)相關(guān)(應(yīng)答部分)，用無(wú)活性溶液將育所述樣品的第二部分(空白部分)c)測(cè)量在所述兩部分中的IP-10水平d)通過(guò)將從所述應(yīng)答部分中測(cè)定的IP-10中減去從所述空白部分中測(cè)定的IP-10水平來(lái)確定樣品的抗原依賴IP-10應(yīng)答e)將所述測(cè)定的抗原依賴IP-10水平與對(duì)所選擇的感染原中的至少一種20的參考水平進(jìn)行比較，以及f)如果抗原依賴IP-10水平高于參考部分中的IP-10水平，則認(rèn)為所述需要的患者感染了所選擇的感染原中的至少一種。因此，本發(fā)明的方法可以應(yīng)用于篩選具有感染疾病高風(fēng)險(xiǎn)的人們，例如在疾病i也區(qū)(diseaseendemicarea)4亭留或》良4亍的人。因此，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述傳染病選自由癡疾、結(jié)核病、腦膜炎、乙型腦炎、霍亂、利什曼原蟲病(leishmanina)、登革熱以及脊髓灰質(zhì)炎所組成的組中。在本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，所述傳染病選自包括軟性下疳(chancroid)、衣原體感染、淋病、性病淋巴肉芽腫(Lymphogranulomavenereum)、解脈脈原體(Ureaplasmaurealyticum)、人型支原體(Mycoplasmahominis)、梅毒螺旋體(Treponemapallidum)、乙型肝炎(HepatitisB)、單純皰療病毒(Herpessimplexvirus)、人類免疫缺陷病毒(HumanImmunodeficiencyVirus)、人乳頭狀瘤病毒(Humanpapillomavirus)、軟疾(Molluscum)、陰虱(Phthiriuspubis)、濟(jì)螨(Sarcoptesscabiei)和陰道毛滴蟲(Trichomonasvaginalis)的性傳播疾病。在本發(fā)明的又一種實(shí)施方式中，所述傳染病選自由可治療胃腸傳染原所組成的組，例如，志賀氏桿菌、大腸桿菌、弧形桿菌(Campylobacter)、霍亂弧菌(Vibriocholeraebacteria)、樣i小隱孑包子蟲(Cryptosporidiumparvum)、沙'門氏菌(Salmonellabacteria)以及傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphibacteria)。在本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，所述傳染病選自由抗生素不能治療的胃腸傳染原所組成的組，例如，輪狀病毒(rotaviruses)、諾沃克樣病毒(noroviruses)、腺病毒(adenoviruses)、扎愰病毒(sapoviruses)和星形病毒(astrovirus.es)。在本發(fā)明的更進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述傳染病選自由以下的例如在血庫(kù)中的要進(jìn)行顯影的血液病所組成的組曱型肝炎、戊型肝炎、疸疾(Malaria)、恰加斯病(ChagasDisease)、巴貝斯蟲病(Babesiosis)、利什曼病(Leishmaniasis)、猴泡沫病毒(Simianfoamyvims)、變異型克-雅氏病(Creutzfelt-JacobDisease,vCJD)、克-雅氏病(Creutzfeldt-JakobDisease，CJD)、巨細(xì)胞病毒(Cytomegalovirus,CMV)以及愛潑斯坦-巴爾病(Epstein-BarrVirus)。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述傳染病選自由能引發(fā)細(xì)菌性腦膜炎、腦膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitides)、肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)、單核纟田月包李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、銅綠有I單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、無(wú)乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)和;危感嗜血4干菌(Haemophilusinfluenza)的纟田菌所組成的組。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于做出種特異性診斷，這是因?yàn)樘禺愋钥乖倪x擇使得本領(lǐng)域技術(shù)人員對(duì)例如分枝桿菌屬的不同種進(jìn)行區(qū)分。預(yù)后(Prognosis)在一種實(shí)施方式中，IP-10可以用來(lái)預(yù)測(cè)診斷有例如感染的各種免疫狀態(tài)的受試者的預(yù)后。當(dāng)用于患者預(yù)后時(shí)，根據(jù)本發(fā)明的方法能幫助預(yù)測(cè)例如感染的免疫學(xué)狀態(tài)的過(guò)程以及可能的結(jié)果，從而協(xié)助本領(lǐng)域技術(shù)人員選擇合適的治療方法并預(yù)測(cè)用于該狀況的特定治療的效果。監(jiān)測(cè)在一種實(shí)施方式中，IP-10可以用來(lái)對(duì)診斷有感染的受試者進(jìn)行監(jiān)測(cè)。當(dāng)用于患者監(jiān)測(cè)時(shí)，才艮據(jù)本發(fā)明的方法能幫助評(píng)估在治療過(guò)程中或在治療終止后的功效，例如監(jiān)測(cè)并預(yù)測(cè)感染復(fù)發(fā)的可能。通過(guò)本發(fā)明的方法來(lái)監(jiān)測(cè)治療的功效的可能性是特別具有實(shí)質(zhì)性的，這是因?yàn)?以結(jié)核分枝桿菌為例)a)通過(guò)簡(jiǎn)單的抽血代替了目前可用的方法，例如痰液顯微鏡方法、結(jié)核菌培養(yǎng)、X射線或其它方法，而方便地進(jìn)行該方法，b)與痰液顯纟效鏡方法、結(jié)核菌培養(yǎng)、X射線或其它方法相比，本發(fā)明的方法具有更好的重復(fù)性c)與痰液顯樣t鏡方法、結(jié)核菌培養(yǎng)、X射線或其它方法、本發(fā)明的方法廉價(jià)，例如說(shuō)，如果患者為疑似肺外結(jié)核，在活組織檢查需要進(jìn)行侵入性外科手術(shù)操作，或者如果患者為痰菌陰性，在支氣管鎮(zhèn);;險(xiǎn)查法中(broncosc叩y)需要進(jìn)行侵入性外科手術(shù)4喿作。d)與基于RD1重疊肽的對(duì)肺結(jié)核的IFN-y分析相比，本發(fā)明的方法更靈22敏e)本發(fā)明的方法能在活動(dòng)性肺結(jié)核和潛伏性肺結(jié)核之間進(jìn)行區(qū)分，而其噶的免疫分析僅能區(qū)分感染或未感染。篩選(Screening)在一種實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的方法用于篩選目的。即，使用本方法對(duì)事先未進(jìn)行感染診斷的受試者通過(guò)測(cè)量IP-IO的水平來(lái)進(jìn)行評(píng)估，并使所測(cè)得的水平與預(yù)先指定(pre-specified)水平相互關(guān)聯(lián)，來(lái)說(shuō)明各種感染(例如結(jié)核分枝桿菌感染)的存在或不存在。在另一種實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的方法用于篩選目的。即，使用本方法對(duì)事先未進(jìn)行感染診斷的但是具有潛伏性疾病復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的受試者通過(guò)測(cè)量IP-IO的水平來(lái)進(jìn)行評(píng)估，根據(jù)預(yù)先指定水平來(lái)說(shuō)明本發(fā)明，并將所測(cè)得的水平與各種感染(例如結(jié)核分枝桿菌感染)的存在或不存在進(jìn)行關(guān)聯(lián)。如先前所描述地，本發(fā)明的方法公開了一種用來(lái)同時(shí)對(duì)至少兩種傳染病進(jìn)行篩選的方法。在本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，該方法可以用來(lái)對(duì)自獻(xiàn)血者的血液進(jìn)行各種疾病例如但不限于由寄生蟲或病毒引發(fā)的感染進(jìn)行篩選。4妻觸者追^宗(Contacttracing)在優(yōu)選的實(shí)施方式中，IP-10可以用于對(duì)暴露于各種感染，例如結(jié)核分枝桿菌的受試者的診斷。當(dāng)用于接觸者追蹤時(shí)，根據(jù)本發(fā)明的方法能幫助確定感染的存在，例如結(jié)核分枝桿菌感染。在其它的實(shí)施方式中，IP-10可以在爆發(fā)高傳染性感染時(shí)用于對(duì)暴露于傳染性情況下的受試者進(jìn)行診斷，例如但不限于肺結(jié)核、冠狀病毒(例如嚴(yán)重獲得性呼吸道綜合癥(SevereAcquiredRespiratorySyndrome))、流4亍性感冒(Influenza)、^矣十專4立病毒(Ebolavirus)或馬爾堡病毒(Marburgvims)。在月申結(jié)核病例中，當(dāng)用于接觸者追蹤時(shí)，4艮據(jù)本發(fā)明的方法可以幫助確定感染的存在，這一般通過(guò)評(píng)價(jià)TST或目前可用的IFN-Y釋放分析來(lái)完成。增力口的4企出病例(casefinding)在優(yōu)選的實(shí)施方式中，IP-10可以用于對(duì)各種疾病，例如感染的診斷。當(dāng)用于增加;險(xiǎn)出病例時(shí)，根據(jù)本發(fā)明的方法可以幫助確定感染，例如但不限于顯微鏡方法，由于缺少感染的微生物學(xué)跡象，難以診斷出陰性TB,然而這種微生物學(xué)跡象經(jīng)常是通過(guò)對(duì)臨床癥狀、對(duì)治療的應(yīng)答來(lái)完成，并且缺少用來(lái)替代的it斷或通過(guò)肆毛時(shí)的分^斤(數(shù)周)，例如痰培養(yǎng)(sputumculture)。流行調(diào)查(Prevalencestudy)在優(yōu)選的實(shí)施方式中，IP-10可以用于研究各種免疫學(xué)狀態(tài)的流行程度，例如但不限于在受試者人群中的感染，例如兒童、HIV陽(yáng)性移民、難民、醫(yī)護(hù)人員、學(xué)齡兒童、囚犯、實(shí)驗(yàn)人員。當(dāng)用于流行調(diào)查時(shí)，根據(jù)本發(fā)明的方法能夠幫助確定感染的存在，例如在受試者人群中的潛伏性TB或活動(dòng)性TB,這經(jīng)常通過(guò)TST來(lái)完成。研究目的在一種實(shí)施方式中，當(dāng)對(duì)潛在的新抗原進(jìn)行篩選時(shí)，研究機(jī)構(gòu)可以利用IP-10,所述新抗原來(lái)源于選自由分枝桿菌(Mycobacteria)、革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌、李斯特菌(Listeria)、腸球菌(enterococci)、奈瑟菌(Neisseria)、弧菌(vibrio)、密螺旋體(treponema(梅毒(Syphilis))、包柔氏螺旋體菌(Borrelia)、細(xì)螺S走體(leptospirae)、衣原體(Clamydia)、逆轉(zhuǎn)錄病毒(f吳免疫缺陷病毒(SIV)、HIV-1和fflV-2)、冠狀病毒例如嚴(yán)重獲得性呼吸道綜合癥(SARS)和NL-63、巨細(xì)胞病毒、輪狀病毒、變形肺病毒(metapneumovirus)、呼吸道合月包病毒(respiratorysyncytiumvirus,RSV)、癥病毒(poxviruses)、艾伯斯坦-巴爾病毒(Ebsteinbarrvirus)、腸道病毒、麻滲病毒(morbillivirus)、4干病毒(rhabdoviruses(狂犬病))、風(fēng)滲病毒(Rubivims(風(fēng)滲(rubella)))、黃病毒(flaviviruses(登革熱、黃熱病))、皰滲病毒、帶狀皰疹病毒(varicellea-zostervirus)、丙型肝炎和乙型肝炎、利4十曼蟲(Leishmania)、弓開j蟲(Toxoplasmagondii)、4,蟲(trypanosoma)、癡原蟲(Plasmodium(惡寸生癡原蟲(falciparum)、間日瘧原蟲(vivax)、卵形疾原蟲(ovale)、癡疾)、卡氏肺嚢蟲(Pneumocystiscariini,PCP)以及各種的線蟲、吸蟲所組成的組的微生物，這些抗體可以為例如脂類、多糖分子、蛋白質(zhì)和肽。當(dāng)用作實(shí)驗(yàn)室研究目的時(shí)，根據(jù)本發(fā)明的方法能夠幫助確認(rèn)對(duì)所檢測(cè)的用于開發(fā)疫苗和診斷試驗(yàn)的抗原、蛋白質(zhì)或肽的免疫反應(yīng)性。許多抗原分子，例如說(shuō)肽，被確認(rèn)為種特異性或疾病特異性，但是由于缺少靈敏的標(biāo)記物，難以測(cè)定它們?cè)隗w外誘導(dǎo)T細(xì)胞的能力。在用這種候選抗原刺激后，測(cè)得的IP-10能用于篩選并確認(rèn)潛在的受試者新抗原或分子。特別是在抗原是從結(jié)核分枝桿菌、沙眼衣原體、HIV-1或丙型肝炎病毒(HCV)中獲得的情況下；研究機(jī)構(gòu)在試驗(yàn)這些抗原的免疫原性時(shí)可以使用IP-10,即，作為對(duì)T細(xì)胞的反應(yīng)性的測(cè)量用于例如疫苗的開發(fā)。治療效果本發(fā)明的發(fā)明人提出，在治療過(guò)程中，重復(fù)試驗(yàn)孵育過(guò)程中(空白樣品)的自發(fā)釋放，并且抗原誘導(dǎo)的IP-10(抗原樣品)能夠用作治療效果的標(biāo)記物。如果自發(fā)的IP-10應(yīng)答在治療過(guò)程中下降，可以認(rèn)為該治療是成功的，相反，如果沒有觀察到降低，則必然想到治療失敗。本發(fā)明的發(fā)明人提出，自發(fā)性的重復(fù)試驗(yàn)以及在例如TB治療過(guò)程中的抗原誘導(dǎo)的IP-10能用作治療效果的標(biāo)記物。如果抗原刺激的IP-10應(yīng)答在治療過(guò)程中下降，可以認(rèn)為該治療是成功的，相反，如果沒有觀察到降低，則必然想到治療失敗。面適用于與根據(jù)本發(fā)明的"診斷(diagnosis)","預(yù)后(prognosis)'，、"監(jiān)測(cè)(monitoring)"、"篩選(screening)"、"研究目的(researchpurposes)"、"才妄觸者追蹤(contacttracing)，，、"增力口的才企出病例(enhancedcasefinding)，，以及"流行調(diào)查(prevalencestudies)"類似的表述，并且反之亦然。孵育步驟在血液從受試者抽出后的延長(zhǎng)期以后，CMI系統(tǒng)的細(xì)胞喪失了在全血中進(jìn)行CMI應(yīng)答的能力，并且在血液抽出后24小時(shí)，如果不進(jìn)行延長(zhǎng)細(xì)胞壽命的處理，例如但不限于在低于l(TC下進(jìn)行保存，則無(wú)干擾應(yīng)答通常會(huì)急劇降低。在一種實(shí)施方式中，勞動(dòng)力的減少允許了在醫(yī)療點(diǎn)進(jìn)行抗原對(duì)樣品的刺激，例如醫(yī)師診所、診療所(clinic)、門診部(outpatientfacility)以及獸醫(yī)診所(veterinaryclinics)或者農(nóng)場(chǎng)。一旦完成抗原刺激，就不再存在對(duì)新鮮而有活性的細(xì)胞的需要了。IP-10和其它的生物標(biāo)記物，例如細(xì)胞因子或免疫效應(yīng)物分子在血漿中穩(wěn)定，并因此，樣品可以被儲(chǔ)存、冷凍或運(yùn)輸而不需要特殊的條件或者與用于其它傳染病或者其它疾病診斷的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品相似的對(duì)時(shí)間的快速要求。所述孵育步驟可以為5-144小時(shí)，更優(yōu)選為5-120小時(shí)，并且更優(yōu)選為12-24小時(shí)或者它們之間的時(shí)間段。因此，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，孵育時(shí)間為5小時(shí)、6小時(shí)、7小時(shí)、8小時(shí)、9小時(shí)、IO小時(shí)、11小時(shí)、12小時(shí)、13小時(shí)、14小時(shí)、15小時(shí)、16小時(shí)、17小時(shí)、18小時(shí)、19小時(shí)、20小時(shí)、21小時(shí)、22小時(shí)、23小時(shí)、24小時(shí)、26小時(shí)、30小時(shí)、36小時(shí)、42小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)、96小時(shí)、120小時(shí)或144小時(shí)。由于IP-10以如此高的濃度分泌，因此能夠在恒溫箱外對(duì)樣品進(jìn)^f亍孵育，即在實(shí)驗(yàn)室的桌子上、或者在具有穩(wěn)定溫度的水浴中、或在可運(yùn)輸?shù)某休d裝置中。這對(duì)發(fā)展中國(guó)家或者具有基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備的門診部是特別有用的。所述孵育步驟可以在范圍為20-43。C的溫度下進(jìn)行。因此，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，孵育的溫度可以為16°C、18°C、20°C、22°C、25°C、26°C、27°C、28°C、29°C、30°C、31°C、32°C、33°C、35°C、37°C、38°C、39°C、40。C或41。C。所述孵育步驟可以但不限于在15。C到40。C之間的不固定的溫度下進(jìn)行，更優(yōu)選的為18-37°C,并且更優(yōu)選為30-37°C。本發(fā)明的一種實(shí)施方式允許用稀釋的樣品進(jìn)行刺激，這伴隨著向細(xì)胞培養(yǎng)的增加的培養(yǎng)基。本發(fā)明的另一種實(shí)施方式允許用向細(xì)胞培養(yǎng)中加入了惰性稀釋液(例如，生理鹽水)的樣品進(jìn)行刺激。樣品本發(fā)明的一種實(shí)施方式設(shè)想了一種用于測(cè)量受試者中CMI應(yīng)答的方法，該方法包括從所述受試者收集樣品，其中，所述樣品包括免疫系統(tǒng)的細(xì)胞，該細(xì)胞能在用抗原進(jìn)行刺激后產(chǎn)生免疫效應(yīng)物分子，用抗原孵育所述樣品，并隨后測(cè)量免疫效應(yīng)物的存在或水平的增加，其中所述免疫效應(yīng)物分子的存在或水平的增加說(shuō)明了所述受試者產(chǎn)生細(xì)胞介導(dǎo)免疫響應(yīng)的能力。在一種實(shí)施方式中，所述樣品來(lái)源于由血液、尿液、胸液、支氣管液(bronchialfluid)、漱口水(oralwashing),組織活枱r(tissuebiopsy)、腹水26(ascites)、脈(pus)、月鹵體液(cerebrospinalfluid)、才由吸4勿(aspirate)和濾-泡液所組成的組中。在優(yōu)選實(shí)施方式中，所述樣品得自血。然而，所述樣品還可以含有選自由全血、來(lái)自胸液的單核細(xì)胞、外周血單核細(xì)胞(PBMC's)、T細(xì)胞、CD4T細(xì)胞、CD8T細(xì)胞、T細(xì)胞(gamma-deltaTcells)、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及自然殺傷細(xì)胞(NKcell)所組成的組中的細(xì)胞。常規(guī)地，當(dāng)樣品為全血時(shí)，用抗凝血?jiǎng)?例如，肝素)來(lái)處理血液收集試管。盡管全血為優(yōu)選并且是最方便的樣本，本發(fā)明延伸到其它的含有免疫細(xì)胞的樣品，例如但不限于胸液、腹水、淋巴液(lymphfluid)、脊髓液或腦髓液、組織液以及包括鼻腔液(nasalfluid)和肺液(pulmonaryfluid)的呼吸道液。因而本發(fā)明的一種實(shí)施方式涉及一種方法，其中，所述樣品來(lái)自血液、尿液、胸液、支氣管液、漱口水、組織活檢、腹水、膿、腦髓液(cerebrospinalfluid)、抽吸物(aspirate)和/或?yàn)V泡液。因此本發(fā)明的另一種實(shí)施方式涉及一種方法，其中，所述樣品含有選自由外周單個(gè)核細(xì)胞、T細(xì)胞、CD4T細(xì)胞、CD8T纟田胞、T細(xì)胞(gamma-deltaTcells)、單核細(xì)胞、巨喧細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞(dendriticcell)以及自然殺傷細(xì)胞所組成的組中的細(xì)胞。在一種實(shí)施方式中，所述樣品為全血，可以在其中存在抗原、促細(xì)胞分裂原或"空白"的三種合適容器中收集所述全血。在另一種實(shí)施方式中，可以隨后將抗原、促細(xì)胞分裂原或"空白"加入到含有例如全血的樣品的等分試樣(alliquots)中。在另一種實(shí)施方式中，所述樣品為全血，所述全血可以在含有抗原、促細(xì)胞分裂原或"空白"的收集管中進(jìn)行收集，或可以將所述全血收集到加入了抗原、促細(xì)胞分裂原或空白的全血等分試樣中。通常地，血液在抗凝血素(優(yōu)選肝素、作為替換地，例如檸檬酸鹽或乙二胺四乙酸(EDTA))的存在下進(jìn)行保藏。當(dāng)加入血液時(shí)，所述抗凝血數(shù)存在于血液收集試管中。優(yōu)選使用血液收集試管，但這種使用不是必須要與標(biāo)準(zhǔn)自動(dòng)化實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)相容，并且這些都要服從于大范圍內(nèi)和隨機(jī)獲得的取樣的分析。血液收集試管同樣最小化了處理成本，并減少了對(duì)全血和血漿的實(shí)驗(yàn)室暴露，并因此減少了實(shí)驗(yàn)室人員與病原體接觸的風(fēng)險(xiǎn)，所述病原體例如但不限于人類免疫缺陷病毒。全血等分試樣的體積范圍可以為10|iL-4000nl，例如但不限于50pL、100pl、200jxl、300(il、400jil、500jil、600^1、700jil、800|il、900|il、1000|il、1100^、1200^1、1300^1、1400^1、1500^1、1600|il、1700^1、1800pl、1900pl、2000^1、2100pl、2200^1、2300jal、2400jil、2500jil、2600|il、2700^1、2800pl、2900jil或3000jJ?？梢栽谠嚬堋⒔M織培養(yǎng)孔(tissueculturewells)或其它容器中對(duì)樣品進(jìn)行孵育，并且以相關(guān)的濃度加入抗原、促細(xì)胞分裂原和"空白"。血液收集試管包括采血管或其它類似的器皿，但是也可以直接將血液抽出到開管(opentube)或毛細(xì)管中。試劑盒本發(fā)明還構(gòu)思了一種試劑盒，該試劑盒用來(lái)估計(jì)受試者的展開細(xì)胞介導(dǎo)應(yīng)答的能力。所述試劑盒為具有一個(gè)或多個(gè)間隔室的便利的分隔開的形式，所述間隔室適于接受來(lái)自受試者的樣品，例如全血純化細(xì)胞(wholebloodpurifiedcells)、活組織檢查或其它材料。上述間隔室或其它間隔室還可以在樣品為全血時(shí)含有肝素。通常地，所述試劑盒的形式為與一套說(shuō)明一起包裝以進(jìn)行銷售。所述說(shuō)明通常是用來(lái)受試者內(nèi)測(cè)量CMI應(yīng)答的方法的形式，所述方法包括從所述受試者收集樣品，其中，所述樣品含有能夠在用抗原進(jìn)行刺激后產(chǎn)生免疫效應(yīng)物分子的免疫系統(tǒng)細(xì)胞，用試劑盒所提供的抗原孵育所述樣品并隨后測(cè)量IP-IO的存在或水平的提高，其中所述免疫效應(yīng)物分子的存在或水平說(shuō)明了所述受試者展開細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答的能力。在一種實(shí)施方式中，所述試劑盒含有抗原以及單克隆或多克隆的抗體，所述抗體與IP-10在免疫試驗(yàn)中進(jìn)行特異性反應(yīng)，或者特異性地連接所述抗體的部分以用作診斷劑。本發(fā)明所提供的試劑盒可以為多組成的形式，其中第一組成包括多樣的血液收集試管，第二組成包括用于免疫效應(yīng)物分子的基于抗體的檢測(cè)裝置并且第三組成包括一套說(shuō)明，該說(shuō)明包括以下(i)在血液收集試管中收集血液；(ii)混合所述試管；(iii)孵育所述試管；(iv)離心分離所述試管并收集血漿；以及(v)^r測(cè)血漿中的免疫效應(yīng)物分子。所述試驗(yàn)還可以為自動(dòng)或半自動(dòng)的，并且所述自動(dòng)的情況可以由計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行控制。本發(fā)明的試驗(yàn)可以為自動(dòng)或半自動(dòng)的以進(jìn)行高產(chǎn)量的篩選，或用來(lái)對(duì)來(lái)自一個(gè)受試者的大量免疫效應(yīng)物分子進(jìn)行篩選。通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件方便地控制自動(dòng)化。本發(fā)明設(shè)計(jì)了一種計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品，因此，為了估計(jì)IP-10的存在或不存在或存在水平，所述產(chǎn)品包括(1)接受對(duì)報(bào)告分子的確認(rèn)作為輸入值的編碼，所述4艮告分子與標(biāo)記的抗體或信使RNA相聯(lián)述"R告分子所附著的分子的確定的編碼；以及(3)儲(chǔ)存上述編碼的計(jì)算機(jī)可讀媒介。本發(fā)明的另一方面延伸到用來(lái)估計(jì)IP-IO的存在或不存在的計(jì)算機(jī)，所述計(jì)算機(jī)包括(1)機(jī)器可讀數(shù)據(jù)儲(chǔ)存媒介構(gòu)成的數(shù)據(jù)儲(chǔ)存材料，該數(shù)據(jù)儲(chǔ)存材料編碼有機(jī)器可讀數(shù)據(jù)，其中，所述及其可讀數(shù)據(jù)I包括輸入值，該輸入值對(duì)與標(biāo)記的抗體或mRNA相連的才艮告分子進(jìn)行識(shí)別；(2)用來(lái)儲(chǔ)存指令的工作存儲(chǔ)器，所述指令用來(lái)處理所述機(jī)器可讀數(shù)據(jù)，(3)與所述工作存儲(chǔ)器相連并連接到所述數(shù)據(jù)儲(chǔ)存媒介上的中央處理單元，該中央處理單元用來(lái)處理所述機(jī)器可讀數(shù)據(jù)以比較所述數(shù)值以提供對(duì)報(bào)告分子或者所迷報(bào)告分子所附著的分子的識(shí)別或水平的估計(jì)；以及(4)與所述中央處理單元相連的輸出硬件，以接收所述比較的結(jié)果。特異性和靈敏度由試驗(yàn)被正確地識(shí)別或診斷，例如如果所有具有給定狀況的個(gè)體具有陽(yáng)性試驗(yàn)結(jié)果,則靈壽文度為100°/。。給定篩選試驗(yàn)的特異性反映了不具有該狀況的個(gè)體的比例，這些個(gè)體由試驗(yàn)被正確地識(shí)別或診斷，例如說(shuō)，如果所有的不具有該條件的個(gè)體的試驗(yàn)結(jié)果為陰性，這特異性為100%。靈敏度被定義為具有給定狀況(例如，活動(dòng)性TB感染)的個(gè)體的比例，29這些個(gè)體由本發(fā)明所描述的方法被正確地識(shí)別或診斷(例如，具有陽(yáng)性IP-IO試驗(yàn)結(jié)果)。特異性在此被定義為不具有這種狀況(例如，活動(dòng)性TB感染)的個(gè)體的比例，這些個(gè)體由本發(fā)明所描述的方法被正確地識(shí)別或診斷(例如，具有陰性IP-10試驗(yàn)結(jié)果)。接收器工作特性(Receiver-operatingcharacteristic)診斷試驗(yàn)的準(zhǔn)確性通過(guò)其接收器工作特性(ROC)而得到最好的描述(特別參見茨威格，M.H和坎貝爾,G.,臨床化學(xué)，39(1993)561-577(Zweig，M.H.,andCampbell,G.,Clin,Chem.39(1993)561-577))。ROC圖是在整個(gè)觀察數(shù)據(jù)范圍內(nèi)由持續(xù)改變的判斷閾值得出的所有的靈壽丈度/特異性對(duì)的圖。實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)的臨床效果依賴于其診斷的準(zhǔn)確性，或者將受試者正確地劃分到臨床上相應(yīng)的小組的能力。診斷的準(zhǔn)確性衡量了試驗(yàn)正確地區(qū)別受調(diào)查受試者的兩種不同狀況的能力。這些狀況為例如健康和疾病、潛伏性感染或近期感染對(duì)未感染或者良性疾病對(duì)惡性疾病。在各種情況中，通過(guò)對(duì)全部范圍的判斷閾值的靈敏度對(duì)l-特異性進(jìn)行繪圖，ROC圖描述了兩種分布之間的重疊。y軸為靈敏度，或者真陽(yáng)性部分[通過(guò)(真陽(yáng)性試驗(yàn)結(jié)果的數(shù)量)/(真陽(yáng)性測(cè)試結(jié)果的數(shù)量+假陰性測(cè)試結(jié)果的數(shù)量)確定]。也被稱為存在疾病或狀況時(shí)的陽(yáng)性。它僅由感染小組計(jì)算得到。在x軸上為假陽(yáng)性部分，或l-特異性[通過(guò)(假陽(yáng)性結(jié)果的數(shù)量)/(真陰性測(cè)試結(jié)果的數(shù)量+假陽(yáng)性測(cè)試結(jié)果的數(shù)量)確定]。它是特異性的指標(biāo)，并且完全通過(guò)未感染小組計(jì)算得到。由于真陽(yáng)性和假陽(yáng)性部分通過(guò)使用來(lái)自兩種不同的小組的試驗(yàn)結(jié)果來(lái)進(jìn)行完全獨(dú)立的計(jì)算，所以ROC點(diǎn)不依賴于樣品中的疾病的流行性。在ROC力的試驗(yàn)(在兩種結(jié)果的分布上沒有重疊)具有穿過(guò)左上角的ROC點(diǎn)，在此處，真陽(yáng)性部分為l.o或100%(理想靈敏度)且假陽(yáng)性部分為0(理想特異性)。對(duì)于不具有區(qū)別力的試驗(yàn)(兩個(gè)組的結(jié)果具有相同的分布)的理論點(diǎn)為從左下角到右上角的45。對(duì)角線。大多數(shù)的點(diǎn)落在這兩種極端之間。(如果ROC點(diǎn)完全落在45°對(duì)角線之下，通過(guò)將對(duì)"陽(yáng)性"的判斷標(biāo)準(zhǔn)從"大于，，逆轉(zhuǎn)為"小于"就能進(jìn)行修正，或反之亦然)。定性地，點(diǎn)越接近左上角，試驗(yàn)的整體準(zhǔn)確性就越高。量化實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)的診斷準(zhǔn)確性的一種方便的目的是通過(guò)一個(gè)數(shù)來(lái)表達(dá)該試驗(yàn)的性能。最普遍的全局性測(cè)量就是在ROC點(diǎn)下的面積。按慣例，該面積通常20.5(如果不是，這可以逆轉(zhuǎn)規(guī)則來(lái)使其面積在該范圍內(nèi))。數(shù)值范圍在1.0(兩組試驗(yàn)數(shù)值理想分離)到0.5(在兩組試驗(yàn)數(shù)值之間沒有明顯的分布差別)之間。所述面積不l又依賴于特殊點(diǎn)部分，例如最4妄近對(duì)角線的點(diǎn)或90%特異性處的靈敏度，還依賴于所有的點(diǎn)。這定量地描述性地表示了ROC點(diǎn)有多么4妄近理想點(diǎn)(面積=1.0)。這種新穎的標(biāo)記物IP-10的臨床應(yīng)用可以通過(guò)與其它用于給定感染的診斷工具進(jìn)行比較，并與它們結(jié)合來(lái)進(jìn)行評(píng)估。在感染結(jié)核分技桿菌的情況下，將通過(guò)與已建立的診斷工具所確定的標(biāo)記物IFN-y或使用接收器工作特性曲線分析的TST進(jìn)行比較來(lái)評(píng)價(jià)新穎的標(biāo)記物IP-10的臨床應(yīng)用。參見實(shí)施例5.因此，本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式的一個(gè)目的是提供一種用于檢測(cè)哺乳動(dòng)物是否遇到過(guò)抗原的免疫學(xué)方法，該方法包括a)測(cè)定在所述哺乳動(dòng)物的樣品中產(chǎn)生的抗原特異性IP-IO的水平b)建立從健康人群獲得的IP-10水平的百分位數(shù)圖c)基于在健康人群中所測(cè)定的IP-10水平和在對(duì)可疑抗原產(chǎn)生了免疫學(xué)反應(yīng)性的人群中所測(cè)定的IP-10水平來(lái)建立ROC(接收器工作特性)曲線d)選擇所需的特異性e)從ROC曲線確定相應(yīng)于所需的特異性的靈敏度f(wàn))從百分位數(shù)圖相確定相應(yīng)于所確定的靈敏度的IP-10水平；以及g)如果樣品中IP-10水平等于或高于相應(yīng)于所確定的特異性的IP-10水平，則預(yù)測(cè)個(gè)體對(duì)該抗原具有免疫學(xué)反應(yīng)性，并且當(dāng)樣品中IP-10水平低于相應(yīng)于所確定的特異性的總體IP-IO水平，則預(yù)測(cè)個(gè)體不可能或者沒有對(duì)該抗原具有免疫學(xué)反應(yīng)性。因此，本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式的另一個(gè)目的是提供一種用于檢測(cè)哺乳動(dòng)物是否遇到過(guò)抗原的免疫學(xué)方法，該方法包括a)測(cè)定在所述哺乳動(dòng)物的樣品中產(chǎn)生的抗原特異性IP-IO的水平b)建立從健康人群獲得的IP-10水平的百分位數(shù)圖c)基于在健康人群中所測(cè)定的IP-10水平和在對(duì)可疑抗原產(chǎn)生了免疫學(xué)反應(yīng)性的人群中所測(cè)定的IP-10水平來(lái)建立ROC(接收器工作特性)曲線d)選擇所需的靈敏度e)從ROC曲線確定相應(yīng)于所需的靈敏度的特異性f)從百分位數(shù)圖相確定相應(yīng)于所確定的靈敏度的IP-10水平；以及g)如果樣品中IP-10水平等于或高于相應(yīng)于所確定的靈壽丈度的IP-10水平，則預(yù)測(cè)個(gè)體對(duì)該抗原具有免疫學(xué)反應(yīng)性，并且當(dāng)樣品中IP-10水平低于相應(yīng)于所確定的靈敏度的總體IP-10水平，則預(yù)測(cè)個(gè)體不可能或者沒有對(duì)該抗原具有免疫學(xué)反應(yīng)性。根據(jù)本發(fā)明的方法的特異性可以從70%到100%,優(yōu)選為80-100%，更優(yōu)選為90-100%。因此，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的特異性為80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、930/o、94%、95°/。、96%、97%、98%、99%或100%。根據(jù)本發(fā)明的方法的靈敏度可以從70%到100%,優(yōu)選為80-100%，更優(yōu)選為90-100%。因此，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的靈敏度為80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97°/。、98%、99%或100%。參見實(shí)施例5.將IP-10水平與一套參考對(duì)照數(shù)據(jù)或參考對(duì)照值，例如截止點(diǎn)值進(jìn)行比較以確定是否受試者處于例如感染的增加的風(fēng)險(xiǎn)中或有此可能。為了提高檢測(cè)的效率，可以將IP-10的血液濃度與一套參考對(duì)照數(shù)據(jù)進(jìn)行比較以確定是否受試者可能被感染或者處于發(fā)展為例如感染的增加的風(fēng)險(xiǎn)中。為了提高檢測(cè)的效率，可以將PHA誘導(dǎo)IP-10水平和抗原刺激的IP-10水平與一套參考對(duì)照數(shù)據(jù)進(jìn)行比較以確定受試者是否被感染或者處于發(fā)展為感染或疾病的增加的風(fēng)險(xiǎn)中。為了確定是否患者處于發(fā)展為例如感染的增加的風(fēng)險(xiǎn)中，需要建立截止點(diǎn)(cut-off)。這種截止點(diǎn)可以通過(guò)實(shí)驗(yàn)室、醫(yī)師而建立，或者建立在各個(gè)患者的病例基礎(chǔ)上。作為替換地，截止點(diǎn)可以由陰極對(duì)照組的平均數(shù)、中位數(shù)或幾何平均數(shù)來(lái)確定((例如，為感染的健康的未暴露的不具有TB感染的患者)+/-源自標(biāo)準(zhǔn)偏差的一個(gè)或多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差或值)。在抗原激發(fā)之后，某些個(gè)體對(duì)生物標(biāo)記做出強(qiáng)烈應(yīng)答而對(duì)其它的不應(yīng)答。例如一些個(gè)體可能不表現(xiàn)出ip_io或IFN-y應(yīng)答，因而產(chǎn)生低水平的IP-10或IFN-y。在這些情況下，對(duì)兩種、三種、四種或更多的生物標(biāo)記物進(jìn)行同時(shí)測(cè)量將增加分析的靈敏度，并且增加了陽(yáng)性應(yīng)答的數(shù)量。通過(guò)將IP-10與一種或多種生物標(biāo)記物進(jìn)行結(jié)合，例如但不限于IFN-y、IL-2或MCP-1，從而能夠做出較少受到對(duì)單個(gè)生物標(biāo)記物無(wú)反應(yīng)的影響的診斷預(yù)測(cè)。在另一種優(yōu)選實(shí)施方式中，IP-10的測(cè)量與一種或多種其它的生物標(biāo)記物的測(cè)量結(jié)合，并與結(jié)合的參考水平進(jìn)行比較。所測(cè)量的生物標(biāo)記物水平可以通過(guò)算數(shù)運(yùn)算，例如加、減、乘和百分?jǐn)?shù)算數(shù)處理、平方根、求冪以及對(duì)數(shù)函數(shù)，來(lái)進(jìn)行結(jié)合?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行各種生物標(biāo)記物的結(jié)合和各種計(jì)算結(jié)合的參考數(shù)值的方法。在另一種優(yōu)選實(shí)施方式中，可以在將單個(gè)生物標(biāo)記物濃度與參考水平，例如截止點(diǎn)，進(jìn)行比4交后，將生物標(biāo)記物(例如但不限于與IFN-y和/或IL-2結(jié)合的IP-10)的單個(gè)的測(cè)量值進(jìn)行結(jié)合。該方法產(chǎn)生的一個(gè)試驗(yàn)結(jié)果中不止覆蓋了多個(gè)抗原，還覆蓋了多個(gè)生物標(biāo)記物。可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行各種生物標(biāo)記物的結(jié)合和各種計(jì)算結(jié)合的參考數(shù)值的方法。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，生物標(biāo)記物IP-10和選自由MCP-1、IL-2和INF-y所組成的組中的一種生物標(biāo)記物的結(jié)合提供了與靈敏度和/或特異性相關(guān)的協(xié)同效應(yīng)。在本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，生物標(biāo)記物IP-IO、MCP-l和IL-2的結(jié)合提供了與靈敏度和/或特異性相關(guān)的協(xié)同效應(yīng)。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方式中，生物標(biāo)記物IP-IO、MCP-1和IFN-y的結(jié)合提供了與靈敏度和/或特異性相關(guān)的協(xié)同效應(yīng)。在本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，生物標(biāo)記物IP-IO、IL-2和IFN-y的結(jié)合提供了與靈敏度和/或特異性相關(guān)的協(xié)同效應(yīng)。特別地，當(dāng)協(xié)同使用于此時(shí)指的是其中多個(gè)生物標(biāo)記物同時(shí)作用產(chǎn)生"結(jié)合的生物標(biāo)記物信號(hào)"的現(xiàn)象，具有比通過(guò)僅知道單個(gè)生物標(biāo)記物的靈敏度或特異性所預(yù)測(cè)的對(duì)診斷的更高的靈敏度或特異性，因此減少了假陽(yáng)性的數(shù)量并提高了進(jìn)行區(qū)別的能力。在以抗體為基礎(chǔ)的讀數(shù)中，例如但不限于ELISA或免疫色譜棒試驗(yàn)，兩種或多種連^l妄不同生物標(biāo)記物的抗體將使生物標(biāo)記的連接重量增加，因此發(fā)生協(xié)同作用并產(chǎn)生更強(qiáng)的相應(yīng)且增加了試驗(yàn)的靈敏度?？梢愿鶕?jù)本文的教導(dǎo)而進(jìn)行結(jié)合的讀數(shù)。風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估本發(fā)明的發(fā)明人疫情成功地確認(rèn)了用于測(cè)量對(duì)抗原的細(xì)胞介導(dǎo)應(yīng)答的新的標(biāo)記物。在對(duì)抗原具有細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答的受試者內(nèi)標(biāo)記物IP-IO的濃度增加了。并且IP-10表現(xiàn)出是用來(lái)檢測(cè)例如結(jié)核分枝桿菌感染的有效的標(biāo)記物。靈敏度比任何其它已確定的標(biāo)記物都要高，并且特異性與任何其它已確定的標(biāo)記物差不多或者更好，參見例如實(shí)施例4、實(shí)施例5和實(shí)施例10.統(tǒng)計(jì)推理可以例如建立在患有與于年齡、職業(yè)、曝光度(exposure)、遺傳背景、人類白細(xì)胞抗原類型(HLA-type)有關(guān)的疾病的風(fēng)險(xiǎn)的&出上。截止點(diǎn)可以基于試驗(yàn)個(gè)體的具體狀況而改變，例如但不限于患病風(fēng)險(xiǎn)、職業(yè)、居住地或曝光度。截止點(diǎn)可以基于試驗(yàn)個(gè)體的具體狀況而改變，例如但不限于年齡、性別、遺傳背景(即，人類白細(xì)胞抗原類型)、后天獲得或遺傳的受損的免疫功能(例如，HIV感染、糖尿病、腎衰竭或肝功能衰竭患者、接受免疫調(diào)整藥物治療的患者，例如但不限于皮脂類固醇、化療、TNF-a阻斷劑、有絲分裂抑制劑)。對(duì)判斷極限或截止點(diǎn)極限做出調(diào)整將決定用來(lái)測(cè)試對(duì)如果存在的感染的試驗(yàn)的靈敏度，或如果在該極限之下，決定試驗(yàn)排除感染或疾病的特異性。于是，原則就是在該截止點(diǎn)之上的數(shù)值說(shuō)明了增加的風(fēng)險(xiǎn)且在該截止點(diǎn)之下的數(shù)值說(shuō)明了減少的風(fēng)險(xiǎn)。此外，具有不清楚的結(jié)果的試驗(yàn)樣品必須個(gè)別地進(jìn)行解釋。不清楚的結(jié)果定義為在促細(xì)胞分裂原刺激的樣品(PHA)中的結(jié)果具有意料不到的低水平的IP-IO。用于不清楚的IP-10結(jié)果的最終的截止點(diǎn)可以根據(jù)研究組而決定，特別是在免疫抑制中，截止點(diǎn)水平可以選在較低的水平。34截止點(diǎn)水平如本領(lǐng)域技術(shù)人員所通常了解的，對(duì)細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)性進(jìn)行掃描的方法是通過(guò)比較做出決定的過(guò)程。對(duì)任何一種做出決定的過(guò)程而言，需要基于患有疾病或目標(biāo)狀況的受試者，和/或不具有疾病、感染或目標(biāo)狀況的受試者的參考值。截止水平(或截止點(diǎn))可以建立在多個(gè)判斷標(biāo)準(zhǔn)上，包括將繼續(xù)進(jìn)一步的侵入式診斷試驗(yàn)的受試者的數(shù)量、所有的將繼續(xù)進(jìn)一步的侵入式診斷試驗(yàn)的受試者具有和/或發(fā)展成例如感染的平均風(fēng)險(xiǎn)、判斷任一病者特異風(fēng)險(xiǎn)(patientspecificrisk)高于確定的風(fēng)險(xiǎn)水平(例如400中的1個(gè)或者1:250(如通過(guò)團(tuán)體篩選或者個(gè)體受試者而確定))的受試者應(yīng)該繼續(xù)進(jìn)行進(jìn)一步的侵入式診斷試驗(yàn)或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它判斷標(biāo)準(zhǔn)。截止水平可以基于多種判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行調(diào)整，例如但不限于試驗(yàn)個(gè)體的某些組。例如，在具有免疫缺陷的個(gè)體和具有高風(fēng)險(xiǎn)發(fā)展為活動(dòng)性疾病的患者中，所述截止水平可以設(shè)得較低，在其它具有低風(fēng)險(xiǎn)發(fā)展為活動(dòng)性疾病的健康的個(gè)體中截止點(diǎn)可以較高。本發(fā)明的一種實(shí)施方式公開了一種用于測(cè)定受試者是否具有感染的方法，該方法包括(a)從受試者獲得樣品，以及(b)定量地確定存在于樣品中的IP-10的濃度，存在于樣品中的IP-10多肽的量的濃度等于或高于所選擇的截止點(diǎn)，該截止點(diǎn)說(shuō)明該受試者可能具有感染。更具體地i兌，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及一種免疫學(xué)方法，該方法包括以下步驟a)用至少一種受試抗原孵育從哺乳動(dòng)物獲得的樣品b)測(cè)定在所述樣品中的IP-10的水平c)將所述測(cè)定的IP-10的水平與參考水平進(jìn)行比較，從而確定哺乳動(dòng)物先前是否遇到過(guò)產(chǎn)生對(duì)該抗原的免疫學(xué)反應(yīng)性的所述抗原，或先前是否遇到過(guò)產(chǎn)生對(duì)該抗原的免疫學(xué)交叉反應(yīng)性的其它抗原。更具體地所，本發(fā)明的另一方面涉及一種免疫學(xué)方法，該方法包括以下步驟a)用至少一種受試抗原孵育從哺乳動(dòng)物獲得的樣品，而不進(jìn)行任何的隨后的刺激并且在所述抗原不是PPD的條件下，b)測(cè)定在所述樣品中的IP-10的水平c)將所述測(cè)定的IP-10的水平與參考水平進(jìn)行比較，^v而確定哺乳動(dòng)物先前是否遇到過(guò)產(chǎn)生對(duì)所述抗原的免疫學(xué)反應(yīng)性的所述至少一種抗原，或者先前是否遇到過(guò)產(chǎn)生對(duì)該抗原的免疫學(xué)交叉反應(yīng)性的其它抗原。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種根據(jù)本發(fā)明的方法，其中所述樣品分為至少兩部分，并且a)從具有至少一種抗原的哺乳動(dòng)物獲得的樣品進(jìn)行孵育，而不進(jìn)行任何的隨后的刺激并且在所述抗原不是PPD的條件下，以產(chǎn)生應(yīng)答樣品b)用無(wú)活性溶液孵育所述樣品的第二部分以產(chǎn)生空白樣品c)測(cè)定在所述兩部分中IP-10的水平d)通過(guò)將從所述應(yīng)答樣品中測(cè)定的IP-10中減去從所述空白樣品中測(cè)定的IP-10水平來(lái)確定樣品的抗原依賴IP-10應(yīng)答e)將抗原依賴IP-10應(yīng)答或由該應(yīng)答得到的數(shù)值與所述參考水平或由該參考水平得到的數(shù)值進(jìn)行比較，從而確定哺乳動(dòng)物先前是否遇到過(guò)由該抗原并因而產(chǎn)生對(duì)該抗原的免疫學(xué)反應(yīng)性，或者先前是否遇到過(guò)其它抗原產(chǎn)生對(duì)該抗原的免疫學(xué)交叉反應(yīng)性和/或?qū)l(fā)展為感染。這種區(qū)別值是通過(guò)對(duì)健康對(duì)照人群以及具有已知感染的人群的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)進(jìn)行測(cè)量所確定的值，從而在分析參數(shù)值和已知的健康對(duì)照人暈和感染患者人群的臨床數(shù)據(jù)之間的關(guān)系的基礎(chǔ)上，用預(yù)定的特異性或預(yù)定的靈敏度來(lái)測(cè)定這種確定感染人群的區(qū)別值，例如從本文的實(shí)施例中的詳細(xì)討論可以明顯有效的。在本文所描述的具體的實(shí)驗(yàn)裝置中(實(shí)施例5),發(fā)現(xiàn)有利地作為截止值的IP-10閾值的范圍為，但不限于從14pg/ml到1000pg/ml。優(yōu)選地，該截止點(diǎn)的范圍為100pg/ml到800pg/ml之間，例如范圍為100-600，比如說(shuō)范圍為150-400，例如范圍為150-300，比如說(shuō)范圍為150-250例如范圍為175-215。優(yōu)選地，所述截止值為180pg/ml、181pg/ml、182pg/ml、183pg/ml、184pg/ml、185pg/ml、186pg/ml、187pg/ml、188pg/ml、189pg/ml、190pg/ml、191pg/ml、192pg/ml、193pg/ml、194pg/ml、195pg/ml、196pg/ml、197pg/ml、198pg/ml、199pg/ml、200pg/ml、201pg/ml、202pg/ml、203pg/ml、204pg/ml、205pg/ml、206pg/ml、207pg/ml、208pg/ml、209pg/ml、210pg/ml、211pg/ml、212pg/ml、213pg/ml、214pg/ml、215pg/ml、216pg/ml、217pg/ml、218pg/ml、219pg/ml、220pg/ml、221pg/ml、222pg/ml、223pg/ml、224pg/ml或225pg/ml。樣品的稀釋、與其它參數(shù)結(jié)合的測(cè)量例如但不限于白細(xì)胞介素-2、干擾素Y和/或巨噬細(xì)胞趨化蛋白-l，或者其它參數(shù)將導(dǎo)致其它的截止值，這可以根據(jù)本文所教導(dǎo)的進(jìn)行測(cè)定。其它的實(shí)驗(yàn)裝置、其它樣品、其它抗原以及其它參數(shù)將必然導(dǎo)致其它的截止值，這可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)常規(guī)設(shè)定的操作或者例行試驗(yàn)根據(jù)本文的教導(dǎo)而進(jìn)行測(cè)定。某些抗原是比其它抗原更有效的誘導(dǎo)物，但是不同的可利用的抗原(即，肽)的數(shù)量將導(dǎo)致應(yīng)答細(xì)胞數(shù)量的增加以及更高的生物標(biāo)記物的產(chǎn)生。因此，截止點(diǎn)也是抗原依賴的，并且取決于疾病。進(jìn)一步地，其它的種具有其它的顯著的組織相容性抗原報(bào)告能力，因此在不同種內(nèi)試驗(yàn)的相同的抗體將產(chǎn)生不同的種特異性截止點(diǎn)。生物標(biāo)記物的濃度的測(cè)量可以被轉(zhuǎn)換為國(guó)際單位(IU)。IU指生物標(biāo)記物的生物學(xué)活性，并是各種測(cè)量方法之間基準(zhǔn)的參考。在本發(fā)明的其它實(shí)施方式中，截止點(diǎn)的確定可以與刺激指數(shù)(定義為抗原刺激的IP-10濃度除以未被刺激的血漿濃度)結(jié)合。發(fā)現(xiàn)刺激指數(shù)值的范圍為，但不限于l-6或更高。優(yōu)選地，所述刺激指數(shù)至少為1.25、1.5、1.75、2、2.25、2.5、2.75、3、3.25、3.5、3.75、或4。本發(fā)明的方法還公開范圍為數(shù)百倍的刺激指數(shù)。按此，刺激指數(shù)值至少為10、20、50、75、100、200、300、或甚至考慮1000。對(duì)于潛伏性感染、近期感染、亞臨床感染或活動(dòng)性感染，截止點(diǎn)和刺激指數(shù)可以不同。更具體地，在結(jié)核分枝桿菌感染的病例中，對(duì)于例如肺外結(jié)核、肺結(jié)核或它們二者、治愈的感染、潛伏性TB而言，截止值和刺激指數(shù)可以不同。在HIV、其它協(xié)同感染、免疫抑制的存在下發(fā)現(xiàn)感染的情況下，截止點(diǎn)和刺激指數(shù)的變化水平可以不同。根據(jù)疾病存在的流行性或預(yù)期的流行性，可以根據(jù)疾病的嚴(yán)重性以及測(cè)定的結(jié)果，患者對(duì)該試驗(yàn)是陽(yáng)性或陰性，來(lái)調(diào)整截止水平和/或刺激指數(shù)以獲得所希望的少的假陽(yáng)性或少的假陰性結(jié)果。在肺結(jié)核的病例中，本發(fā)明提出的分析具有對(duì)目前可利用的其它體外試驗(yàn)的明顯的優(yōu)勢(shì)。由于抗原特異性IP-10的產(chǎn)生高于產(chǎn)生的IFN-y(參見例如實(shí)施例4和實(shí)施例17),截止點(diǎn)和刺激指數(shù)可以在更寬的范圍內(nèi)進(jìn)行調(diào)整，因此拓寬了診斷的機(jī)會(huì)。如果具有癥狀的單個(gè)患者需要進(jìn)行診斷，或者該試驗(yàn)將用于對(duì)人群中大量的個(gè)體進(jìn)^f亍篩選，截止水平可以不同。截止點(diǎn)和刺激指數(shù)可以建立在結(jié)合的IP-10測(cè)量結(jié)果和其它生物標(biāo)記物測(cè)量結(jié)果，例如但不限于白細(xì)胞介素-2、干擾素y(INF-y)和/或巨噬細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)。復(fù)合的截止點(diǎn)和/或刺激指數(shù)可能導(dǎo)致其它的值，這可以根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)進(jìn)行測(cè)定。雖然用來(lái)測(cè)量這些分析物水平的任何一種已知的分析方法能用于本發(fā)明，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，對(duì)各個(gè)標(biāo)記物所使用的分析方法必須與用來(lái)對(duì)該特定的標(biāo)記物產(chǎn)生參考數(shù)據(jù)的方法想法。如果對(duì)特定的標(biāo)記物或者標(biāo)記物的結(jié)合使用了新的分析方法，這基于該方法所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)，將會(huì)產(chǎn)生一套新的參考數(shù)據(jù)。能在可商購(gòu)得到的電腦程序統(tǒng)計(jì)安裝包《統(tǒng)計(jì)分析系統(tǒng)》(StatisticalAnalysisSystem)(由賽仕軟件研究所(SASInstituteInc.)制造并銷售)，或者通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它的多變量判別分析的方法或其它統(tǒng)計(jì)軟件包或篩選軟件上進(jìn)行多變量判別分析以及其它風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。如對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見地，在以上所討論的任何一種實(shí)施方式中，改變陽(yáng)性試驗(yàn)的風(fēng)險(xiǎn)截止水平或使用不同的前設(shè)風(fēng)險(xiǎn)(prioririsk),這能應(yīng)用于人群中的不同小組,可能改變對(duì)各個(gè)患者的判別分析的結(jié)果。在此所描述的穩(wěn)定性試驗(yàn)提出，IP-10在常規(guī)處理下高度穩(wěn)定(即，冷凍或在室溫和低于l(TC下儲(chǔ)存更長(zhǎng)的時(shí)間)因此，本發(fā)明得出結(jié)論，IP-IO是用于臨床的有吸引力的分析物。在此所示的數(shù)據(jù)表示，IP-10是用于預(yù)后、診斷、監(jiān)測(cè)以及篩選感染病的潛在的重要的標(biāo)記物。為了確定細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)性的臨床嚴(yán)重程度，用來(lái)評(píng)估IP-10測(cè)量的可檢測(cè)的信號(hào)的方法需要參考或參考方法。所述參考還使得還使得能夠?qū)⒎治龊头椒ㄗ兓?、試劑盒變化、處理變化、將IP-10與其它生物標(biāo)記物結(jié)合相關(guān)的變化以及其它的與IP-10不直接相關(guān)或間接相關(guān)的變化都考慮在內(nèi)。在本發(fā)明的內(nèi)容中，屬于"參考"是指與數(shù)量、質(zhì)量或類型有關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)，其它的值和特征可以與之進(jìn)行比較，例如標(biāo)準(zhǔn)曲線。所述參考數(shù)據(jù)反應(yīng)了用于具有細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)性的受試者(也被稱為受影響、暴露的、接種過(guò)疫菌的、感染的或生病的)的IP-10水平和/或?qū)φＪ茉囌叩?也被稱為未受影響的、未暴露的、未接種過(guò)疫苗的、未感染的或健康的)IP-10水平。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述裝置選自由分析、免疫測(cè)定、棒、干棒、電氣i殳備、電才及、閱讀器(分光光度計(jì)讀數(shù)器(spectrophotometricreader)、紅外線讀數(shù)器(IR-readers)、同位素讀數(shù)器(isot叩icreaders)及類似的讀數(shù)器)組織化學(xué)以及整合有參照物、濾紙、可由棵眼觀察到的顏色反應(yīng)的類似的裝置所組成的組中。IP-10干擾素-y誘導(dǎo)蛋白10(IP-10)或CXCL10是一種趨化因子。該IP-10基因通過(guò)原位雜交比對(duì)到4q21上。IP-10表達(dá)由干擾素(IFNs，即干擾素-y(IFN-y))和非炎癥刺激向上調(diào)控，并且它在各種組織和細(xì)胞類型中的多種Thl型非炎癥疾病中表達(dá)。可以在基因文庫(kù)(GeneBank)中登錄號(hào)BC010954(gi15012099)下找到人類基因序列。趨化因子是一組小的(接近8-14kD)大部分為基礎(chǔ)的結(jié)構(gòu)相關(guān)的分子，它們調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)各種類型的白血球通過(guò)7-跨膜、連接有G蛋白的受體的運(yùn)輸。趨化因子還在發(fā)育、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定以及免疫系統(tǒng)作用方面扮演至關(guān)重要的角色，并且它們影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞和參與血管生成和血管生成抑制的內(nèi)皮細(xì)胞。基于4種保存的半胱氨酸殘基中前兩種的布置，趨化因子分為2種主要的亞科，a亞科(CXC)和p亞科(CC);這兩種趨化因子被CXC趨化因子中的一個(gè)氨基酸分離，并且接近CC趨化因子?；诠劝彼?亮氨酸-精氨酸序列相鄰以及在CXC基序的N-末端的存在或不存在，CXC趨化因子進(jìn)一步再細(xì)分為ELR和非ELR型。ELR型是對(duì)中性粒細(xì)胞的趨化因子，而非ELR型是對(duì)淋巴細(xì)胞的趨化因子。IP-10抑制了骨髓集落的形成，在或體內(nèi)具有抗癌活性，是對(duì)人體單核細(xì)胞和T細(xì)胞的化學(xué)引誘物，并促進(jìn)T細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合。IP-10是或體內(nèi)血管再生的有效的抑制劑。IP-10可以在炎癥和腫瘤發(fā)生中參與調(diào)節(jié)血管生成。IP-10還是RAS靶基因，并且大多數(shù)的結(jié)腸直腸癌中被過(guò)度表達(dá)。使用核磁共振光譜法能發(fā)現(xiàn)，IP-10通過(guò)疏水裂隙(hydrophobiccleft)與N末端的CXCR3互相作用，所述疏水裂隙由IP-10的N環(huán)和40s-環(huán)區(qū)域形成，類似于例如IL8的其它趨化因子的互相作用面。發(fā)現(xiàn)互相作用的額外的區(qū)域由疏水裂隙形成，所述疏水裂隙由IP-10的N末端和30s環(huán)形成。提出了一種才幾理，該機(jī)理涉及30s環(huán)，并且(3鏈2的結(jié)構(gòu)可能解釋IP-10與CCR3的互相作用和拮抗作用。在^結(jié)核的病例中，已經(jīng)在淋巴結(jié)和肺結(jié)核肉芽腫中、TB患者的胸液中和血清或血漿中、并在經(jīng)歷了免疫重建綜合癥的TB-HIV協(xié)同感染中發(fā)現(xiàn)了高水平的IP-IO。IP-10水平的測(cè)定免疫效應(yīng)物分子優(yōu)選為細(xì)胞因子，例如但不限于IP-IO。免疫效應(yīng)物分子度下進(jìn)行測(cè)定。IP-10的水平通過(guò)傳統(tǒng)的分析方法進(jìn)行測(cè)量，例如本領(lǐng)域公知的免疫學(xué)方法。可以根據(jù)本文的教導(dǎo)，將免疫效應(yīng)物的測(cè)量結(jié)果與其它的在基因、RNA或蛋白質(zhì)水平的免疫效應(yīng)物的測(cè)量結(jié)果進(jìn)行結(jié)合。如以上所述地，免疫效應(yīng)物分子的檢測(cè)可以在蛋白質(zhì)或核酸水平進(jìn)行。因如說(shuō)，高水平的IP-10的mRNA是表示IP-10水平增加的間接數(shù)據(jù)。免疫效應(yīng)物的配體在檢測(cè)這些分子和/或測(cè)定這些分子的數(shù)量上特別有用。40對(duì)免疫效應(yīng)物的抗體特別有用。用來(lái)分析本文所設(shè)計(jì)的方法的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的，并且包4舌，例如夾心分析法(sandwichassay)、xMAP多元分析(xMAPmultiplexing)、Luminex、ELISA和ELISpot。所涉及的抗體包括部分抗體、哺乳類化(例如人化)抗體、重組抗體或合成抗體以及雜交鏈抗體和單鏈抗體。多克隆抗體和單克隆抗體通過(guò)用免疫效應(yīng)物或者其抗原部分進(jìn)行免疫而得到，并且任一類型可以用于免疫測(cè)定。獲得這兩種類型的血清的方法是本領(lǐng)域公知的。多克隆血清較次優(yōu)選，但相對(duì)容易制得，通過(guò)給合適的實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物注射有效量的免疫效應(yīng)物或其抗原部分，然后收集來(lái)自該動(dòng)物的血清或血漿，并通過(guò)任何一種已知的免疫吸附技術(shù)將特異性血清分離。雖然通過(guò)該方法產(chǎn)生的抗體在實(shí)際上用于任何一種類型的免疫測(cè)定，但是由于產(chǎn)品潛在的異質(zhì)性，它們通常次優(yōu)選。由于能大量制備的能力以及產(chǎn)品的同質(zhì)性，單克隆抗體在免疫測(cè)定中的4吏用是特別優(yōu)選的?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法進(jìn)行用于產(chǎn)生單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞系的制備，所述雜交瘤細(xì)胞系通過(guò)將無(wú)限增殖細(xì)胞系和對(duì)抗免疫原制備的致敏淋巴細(xì)胞進(jìn)行融合而得到。還能使用特異性抗體在竟?fàn)幮詿晒馄衩庖邷y(cè)定(competitivefluorescentpolarizationimmunoassay,CFIPA)中通過(guò)直接測(cè)量IP-10獲得檢測(cè)，或者由二聚誘導(dǎo)焚光偏振(dimerizationinducedfluorescencepolarization,DIFP)通過(guò)檢測(cè)干擾素-Y的同型二聚體化來(lái)獲得。在任意一種情況下，檢測(cè)和測(cè)定數(shù)量將低至或小于6pg/ml。當(dāng)將本發(fā)明的方法用于所提供的實(shí)施例材料中，分析檢測(cè)的極限為6pg/ml，做出改進(jìn)后，該值可以更低。如果樣品材料被稀釋，在所述樣品中的IP-10的濃度將降低，當(dāng)仍然可以檢測(cè)到(參見實(shí)施例9)。其它的試驗(yàn)方案和其它的參數(shù)將導(dǎo)致其它的數(shù)值，這能根據(jù)本文的教導(dǎo)而被測(cè)定。用來(lái)測(cè)定生物學(xué)標(biāo)記物例如IP-10的技術(shù)多種技術(shù)以^皮本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。免疫效應(yīng)物的存在或存在水平可以通過(guò)ELISA、Luminex、ELISPOT、基于mRNA的技術(shù)例如RT-PCR或胞內(nèi)流式細(xì)胞術(shù)。流式熒光技術(shù)(Luminex)干擾素-y(IFN-y)已經(jīng)成為在傳染病免疫學(xué)，特別是TB免疫學(xué)的Thl應(yīng)答中的黃金標(biāo)準(zhǔn)。由于與開發(fā)用于Quantiferon商業(yè)的ELISA(參見實(shí)施例10)相比具有低的靈敏度，由Luminex測(cè)定的IFN-y是一種弱標(biāo)記物。然而，通過(guò)Luminex輕易地檢測(cè)到IP-IO，并能因而取代IFN-y作為L(zhǎng)uminex系統(tǒng)中的研究或篩選工具。在下列的實(shí)施例中所提供的數(shù)據(jù)是通過(guò)使用Luminex而產(chǎn)生的，這允許用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)溶液中分析物進(jìn)行多元分析。Luminex使用合適的技術(shù)通過(guò)結(jié)合不同比例的兩種熒光染料對(duì)在內(nèi)部對(duì)xMAP微球體進(jìn)行彩色編碼。每一套小珠都與不同的包被抗體(captureantibody)共軛。R-藻紅蛋白標(biāo)記的檢測(cè)抗體通過(guò)測(cè)量相對(duì)熒光強(qiáng)度允許了發(fā)生在微球體表面的抗原-抗體反應(yīng)的量化。該系統(tǒng)能測(cè)量許多小量的樣品，并且可以在一個(gè)50|il的樣品中同時(shí)對(duì)高達(dá)100種不同的分析物進(jìn)行測(cè)量。根據(jù)碧歐泉方案(Biosourceprotocol)得到目前的數(shù)據(jù)。簡(jiǎn)言之，從單個(gè)IP-10懸浮的小珠，以及IFN-y試劑盒在預(yù)濕潤(rùn)的過(guò)濾器96平板孔(platewells)中進(jìn)行結(jié)合。用洗滌溶液洗滌小珠兩次，并加入孵育緩沖液。樣品(在此4-50pl)在分析稀釋中按l:32、1:10、1:8或1:1進(jìn)行稀釋，并加入到平板上。該平板在室溫下，在滴定4反振動(dòng)器(titerplateshaker)上以600rpm孵育2小時(shí)。進(jìn)行兩次洗滌后，100pl的檢測(cè)抗體混合物加入到每個(gè)孔中，并將所述平板在滴定板振動(dòng)器上在室溫下培養(yǎng)l個(gè)小時(shí)。洗滌兩次后，將100pl的鏈霉親和素-R藻紅蛋白溶液(strepavidin-RPEsolution)加入到每個(gè)孔中。最終，孵育30分鐘并洗滌3次后，100pl的洗滌溶液加入到各個(gè)孔中，并將平板置于Luminex的XY平臺(tái)上。從各個(gè)孔中，對(duì)最少100個(gè)分析物特異性小珠進(jìn)行小珠熒光(bead-fluorescence)和RPE熒光(RPEfluorescence)分析。酶3f關(guān)免疫吸附測(cè)定(ELISA)在下列的一些實(shí)施例中所提供的數(shù)據(jù)是根據(jù)碧歐泉協(xié)議(Biosourceprotocol)通過(guò)使用ELISA而產(chǎn)生的。將樣品(5-50)加入到預(yù)裝載有IP-10抗體的96平底平4反的孔中。向所有的孔中加入50jiL的生物素共軛物(BiotinConjugate)。所述平板被包覆并且在向孔通氣前在室溫下培養(yǎng)3小時(shí)，并用工作洗滌緩沖液(WorkingWashBuffer)洗滌4次。然后將100的稀釋的鏈霉親和素-辣根過(guò)氧化物酶(Streptavidin-HRP)加入到所有的孔中，并且蓋上所述平板并在室溫下孵育30分鐘。然后在向各個(gè)孔中加入50pi的穩(wěn)定化的色原體(StabilizedChromogen)之前，向孔內(nèi)通氣并用工作洗滌緩沖液洗滌4次，并且將所述平板在室溫下避光孵育30分鐘。最后向各個(gè)孔中加入100^的停止液(StopSolution)，并且將平板在MOnm下在ELISA酶標(biāo)儀上進(jìn)行讀數(shù)。免疫色譜試驗(yàn)(ICT)免疫色譜試驗(yàn)(Immunochromatographictests,ICT)試驗(yàn)原則ICT(例如，側(cè)棒(lateralstick))是一種體外免疫診斷試驗(yàn)，該試驗(yàn)利用了初級(jí)抗體(Ab)并且1-4種對(duì)IP-10全部特異的二級(jí)抗體。所述初級(jí)抗體附著在膠體金上并且浸漬到樣品墊內(nèi)，該樣品墊具有在固定線路內(nèi)含有一種二級(jí)抗體的通道(lane)。第一步中，將所孵育的樣品加入到所述樣品點(diǎn)的左邊部分。血清或血漿將流入允許任何IP-10存在的所述通道以連接到膠體金標(biāo)記的初級(jí)抗體上。二級(jí)抗體在橫跨所述通道的隔膜的通道中固定。當(dāng)將卡封閉時(shí)，樣品和在所述墊的通道上的被標(biāo)記的初級(jí)抗體與隔膜的末端接觸。隨后，樣品和被標(biāo)記的初級(jí)抗體沿著隔膜通道穿過(guò)固定的二級(jí)抗體通道而移動(dòng)。試-3t洽釋與金標(biāo)記的初級(jí)抗體絡(luò)合的任意的IP-10被隔膜上的二級(jí)抗體捕獲，并在通道內(nèi)發(fā)生顏色交換。于是試驗(yàn)被詮釋為a.在色度的基礎(chǔ)上或者b.通過(guò)比較在應(yīng)答樣品(例如抗原刺激試驗(yàn)材料的血漿，如全血)上進(jìn)行的和在空白樣品上進(jìn)行的兩種試驗(yàn)，從抗原試驗(yàn)中色度的改變中減去空白試驗(yàn)中色度的改變并將該結(jié)果與參考進(jìn)行比較。試驗(yàn)的讀出裝置也可以使用計(jì)算機(jī)界面而自動(dòng)化或半自動(dòng)化。可以建立這種設(shè)備從而使自動(dòng)化的界面確定通道的色度的改變。感染本發(fā)明的一個(gè)方法涉及一種方法，其中，抗原特異性IP-10在參考水平以上的應(yīng)答說(shuō)明該哺乳動(dòng)物先前由于例如感染階段而遇到過(guò)該抗原或者先前遇到過(guò)產(chǎn)生對(duì)該抗原的免疫學(xué)交叉反應(yīng)性的其它抗原，所述感染階段例如是活動(dòng)性疾病、活動(dòng)性亞臨床感染、近期感染或潛伏性感染或接種疫苗。微生物根據(jù)本發(fā)明，所述感染可能由微生物所導(dǎo)致，例如但不限于細(xì)菌、寄生蟲、真菌、病毒、朊病毒和/或類病毒。在目前優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述孩史生物選自由分枝桿菌、革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌、李斯特菌、腸球菌、奈瑟菌、弧菌、密螺旋體(梅毒)、包柔氏螺旋體菌、螺旋體、衣原體、逆轉(zhuǎn)錄病毒(SIV、HIV-1、HIV-2)、巨細(xì)胞病毒、痘病毒、艾伯斯坦-巴爾病毒、腸道病毒、麻疹病毒、桿病毒(狂犬病)、風(fēng)滲病毒(風(fēng)滲(rubella)、黃病毒(登革熱、黃熱病)、皰滲病毒、帶狀皰滲病毒、丙型肝炎和乙型肝炎、利什曼蟲、弓形蟲、錐蟲、瘧原蟲(惡性癡原蟲、間日癡原蟲、卵形瘧原蟲、癡疾)、卡氏肺嚢蟲(PCP)、冠狀病毒(例如嚴(yán)重獲得性呼吸道綜合癥(SARS))、埃博拉或馬爾堡以及各種的線蟲、吸蟲所組成的組中。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述微生物選自由分枝桿菌、利什曼原蟲、衣原體、錐蟲和血吸蟲所組成的組。在其中一種或多種感染是或者曾經(jīng)是由分枝桿菌？I起的情況下，所述分枝桿菌屬于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合有機(jī)體(complexorganisms)(結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌(M.bovis)以及非洲分枝桿菌(M.africanum))，分枝桿菌中差別區(qū)域(RD1)沒有被刪除(堪薩斯分枝桿菌、蘇加分枝桿菌、海分枝桿菌、轉(zhuǎn)黃分枝桿菌(M.flavescens)、胃氏分枝桿菌(M.gastrii)),人致病性分枝桿菌(鳥分枝軒菌(M.avium)和麻風(fēng)分枝桿菌(M.lepra))以及其它非結(jié)核分枝桿菌。因此，在目前優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述分枝桿菌為結(jié)核分枝桿菌。在其中感染是或者曾經(jīng)是由于衣原體所導(dǎo)致的情況中，所述衣原體可以選自由沙眼衣原體、鼠型沙眼衣原體(C.muridarum)和豬衣原體(C.suis)、肺炎衣原體或鸚鷸熱衣原體(C.psittaci)所組成的組中。在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式中，所述衣原體為沙眼衣原體。接種疫苗本發(fā)明的一個(gè)方法涉及一種方法，其中，抗原依賴IP-10在參考水平以上44的應(yīng)答說(shuō)明該哺乳動(dòng)物由于對(duì)本文所涉及的任一微生物進(jìn)行了接種疫苗，因而先前遇到過(guò)該抗原或者先前遇到過(guò)產(chǎn)生對(duì)該抗原的免疫學(xué)交叉反應(yīng)性的其它抗原。對(duì)建立在基于無(wú)活性材料基礎(chǔ)上的疫苗的應(yīng)答可能導(dǎo)致低水平的抗原特異性IFN-Y的釋放，并且由于IP-10大量釋放，它能用于檢測(cè)在臨床前、臨床試驗(yàn)并在隨后的慣用設(shè)定中疫苗的應(yīng)答。結(jié)核結(jié)核(通?？s寫為TB)是由結(jié)核分枝桿菌細(xì)菌導(dǎo)致的傳染病，它通常作用在肺部(肺結(jié)核)但也能感染體內(nèi)所有其它的器官，例如總數(shù)神經(jīng)系統(tǒng)(腦膜炎)、淋巴系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)(粟粒性結(jié)核(miliarytuberculosis))、生殖系統(tǒng)、骨骼和關(guān)節(jié)。結(jié)核分枝桿菌感染還可以保持無(wú)癥狀階段，這通常被知曉為潛伏性、休眠的或亞臨床TB感染。在目前優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法涉及一種診斷并監(jiān)測(cè)各種，例如結(jié)核的不同的表現(xiàn)(活動(dòng)性結(jié)核病、活動(dòng)性顯微鏡學(xué)陽(yáng)性或顯微鏡學(xué)陰性TB感染、潛伏性結(jié)核感染以及新近結(jié)核感染)的方法。該免疫分析基于通過(guò)與存在抗原的細(xì)胞(例如單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞)反應(yīng)的抗原特異性T淋巴細(xì)胞對(duì)所選擇的MTB的分泌蛋白的肽序列進(jìn)行應(yīng)答來(lái)評(píng)價(jià)IP-10的產(chǎn)生。這些肽序列由于其免疫原性和它們的特異性而被選擇，并且潛在地，能類似地^使用其它的肽。為了對(duì)診斷具有痰-陽(yáng)性肺結(jié)核的患者健康接觸的近期感染、為了用潛伏期感染診斷健康、為了在肺結(jié)核或肺外結(jié)結(jié)核的情況下監(jiān)測(cè)催治療的應(yīng)答，并為了區(qū)別潛伏性感染和活動(dòng)性結(jié)核病狀態(tài)，能用所述方法和試劑盒診斷活動(dòng)性結(jié)核病。衣原體衣原體是一種對(duì)于被任何屬于衣原體門的細(xì)菌所感染的常用術(shù)語(yǔ)。沙眼衣原體是引發(fā)人眼和生殖器疾病的主要的感染。通常發(fā)現(xiàn)衣原體僅在人體細(xì)胞內(nèi)存活，并且是全世界上最普遍的通過(guò)性傳播在人群中的傳染之一一美國(guó)每年發(fā)生大約4百萬(wàn)起衣原體感染的病例。不是所有被感染的人表現(xiàn)出感染癥狀。感染有衣原體的大約全部男性的一半以及全部女性的3/4沒有癥狀并且不知道他們被感染了。這種感染能變得嚴(yán)重，但如果及時(shí)發(fā)現(xiàn)可以通過(guò)抗生素而易于治愈。同樣重要地，眼睛的衣原體感染是世界上導(dǎo)致可預(yù)防的失明最普遍的原因。在目前優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種"^斷并監(jiān)測(cè)衣原體的方法。該免疫分析基于通過(guò)與存在抗原的細(xì)胞(例如單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞)反應(yīng)的抗原特異性T淋巴細(xì)胞對(duì)粗抗原(crudeantigens)或純化的抗原(例如但不限于肽)進(jìn)行應(yīng)答來(lái)評(píng)價(jià)IP-10的產(chǎn)生。潛在地，這些肽序列能由于其免疫原性和它們的特異性而被選擇，并且能類似地使用其它的肽。抗原對(duì)適于本發(fā)明的抗原(也被稱為受試抗原和為評(píng)價(jià)而選擇的抗原)的選擇取決于本領(lǐng)域技術(shù)人員要評(píng)價(jià)的感染的類型，因此，所選擇的抗原是與疾病相關(guān)的。例如說(shuō)，當(dāng)監(jiān)測(cè)MTB感染時(shí)，任何可利用的MTB抗原可以產(chǎn)生必要的應(yīng)答并且反之亦然。許多抗原已經(jīng)用于現(xiàn)有的商業(yè)分析中。應(yīng)該理解的是，上述和下文討論的與根據(jù)本發(fā)明的所述受試抗原相關(guān)的任何特征和/或方面適用于為評(píng)價(jià)而選擇的抗原的類似表達(dá)。其中，認(rèn)為所述感染與結(jié)核有關(guān)，所述抗原或至少一種抗原選自由RD-1抗原、ESAT-6、CFPIO、TB7.7、抗原85(Ag85)、牛分枝桿菌熱休克蛋白65(HSP-65)、抗原85A(Ag85A)、抗原85B(Ag85B)、結(jié)核桿菌分泌蛋白51(MPT51)、結(jié)核桿菌分泌蛋白64(MPT64)、TB10.4、結(jié)核分枝桿菌8.4(Mtb8.4)、晶狀體球蛋白(hspX)、Mtbl2、Mtb9.9、Mtb32A、磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體系統(tǒng)國(guó)l(PstS國(guó)l)、PstS-2、PstS-3、MPT63、Mtb39、Mtb41、MPT83、71千道爾頓、前腦啡肽原68(PPE68)和LppX所組成的組。在目前優(yōu)選的實(shí)施方式中，抗原或至少一種抗原選自由ESAT-6、CFP-IO、TB7.7、Ag85、HSP65和RD-1抗原所組成的組中。在本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，所述抗原為ESAT-6。在本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，所述抗原為CFP-IO。在本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，所述抗原為TB7.7。在本發(fā)明目前優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述抗原為RD-1抗原。許多研究機(jī)構(gòu)致力于確認(rèn)由單個(gè)傳染原嚴(yán)格表達(dá)的抗原，所謂的微生物特異性或疾病特異性抗原。在結(jié)核分枝桿菌的病例中，特異性抗原在不同的感染階段中表達(dá)，例如但不限于休眠的階段、潛伏的階段、活動(dòng)性的階段、新近的階段、肺部的階段、肺外的階段、局部的階段或治愈階段?？梢允褂蒙鲜隹乖M(jìn)行本發(fā)明的方法，從而提供用來(lái)確定這些特異性階段的工具(例如，結(jié)核分枝桿菌潛伏性感染)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，當(dāng)產(chǎn)生應(yīng)答樣品時(shí)，可以加入來(lái)自同一微生物的多種抗原。通過(guò)加入具有不同組織類型優(yōu)選性的多種抗原，分析的強(qiáng)度增加了。在結(jié)核的病例中，ESAT-6、CFP-10和TB7.7蛋白質(zhì)抗原肽的結(jié)合增加了試驗(yàn)覆蓋最寬組織類型的可能，并因此提供了在不同的患者人群中的更強(qiáng)并且更可靠的測(cè)試結(jié)果。其中，所述感染被認(rèn)為是與衣原體相關(guān)的，所述抗原或至少一種所述抗原選自由血清型D提取物(SerovarDextract)、主要外膜蛋白(majoroutermembraneprotein,MOMP)、富含半月光胺酸的夕卜膜蛋白(cysteine-richoutermembraneproteins,OMPs)、外膜蛋白2(OMP2)、OMP3、多態(tài)OMPs(Poly-morphicOMPs,POMPs)、衣原體肺炎的二磷酸腺苷/三磷酸腺苷移位酶、孑L蛋白B蛋白(porinBprotein,PorBs)和CT521所組成的組中。如從本發(fā)明所顯示地，感染原可以不同。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述抗體或至少一種所述抗體選自由以下所組成的組中固定的上l便毛體(fixed-epimastigotes)、固定的錐鞭毛體(fixed-trypomastigotes)、分裂的上鞭毛體(disrupted-epimastigotes)、分裂的錐鞭毛體(disrupted-trypomastigotes)、從上鞭毛體純化的抗原部分、從上鞭毛體半純化的抗原部分、錐鞭毛體排泄-分泌物抗原(trypomastigoteexcretory—secretoryantigens，TESA)、顯性變異抗原型(variableantigentype,VAT)、表面可變并唐蛋白(variablesurfaceglycoprotein,VSG)、例如TS13的反式唾液酸酶(trans-sialidase,TS)、無(wú)鞭毛體表面蛋白國(guó)2(amastigotesurfaceprotein-2,ASP2)、腎膜蛋白-llm(KMP-llm)、直腸腺瘤(CRA)、Ag30、JL8、T細(xì)胞抗原受體(TCR27)、Agl、JL7、H49、TCR39、PEP-2、Ag36、JL9、多抗原肽(MAP)、胎兒彎桿菌表面蛋白(SAPA)、TCNA、Agl3、TcD、B12、TcE、JL5、A13、1F8、Tc-24、Tc畫28、Tc-40、Cy-hsp70、MR-HSP70、Grp-hsp78、癌胚抗原(CEA)、C反應(yīng)蛋白(CRP)、SA85-U、FCaBP(鞭毛狀4丐結(jié)合蛋白(flagellarCa2+-bindingprotein))、FL-160(160kDa的孝便毛表面蛋白(flagellarsurfaceprotein))、以及FRA(孝便毛重復(fù)蛋白抗原(flagellarrepetitiveantigen))，該抗原與4偉蟲有關(guān)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述抗原或至少一種所述抗原選自由固定的上鞭毛體、固定的錐鞭毛體、分裂的上鞭毛體、分裂的錐鞭毛體、從上鞭毛體純化的抗原部分、從上鞭毛體半純化的抗原部分、錐鞭毛體排泄-分泌物抗原(TESA)、顯性變異抗原型(VAT)、表面可變糖蛋白(VSG)、例如TS13的反式唾液酸酶(TS)、無(wú)鞭毛體表面蛋白-2(ASP2)、FCaBP(鞭毛狀釣結(jié)合蛋白)、FL-160(160kDa的鞭毛表面蛋白(flagellarsurfaceprotein))、以及FRA(鞭毛重復(fù)蛋白抗原(flagellarrepetitiveantigen))所組成的組中。在其中所述感染與血吸蟲有關(guān)時(shí)，所述抗原至少一種所述抗原選自由分裂的血吸蟲卵、排泄/分泌4唐蛋白(excreted/secretedglycoproteins,ES)、夕卜被糖蛋白(tegumentalglycoproteins,TG)、可溶'1"生蟲卵^L原(solubleeggantigen,SEA)、可溶性曼氏血吸蟲提取物(solubleextractofS.mansoni,SWAP)、鑰孑L血藍(lán)蛋白(keyholelimpethaemocyanin,KLH)、RP26、Sj31、Sj32、副肌J求蛋白(paramyosin)、Sm62-IrV5、Sm37-SG3PDH、Sm28-GST、Sml4-FABP、PR52-細(xì)絲蛋白、PL45-磷酸甘油酸酯激酶、PN18-親環(huán)素、MAP3、Sm23、MAP4、Sm28-TPI、Sm97、雞傳染性貧血因子(CAA)、結(jié)腸癌抗原(CCA)以及曼氏血吸蟲熱4木克蛋白70(Schistosomamansoniheatshockprotein70)所組成的組。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述抗原或至少一種所述抗原選自由排泄/分泌糖蛋白(ES)、外被糖蛋白(TG)、可溶性蟲卯抗原(SEA)、可溶性曼氏血吸蟲提取物(SWAP)、鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)以及RP26所組成的組中。對(duì)于利什曼原蟲，所述抗原或至少一種所述抗原選自由分裂的鞭毛體、利什曼原蟲素、rGBP、rORFF、rgp63、rK9、rK26、rK39、PN18-親環(huán)素、MAP3、Sm23、MAP4、Sm28-TPI、Sm97、CAA和CCA所組成的組中。事實(shí)上，根據(jù)本發(fā)明，任何一種對(duì)進(jìn)行分析的物種具有抗原特異性的抗原都是有用的。在另一種優(yōu)選實(shí)施方式中，可以將一系列的來(lái)源于不同疾病的不同的抗原進(jìn)行結(jié)合以使篩選工具對(duì)個(gè)體疾病具有低特異性，而對(duì)"感染"具有高靈敏度。與例如來(lái)自于士兵們?cè)谌蝿?wù)過(guò)程中被暴露到的微生物(例如，瘧疾、結(jié)核、利什曼原蟲、血吸蟲和/或錐蟲)的抗原的調(diào)色板(palette)結(jié)合的試劑盒將使得醫(yī)生能進(jìn)行一種快速篩選試驗(yàn)來(lái)代替一系列的不同試驗(yàn)。在本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式中，結(jié)合的試劑盒可以含有來(lái)自感染器官(例如引起盆腔炎的奈氏種或衣原體種)的不同的微生物的抗體，或者含有來(lái)自引起常見癥狀的傳染原的抗體(例如由彎曲菌和志賀氏桿菌感染引起的可治療的腹瀉，可以與由例如輪狀病毒引起的不可治療的腹瀉區(qū)別開來(lái))。受試者所涉及的"受試者"包括人類或非人類物種，包括靈長(zhǎng)類、家畜類動(dòng)物(例如綿羊、牛、豬、馬、驢、山羊)、實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)動(dòng)物(例如小鼠、大白鼠、兔子、天竺鼠、倉(cāng)鼠)、伴侶動(dòng)物(例如狗、貓)、鳥類物種(例如禽鳥、籠鳥(aviarybird))、爬行動(dòng)物和兩棲動(dòng)物。因此，本發(fā)明能用于人類藥物，并能應(yīng)用于牲畜和獸醫(yī)學(xué)以及野生動(dòng)物?？偢疟菊f(shuō)明任何對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的涉及不是，也不應(yīng)該被視為接受該現(xiàn)有技術(shù)的任何形式的建議形成了在任何國(guó)家的公知常識(shí)。結(jié)合于此。顯然地，本發(fā)明的一個(gè)方面的優(yōu)選特征和特性可以應(yīng)用到本發(fā)明的其它方面中。本發(fā)明可以以其它特定的形式進(jìn)行實(shí)施而不碑林其實(shí)質(zhì)或基本特性。因此，前述的實(shí)施方式被考慮為進(jìn)行全面地闡述而不是對(duì)描述與此的發(fā)明進(jìn)行限制。因此本發(fā)明的范圍在隨附的權(quán)利要求書中而不是通過(guò)以上的描述進(jìn)行說(shuō)明，并且通過(guò)在此的引用應(yīng)該包括在權(quán)利要求等同的意思和范圍內(nèi)的所有改變。應(yīng)該理解的是，以上所討論的與根據(jù)本發(fā)明的方法相關(guān)的任何特征和/或適用于類似的方法或診斷。在整個(gè)說(shuō)明書中所使用的單詞"含有(comprise)",或例如"comprises"或"comprising"的變形將被理解為表示包含了所陳述的要素、整體或步驟或要素、整體或步驟的組，但不排出任何其它的要素、整體或步驟，或者要素、49整體或步驟的組。下面，將通過(guò)以下的非限制性附圖和實(shí)施例的方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行描述。圖1血漿中的IFN-y、HMO以及IFN-y之間的比較關(guān)系。用生理鹽水(未刺激的)(la)、結(jié)核分枝桿菌特異性抗原(lb)或促細(xì)胞分裂原(lc)中的一種刺激全血20-24小時(shí)。通過(guò)ELISA(IFN-y)或多元才喿作(IP-10)測(cè)量血漿上清液中細(xì)胞因子的產(chǎn)生。圖2分別由QuantiferonELISA和Luminex測(cè)得的抗原特異性IFN-y和IP-10細(xì)胞因子產(chǎn)生(即，空白抗原(Ag-Nil))之間的比較。單位(Values)為pg/mL。直線表示表2中范圍的中值。圖3反應(yīng)了IP-10分析的靈敏度和特異性的接收器操作特征曲線(ROCcurve)。X軸表示l-特異性，Y軸表示靈敏度。圖4抗原特異性IP-10和IFN-y的產(chǎn)生之間的比傘支。IFN-y未經(jīng)稀釋而進(jìn)行測(cè)量，而IP-10以l:8稀釋進(jìn)行分析。圖5抗原特異性FN-y和IP-10/CXCL10的在Quantiferon試驗(yàn)為陰性或不確定的患者內(nèi)的產(chǎn)生。將6位管內(nèi)Quantiferon(QFT-IT)陰性以及1位QFT-IT不確定的TB患者的全血用生理鹽水或結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激20-24小時(shí)。通過(guò)ELISA(IFN-y)或多元梯:作技術(shù)(IP-10)測(cè)量血漿上清液中細(xì)胞因子的產(chǎn)生。特異性抗原的產(chǎn)生由被該抗原刺激的樣品減去未經(jīng)刺激的樣品來(lái)表示。直線表示了中值。(威氏符號(hào)秩次檢驗(yàn)(Wilcoxonsignedranktest))實(shí)施例在下面的實(shí)施例中，使用結(jié)核分枝桿菌和沙眼衣原體感染作為試驗(yàn)原理的例子來(lái)對(duì)IP-10分析進(jìn)行證實(shí)。一般方法在實(shí)施例1-17中，我們使用全血刺激來(lái)證實(shí)所述原理，在實(shí)施例18中，我們使用純化的單核細(xì)胞(PBMCs)。全血刺激1.將體積為1ml的肝素化血液抽出到三個(gè)真空采血管中(Cellestis,澳大利亞)，所述釆血管涂敷有a)生理鹽水，以產(chǎn)生未受刺激的樣品或空白樣品(可互換使用)b)得自蛋白質(zhì)ESAT-6、CFP-10和TB-7.7的肽以產(chǎn)生抗原樣品(Ag)c)植物凝集素，以產(chǎn)生促細(xì)胞分裂原樣品。2.將上述采血管在37。C下孵育20-24小時(shí)。3.將上述采血管以2000rpm離心分離10分鐘4.收集血漿并在或者低于-40。C以下冷凍分離外周血單核細(xì)胞(PBMCs)1.通過(guò)密度梯度離心(淋巴細(xì)胞分離劑；奈克明制藥(Nycomed))將PBMCs從全血中分離，并在液氮中冷凍直到使用2.將PBMCs解凍并在RPMI1640中進(jìn)行再懸浮，補(bǔ)充加入1%的青霉素/鏈霉素、1%的非必需氨基酸、1%的谷氨酰胺、1%的丙酮酸(pyrovat)、1%的羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、和10%的人AB血清(本地血庫(kù)，瑞格紹斯佩泰立特(Rigshospitalet)，哥本哈根)，3.通過(guò)苯胺黑染色測(cè)定細(xì)胞的成活力和數(shù)量4.以總體積為100pL中1.25xl()S個(gè)細(xì)胞/孔，在圓底^:量滴定板(能肯(Nunc))上培養(yǎng)上述細(xì)胞，一式三份制備沙眼衣原體血清型D抹提取抗原1.所述沙眼衣原體血清型D抹(UW-3/Cx)在人宮頸癌細(xì)胞229(HeLa229cell)內(nèi)繁殖并使用多洗提技術(shù)(multielutiontechnique)分成30窄分子量組分。2.將SPG(蔗糖-磷酸鹽-谷氨酸)緩沖液中的沙眼衣原體血清型D在5130,000下離心分離30分鐘3.將沉淀(Pellet)以1:1在無(wú)菌水和利姆里還原樣品緩沖液(laemmli-reducingsamplebuffer)中進(jìn)行再懸浮，然后煮沸5分鐘。4.重復(fù)超聲處理后，將懸浮液在在30,000下離心分離30分鐘。5.將懸浮的粗沙眼衣原體血清型D抹提取物用作為抗原。用血清型D抗原刺激PBMC1.如以上所描述地將PBMCs涂敷在平板上(plated),并用以下進(jìn)行刺激a.2pg/mL的血清型D抗原以產(chǎn)生抗原樣品b.無(wú)抗原以產(chǎn)生未被刺激樣品2.將細(xì)胞在加濕的空氣(5%(:02和95%空氣)中在37。C下進(jìn)行培養(yǎng)3.5天后收集懸浮物用于IP-10的定量4.收集血漿并在或^f氐于-4(TC下冷凍生物標(biāo)記物的測(cè)量Luminex:在luminex平臺(tái)上并根據(jù)碧歐泉方案(Biosourceprotocol)進(jìn)行IP-10和/或MCP-1和/或IL-2的測(cè)量。1.來(lái)自單個(gè)IP-10、IL-2、MCP-2和/或IFN-y試劑盒的懸浮的小珠在預(yù)濕潤(rùn)的過(guò)濾器96平板孔中進(jìn)行結(jié)合。2.將所述小珠用洗滌溶液洗滌兩次，并加入孵育緩沖液。3.將樣品在分析稀釋液中以1:1、1:8、1:10或1:20進(jìn)行稀釋，并向所述平板加入100pl。4.在室溫下，將所述平板在滴定板振動(dòng)器上以600rpm孵育2小時(shí)。5.進(jìn)行兩次洗滌后，100lil的檢測(cè)抗體混合物加入到每個(gè)孔中，并將所述平板在滴定板振動(dòng)器上在室溫下培養(yǎng)1個(gè)小時(shí)。6.洗滌兩次后，將100pi的鏈霉親和素-R藻紅蛋白溶液(strepavidin-RPEsolution)加入到每個(gè)孔中。7.孵育30分鐘并洗滌3次后，100pi的洗滌溶液加入到各個(gè)孔中，并將平板置于Luminex的XY平臺(tái)上。8.從各個(gè)孔中，對(duì)最少100個(gè)分析物特異性小珠進(jìn)行小珠熒光和RPE熒光分析。IP國(guó)10ELISA使用來(lái)自碧歐泉(英杰(Invitrogen)，美國(guó))的一步型ELISA(singlesteptypeELISA)進(jìn)行IP-10測(cè)量。IFN-yELISA使用一步夾心型ELISA(singlestepsandwichtypeELISA)—QuantiferonIFN-yELISA(Cellestis,澳大利亞)進(jìn)行IFN，測(cè)量。使用制造商提供的軟件分析IFN-y的水平(版本2.50)。該CellestisELISA試劑盒在國(guó)際單位(U)下操作(1單位/mL相應(yīng)于50pg/mL的濃度)，在現(xiàn)有的樣品中，將ELISAIFN-Y結(jié)果表示為pg/ml。Quantiferon試驗(yàn)(QFT-IT試驗(yàn))用QuantiferonELISA對(duì)IFN-Y產(chǎn)生進(jìn)行測(cè)量。根據(jù)制造商說(shuō)明，未被刺激的樣品的IFN-y應(yīng)答從用結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激的樣品和在促細(xì)胞分裂原樣品中的IFN-y應(yīng)答中減去。如果對(duì)于特定抗原的應(yīng)答^17.5pg/ml(0.35IU/ml)并^25。/。的未被刺激的值，則無(wú)論促細(xì)胞分裂原刺激的IFN-y應(yīng)答如何，認(rèn)為該QTF-IT結(jié)果為"P曰性"；如果對(duì)特定抗原的應(yīng)答<17.5pg/ml(0.35IU/ml)并且促細(xì)胞分裂原刺激的IFN-y應(yīng)答^25pg/ml(0.5IU/ml)，則認(rèn)為該QTF-IT結(jié)果為"陰性"。如果對(duì)特定抗原的應(yīng)答<17.5pg/ml(0.35IU/ml)并且促細(xì)胞分裂原刺激的IFN-y應(yīng)答S25pg/ml(0.5IU/ml);或者在未被刺激樣品中的IFN-y應(yīng)答^400pg/ml(8IU/ml)，而不考慮抗原特異性或者促細(xì)胞分裂原刺激的應(yīng)答，認(rèn)為該QTF-IT結(jié)果為"不確定的"。實(shí)施例1通過(guò)來(lái)自感染有結(jié)核分枝桿菌的患者的具有結(jié)核分枝桿菌特異性抗原的全血刺激而誘導(dǎo)高水平的血漿IP-IO。對(duì)來(lái)自丹麥(n=2)和幾內(nèi)亞比索(n=9)的12位具有痰陽(yáng)性肺結(jié)核患者和11位健康的非TB暴露的丹麥對(duì)照(年輕的醫(yī)生、來(lái)自希維杜爾醫(yī)院(HvidovreHospital)的傳染病部門和臨床研究單位的研究人員和學(xué)生)的全血進(jìn)行測(cè)試。沒有患者是HIV陽(yáng)性。該研究被哥本哈根和弗雷德里克斯堡公社(CopenhagenandFrederiksbergCommune)的倫理委員會(huì)以及幾內(nèi)亞比索的倫理委員會(huì)所證實(shí)。結(jié)果通過(guò)LuminexIP-10、LuminexIFN-y或商業(yè)的Quantiferon-IFN-yELISA測(cè)得的用空白、抗原或促細(xì)胞分裂原孵育的全血樣品的血漿中IFN-y和IP-10的水平(中值和范圍)列于表l。用結(jié)核分枝桿菌特異性抗原孵育之后IP-10的產(chǎn)生與患者中的結(jié)核分枝桿菌感染強(qiáng)烈相關(guān)；用感染結(jié)核分枝桿菌的患者的結(jié)核分枝桿菌特異性抗原進(jìn)行刺激過(guò)程中，誘導(dǎo)了全血培養(yǎng)物的血漿中非常高的IP-10水平，1025pg/ml(范圍497.3-2080.4pg/ml)，而在11位沒有已知接觸或者信號(hào)感染有結(jié)核分枝桿菌的健康的丹麥個(gè)體(對(duì)照)的全血培養(yǎng)物中，發(fā)現(xiàn)IP-10水平非常低，為40.4pg/ml(范圍:19,7-158.8)。這兩組之間的差別非常顯著，p<0.0001表示IP-10釋放確實(shí)為抗原誘導(dǎo)。1024pg/ml(范圍497-2080pg/ml)的抗原刺激的IP-10的量極大地高于通過(guò)ELISA測(cè)定的IFN-y的223.5(99-1283pg/ml)和Luminex90.7pg/ml(37-464pg/ml)(p=0.01和0.001)的水平。與IP-10相比，極大降低的IFN々血漿水平是通過(guò)Qunatiferon-ELISA所測(cè)定的，但是在TB感染或非TB感染之間的差別仍然顯著。通過(guò)Luminex測(cè)定的IFN-y甚至比通過(guò)QFT-IFN-yELISA測(cè)定的IFN-"y更低，并將因此不再進(jìn)一步討論。結(jié)論P(yáng)-10是對(duì)結(jié)核分枝桿菌的高度特異性標(biāo)記物，當(dāng)全血來(lái)自用結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激感染的人時(shí)。由于IP-10的高水平釋放，它能更便于進(jìn)行測(cè)量，并且具有極大的潛力作為更加靈敏的標(biāo)記物。表1在生理鹽水、抗原或促細(xì)胞分裂原刺激的全血的血漿中產(chǎn)生的IFN-y和IP-10(pg/ml)a，所述全血來(lái)自對(duì)照(n-ll)TB患者(n-12)IFN-y(ELISA)生理鹽水8,5(6.5-11.5)10.3(6.5-134.5)抗原8.9(5.0-14,0)223.5(99.0-1283.0)b促細(xì)胞分裂原1613.0(45.5-1798.5)272.8(31.5-1750.5)IFN-y(多元)生理鹽水5.0(5.0-11.5)5.0(5.0-70.2)抗原5.0(5.0-11.8)90.7(37.3-464.2)b促細(xì)胞分裂原291.9(5.0-2980.7)160.9(5.0-2913.4)IP陽(yáng)IO生理鹽水27.1(17.7-140.6)150.9(61.1扁991.9)c抗原40.4(19.7-158.8)1025(497.3誦2080.4)b促細(xì)胞分裂原993.5(164.0畫>2800)843.0(384.4-2587.9)表1.全血培養(yǎng)物中的IFN-y和IP-10的產(chǎn)生全血用生理鹽水(未被刺激)、結(jié)核分枝桿菌特異性抗原或促細(xì)胞分裂原進(jìn)行刺激20-24小時(shí)。通過(guò)ELISA(IFN-y)和多元(IFN-y，IP-10)測(cè)量產(chǎn)生的細(xì)胞因子。a值是中位數(shù)(范圍。b是顯著辨別(P<0.0001)。e是顯著差別(P<0.0005)。d為顯著差別(P<0.008)?？唆斔箘P-沃利斯^r驗(yàn)(Kruskal-Wallistest)。實(shí)施例2在未被刺激的全血培養(yǎng)物(空白樣品)中提高的IP-IO自發(fā)性釋放，該全血來(lái)自具有活動(dòng)性TB感染的患者；IP-10作為對(duì)活動(dòng)性疾病的標(biāo)記物。如從表1中可以看出，與健康對(duì)照相比(27.1pg/ml(17.7-140.6))p=0.0005,在未被刺激的全血樣品(空白)中(150.9pg/ml(61.1-991.9))具有活動(dòng)性的肺結(jié)核患者具有5.6倍更高的IP-10血漿水平。在具有活動(dòng)性肺結(jié)核的來(lái)自幾內(nèi)亞比索和丹麥患者之間，在空白血漿中的IP-10沒有顯著的差異(p=0.67)。結(jié)論這說(shuō)明了決定與抗原刺激的IP-10釋放結(jié)合的自發(fā)性IP-10釋放能用于區(qū)別健康個(gè)體和具有活動(dòng)性TB的患者。實(shí)施例3IFN-y和IP-10釋放之間的關(guān)系IFN-y和IP-10在全血培養(yǎng)物中的釋放之間具有有力的聯(lián)系，但是IP-10具有更大的強(qiáng)度。在空白刺激、抗原刺激或促細(xì)胞分裂原刺激后，個(gè)體對(duì)IP-10進(jìn)行應(yīng)答，并且相應(yīng)的ELISAIFN-y在圖la-c中示出。在IP-10和ELISAIFN-y在抗原刺激的全血的血漿的水平之間具有有力的聯(lián)系(斯皮曼(spearman)r=0.87,95%C.I0.71-0.95，p<0.0001)(圖lb)，并在促細(xì)胞分裂原刺激的全血的血漿中的水平也有聯(lián)系，雖然不再相同的水平上(r=0.54，95%C.I.0.15-0.78,p=0.008)(圖lc)。結(jié)論IP-10和IFN-y在全血培養(yǎng)物中的釋放相關(guān)聯(lián)，但是IP-IO具有更高的強(qiáng)度。這4吏得在體外TB試驗(yàn)中IP-10作為比IFN-y更好的標(biāo)記物。實(shí)施例4抗原特異性IP-10的產(chǎn)生比抗原特異性IFN-y的產(chǎn)生要更高為了確定對(duì)存在于培養(yǎng)物中的抗原進(jìn)行應(yīng)答所釋放的細(xì)胞因子的量(即，抗原特異性(Ag-特異性))?？乖禺愋约?xì)胞因子應(yīng)答被計(jì)算為△值(deltavalue)(=在抗原刺激的全血培養(yǎng)物中的細(xì)胞因子的產(chǎn)生減去未被刺激的全血培養(yǎng)物的血漿中釋放的量)。該△值允許將抗原特異性IFN-y與IP-10細(xì)胞因子的產(chǎn)生進(jìn)行比較。如圖2所示，IP-10分析測(cè)量到比抗原特異性IFN-y(216.5pg/ml(80.5-1273.0pg/ml))p=0.006(曼-懷二氏檢驗(yàn)(Mann-Whitney))更高的抗原特異性IP-10的值(870.4pg/ml(260.5-1575.9pg/ml))。中值和范圍列于表2中。結(jié)論IP-10以更高量釋放(p=0.006)，因此IP-10易于測(cè)量并是比IFN-y更好的標(biāo)記物。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>表2.分別通過(guò)QuantiferonELISA和Luminex測(cè)得的抗原特異性INF-y和IP-10細(xì)胞因子產(chǎn)生的比較(克魯斯凱-沃利斯檢驗(yàn))。實(shí)施例5IP-10分析的非常高靈*丈度和特異性使用TB作為試驗(yàn)原理的例子證實(shí)了IP-10分析的非常高的靈敏度和特異性。本發(fā)明所描述的IP-10分析的高靈敏度和特異性使用基于抗原特異性IP-10(抗原刺激的減去空白)的值的水平的ROC曲線分析進(jìn)行測(cè)定。目前的ROC曲線分析建立在實(shí)施例1中所描述的12位TB患者和11位健康對(duì)照的基礎(chǔ)上。在圖3中證實(shí)了IP-10試驗(yàn)完美地將具有活動(dòng)性肺結(jié)核和健康對(duì)照分隔開來(lái)。在該試驗(yàn)中，IP-10試驗(yàn)具有1.0的曲線下面積(AreaUndertheCurve,AUC)。結(jié)論IP-10分析用于結(jié)核分枝桿菌感染的診斷表現(xiàn)出100%的靈敏度和100%的特異性，這是比目前用于體外TB試驗(yàn)中更好的性能。在此，IP-10試驗(yàn)?zāi)芮宄貐^(qū)分具有或不具有肺結(jié)核感染的患者區(qū)別開來(lái)。建立在這種有限的材料的&出上，能夠?qū)⒔刂裹c(diǎn)設(shè)定在27.6pg/ml到260.5pg/ml之間，并得到完全的分離。實(shí)施例6IP-10是用于免疫抑制下潛伏性TB的有效標(biāo)記物用空白、一種結(jié)核分枝桿菌特異性抗原(ESAT6)或促細(xì)胞分裂原(PHA)刺激來(lái)自6位具有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的正接受皮質(zhì)類固醇和氨曱蝶呤的患者的全血。使用以上描述的Luminex測(cè)量上清液中的IP-10的濃度。患者1-3為已知的Quantiferon試驗(yàn)陰性并且患者4-6為Quantiferon試驗(yàn)陽(yáng)性。如表3中所示，所有的患者盡管免疫抑制，都對(duì)陽(yáng)性促細(xì)胞分裂原對(duì)照展開的高水平的HMO應(yīng)答。在所有具有潛伏性TB(陽(yáng)性Quantiferon測(cè)試)的患者中》見察到了高水平的ESAT6刺激的IP-10(范圍668-2800pg/ml)。總而言之，基于IP-10的試驗(yàn)?zāi)苡糜谠\斷具有免疫抑制的患者中的潛伏性TB感染。表3患者QFT試驗(yàn)空白ESAT6促細(xì)胞分裂原1一3518411412-879528003-384728004+3428001589+63160528006+316681393表3.6位具有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患者用空白、ESAT-6(用于Quantiferon試驗(yàn)中的一種抗原)或促細(xì)胞分裂原進(jìn)行刺激，通過(guò)Luminex測(cè)量IP-lO。前三位患者為Quantiferon試驗(yàn)陰性并且后三位為Quantiferon試驗(yàn)陽(yáng)性。所有的患者都沒有活動(dòng)性的TB疾病癥狀，但忍受并經(jīng)歷對(duì)嚴(yán)重的RA的大量的免疫抑制藥物治療(用于生物治療，即，TNF-a阻斷劑)。實(shí)施例7IP-10作為已知在年輕時(shí)暴露在TB下的健康人中的潛伏性TB的標(biāo)記物使用以上描述的方法對(duì)兩位已知在年輕時(shí)暴露在TB下的人(RV和AKA),已證實(shí)PPD轉(zhuǎn)化并且沒有肺結(jié)核化學(xué)預(yù)防也沒有并存病(co-morbidity)測(cè)試IP-10應(yīng)答性。從以前的實(shí)現(xiàn)已知接收器為QuantiferonP日性。這兩位試驗(yàn)人員與強(qiáng)抗原(ESAT-6)反應(yīng)，特異性IP-10應(yīng)答(302.9pg/ml-916.1pg/ml)參見表9。試驗(yàn)人員RV每?jī)蓚€(gè)月試驗(yàn)兩次，試驗(yàn)結(jié)果有較好的重復(fù)性(數(shù)據(jù)未示出)。結(jié)論IP-10為用于潛伏性肺結(jié)核感染的有力的標(biāo)記物58表4<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>表4.對(duì)兩位已知在年輕時(shí)暴露在TB下的健康患者進(jìn)行肺結(jié)核抗原應(yīng)答(ESAT6)試驗(yàn)。實(shí)施例8在結(jié)合有抗原特異性IP-10釋^:的自發(fā)性IP-10水平能將具有或不具有潛伏性TB感染的健康人從具有活動(dòng)性TB的患者進(jìn)行區(qū)分。在實(shí)施例6(表3)中，顯示了自發(fā)性(空白)IP-10水平在潛伏性肺結(jié)核感染34pg/ml(范圍為31-63pg/ml))和具有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的未感染患者(38pg/ml(范圍35-87pg/ml))中都低。這些水平和在未感染健康供給者(27.1pg/ml(范圍17.7-140.6pg/ml)，表l)以及潛伏性感染的供給者(22.5-10.4pg/ml,表4)中相似地低。如果將所有的沒有活動(dòng)性肺結(jié)核的患者集合起來(lái)，并且將這些低水平與具有活動(dòng)性TB的患者中所發(fā)現(xiàn)的自發(fā)性IP-10釋放的高水平(150.9pg/ml(范圍61.1-991.9))(表1)相比，發(fā)現(xiàn)了高度顯著的差異性(p<0.0001，MannWhitney)結(jié)論自發(fā)性和抗原特異性IP-10釋放的結(jié)合能夠用于區(qū)分活動(dòng)性肺結(jié)核感染和潛伏性肺結(jié)核感染。實(shí)施例9可以進(jìn)行血漿樣品的稀釋而不會(huì)損失IP-10測(cè)試的靈敏度樣品的稀釋是通過(guò)加入稀釋溶液逐步降低濃度。已試驗(yàn)如果將孵育后的血漿樣品進(jìn)行稀釋，成倍地干擾了具有高和低IP-10濃度的血漿樣品之間關(guān)系，并且這種稀釋影響了IP-10分析的靈敏度。將樣品在由碧歐泉Luminex試劑盒(BiosourceLuminex)提供的試驗(yàn)稀釋液中進(jìn)行稀釋。如表5所示地，樣品的稀釋導(dǎo)致了在抗原和促細(xì)胞分裂原刺激的全血的血漿中以及未被刺激的(空白)全血血漿中IP-10水平逐步的降低。表5IP-10稀釋因子患者A患者B1:222.510.41:411.75.2創(chuàng)1:84.42.91:161.31.31:2631491賄1:44303271:83961971:16277130.細(xì)胞分裂原1:21:41:8325225139927541438《1:1689326表5.來(lái)自空白、抗原和促細(xì)胞分裂原刺激的全血的血漿在分析稀釋液中以1:2至1:16進(jìn)行稀釋，并且使用usingLuminex分析IP-10水平。在表5中發(fā)現(xiàn)甚至在樣品被稀釋了16倍之后，抗原特異性IP-10濃度仍保持非常高(275pg/ml和128pg/ml)。圖4表示了由7位對(duì)照和8為結(jié)核病患者對(duì)抗原特異性IFN-Y和IP-10進(jìn)行試驗(yàn)的應(yīng)答。對(duì)樣品進(jìn)行在l:8倍稀釋后，測(cè)量抗原特異性IP-IO的產(chǎn)生，并且在未稀釋的樣品中測(cè)量IFN-Y應(yīng)答。再次發(fā)現(xiàn)，高度特異性的IP-10值說(shuō)明IP-10是用于結(jié)核分枝桿菌感染(p=0.0003),甚至在l:8倍的稀釋下的有力的標(biāo)記物。此外，按1:8稀釋的IP-10值(中位數(shù)1097pg/ml(范圍225-3045pg/ml))比對(duì)未稀釋樣品材料所分析的IFN-y要高(中位數(shù)269pg/ml(范圍81-1273pg/ml))p=0.014(威氏配對(duì)符號(hào)牙失次檢-驗(yàn)(Wilcoxonmatchedpairstest))。這些結(jié)果證實(shí)了IP-10是非常有利的用于診斷分析的標(biāo)記物，并且該IP-10試驗(yàn)?zāi)苡糜谄渲袠悠凡牧戏浅Ｏ∩俚脑囼?yàn)設(shè)備中。這開拓了對(duì)IP-10試驗(yàn)的全60范圍的應(yīng)用，其中在僅能獲得非常少量的樣品材料情況下可以對(duì)樣品進(jìn)行稀釋(在稀釋之前或之后)(可直接地應(yīng)用于例如用于具有非常低血容量的嬰兒的商業(yè)產(chǎn)品)。結(jié)論這證明了可以對(duì)血漿樣品進(jìn)行稀釋而不會(huì)損失IP-10的靈敏度。實(shí)施例10IP-10比IFN-y更靈敏，并且改進(jìn)了肺結(jié)核感染在體外的診斷為了探究IP-10是否具有潛能以提高目前的QFT-IT試驗(yàn)的靈敏度，對(duì)IP-10在具有陰性或不確定的QFT-IT實(shí)驗(yàn)結(jié)果的肺結(jié)核患者中的應(yīng)答進(jìn)行了試驗(yàn)(關(guān)于患者特性和個(gè)體測(cè)量參見表6)。這些患者，換而言之都是在IFN-y試驗(yàn)中的假陰性。圖5表示了在7位具有TB和陰性或不確定QFT-IT試驗(yàn)的患者中的抗原特異性IP-10和IFN-y應(yīng)答。由QFT-ITELISA測(cè)定的抗原特異性IFN-y應(yīng)答的范圍為0-12.8pg/ml,反而抗原特異性IP-10應(yīng)答的范圍為0-532pg/ml。這7位患者中，3位也是具有抗原特異性應(yīng)答低于10pg/ml的IP-10無(wú)應(yīng)答，然而其它4位患者以IP-10水平為318pg/ml(范圍196-532pg/ml)的中值進(jìn)行應(yīng)答。這4位具有陰性QFT-IT試驗(yàn)和陽(yáng)性IP-10應(yīng)答的患者中，兩位是HIV共感染分別有CD4細(xì)胞計(jì)數(shù)32個(gè)細(xì)胞/^d和300個(gè)細(xì)胞/pl。促細(xì)胞分裂原特異性IP-10釋放在所有的供給者中都高，從394pg/ml到2800pg/ml。這些令人驚訝的發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了基于IP-10的體外試驗(yàn)與基于IFN-y的試驗(yàn)相比所增加的靈敏度。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>表6.對(duì)具有活動(dòng)性TB和陰性或不確定QFT-IT實(shí)驗(yàn)結(jié)果的患者進(jìn)行IP-10應(yīng)答試驗(yàn)。aGB-幾內(nèi)亞比索(GuineaBissau);DK-丹麥bpTB-肺結(jié)核、epTB-肺外結(jié)核c用生理鹽水、結(jié)核分枝桿菌特異性抗原(ESAT-6、CFP-10和TB7.7)或者促細(xì)胞分裂原(PHA)中的一種刺激全血20-24小時(shí)。通過(guò)ELISA(FN-y)和多元法(IP-10)測(cè)量趨化因子的產(chǎn)生d根據(jù)制造商說(shuō)明，陽(yáng)性QFT-IT應(yīng)答定義為在空白應(yīng)答之上的17.5pg/ml的抗原特異性應(yīng)答e陽(yáng)性IP-10應(yīng)答被定義為任意地基于11位健康對(duì)照平均結(jié)果+3標(biāo)準(zhǔn)品偏差的中值(來(lái)自實(shí)施例4的患者)，在空白應(yīng)答之上36pg/ml的抗原特異性IP-10應(yīng)答gn.d.—未進(jìn)4亍實(shí)施例11強(qiáng)烈的抗原特異性IP-10應(yīng)答可以在短期和長(zhǎng)期的孵育中產(chǎn)生在表7中，我們列出了來(lái)自典型的TB患者的在6-120小時(shí)的孵育下4企查的未被刺激的和抗原刺激的應(yīng)答。如從表7中所示，能夠在非常短的孵育時(shí)間內(nèi)用抗原刺激誘導(dǎo)IP-10應(yīng)答。在6小時(shí)時(shí)產(chǎn)生>1ng的應(yīng)答并且在120小時(shí)的孵育過(guò)程中保持了3-6ng的非常高的應(yīng)答。這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)了IP-10測(cè)試的性能非常堅(jiān)固并且能在非常短(<6小時(shí))和非常長(zhǎng)的孵育時(shí)間內(nèi)進(jìn)行。表7時(shí)間IP-10(pg/ml)_^_生理鹽水_^_69311731211734672493546748965867120806133表7.來(lái)自典型的TB患者的在6-120小時(shí)的孵育下^r查的未被刺激的(生理鹽水)和抗原刺激的應(yīng)答。實(shí)施例12可以在孵育溫度范圍下產(chǎn)生強(qiáng)抗原特異性IP-10應(yīng)答如從表8中可以看出的，能夠在寬范圍的溫度下用抗原刺激誘導(dǎo)IP-10應(yīng)答。在30。C下產(chǎn)生〉200pg/ml的抗原特異性IP-10，表明在30°C以下的孵育是可能的，并且在溫度范圍為例如30-37。C下的孵育將產(chǎn)生有力的抗原特異性應(yīng)答。表8(。C)_生理鹽水_^_20.08630.0422137.05852表8.來(lái)自典型TB患者的在20-37°CT24小時(shí)孵育檢查的未被刺激的或抗原刺激的應(yīng)答。IP-10的值為pg/ml。實(shí)施例13少量的全血能在孵育前進(jìn)行稀釋并仍產(chǎn)生強(qiáng)烈的IP-10應(yīng)答1ml(1:0)、0.5ml(1:1)和0.1ml(1:10)的全血的樣品在RPMI-1640上稀釋到總體積為lml。稀釋后的全血在QFT-IT試管內(nèi)刺激24小時(shí)。未對(duì)數(shù)值對(duì)稀釋因子進(jìn)行修正。如表9所示地，能夠在進(jìn)行孵育前在RPMI-1640上對(duì)全血進(jìn)行稀釋，并仍然產(chǎn)生>80pg/ml的抗原特異性IP-10應(yīng)答。這說(shuō)明了能進(jìn)行進(jìn)一步的稀釋并且能開發(fā)使用非常少量的血或細(xì)胞的試驗(yàn)試劑盒。表9__N(未被刺激)_A(抗原刺激)1:09354671:14029331:101393表9.使用小等分量的來(lái)自典型TB患者全血在RPMI-1640上稀釋后的未-陂刺激的或抗原刺激的應(yīng)答。IP-10的值為pg/ml。實(shí)施例14在25。C下IP-10的穩(wěn)定性在分析前，將由PHA刺激的來(lái)自四位供給者全血得到的血漿等分量在25。C下儲(chǔ)存!/2小時(shí)、l小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、8小時(shí)或24小時(shí)。從表10可以顯然看出，IP-10是非常穩(wěn)定的分子，它們甚至在25。C下放置24小時(shí)也不會(huì)分解。表IO<table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table>表10.在25°C下的IP-10穩(wěn)定性(以pg/ml進(jìn)行測(cè)量)。實(shí)施例15在5。C下IP-10的穩(wěn)定性在分析前將由PHA刺激的來(lái)自四位供給者全血得到的血漿等分量在5'C下儲(chǔ)存12小時(shí)、24小時(shí)、72小時(shí)、144小時(shí)或216小時(shí)(9天)。從表11可以顯然看出，IP-10是非常穩(wěn)定的分子，它們甚至在5。C下放置216小時(shí)(9天)也不會(huì)分解。表11<table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table>表ll.在5。C下的IP-10穩(wěn)定性實(shí)施例16在冷凍融化循環(huán)中IP-10的穩(wěn)定性在分析前將由PHA刺激的來(lái)自四位供給者全血得到的血漿等分量進(jìn)行5次(x5)的冰凍(-80。C)然后解凍。從表12可以顯然看出，IP-10是對(duì)水凍/解凍非常穩(wěn)定的分子，它們甚至在5次凍融循環(huán)下也不會(huì)分解。表12<table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table>表12.IP-10的凍融穩(wěn)定性實(shí)施例17IP-10作為診斷生物標(biāo)記物是不依賴于平臺(tái)的不4又通過(guò)Luminex能測(cè)量IP-10水平，在實(shí)施例17中對(duì)來(lái)自4位具有活動(dòng)性TB的患者和4位健康對(duì)照的樣品使用ELISA技術(shù)進(jìn)行測(cè)量(碧歐泉(Biosource))。如從表13中可以理解的是，全部4位患者產(chǎn)生了高于457pg/ml的抗原特異性IP-IO，而對(duì)照組均產(chǎn)生低于13pg/ml的IP-IO。表13<formula>formulaseeoriginaldocumentpage67</formula>表13.從4位對(duì)照和4位患者通過(guò)ELISA技術(shù)測(cè)得的抗原特異性IP-10的產(chǎn)生。實(shí)施例18將IP-10測(cè)量結(jié)果與其它已知的生物標(biāo)記物進(jìn)行結(jié)合以產(chǎn)生更強(qiáng)的結(jié)合的標(biāo)記物，并增加陽(yáng)性應(yīng)答的數(shù)量由于未知的原因，某些個(gè)體在抗原激活后對(duì)某一種生物標(biāo)記物應(yīng)答強(qiáng)烈而對(duì)另一種其次的抗原激發(fā)不應(yīng)答。例如某些個(gè)體可能不表現(xiàn)IP-10或IFN-y應(yīng)答，或僅產(chǎn)生非常低水平的IP-10或IFN-Y。在這種情況下，同時(shí)測(cè)量這兩種、三種、四種或更多種的生物標(biāo)記物將增加分析的靈敏度并增加陽(yáng)性應(yīng)答的數(shù)量。通過(guò)結(jié)合IP-10和例如IFN-Y的測(cè)量結(jié)果，因此能夠做出較少受到單個(gè)標(biāo)記物無(wú)反應(yīng)影響的i貪斷預(yù)測(cè)。一種實(shí)現(xiàn)這種結(jié)合的生物標(biāo)記物策略的方法參見表15,其中IP-10和來(lái)自表6的Quantiferon按以下模型(matrix)進(jìn)行結(jié)合如果患者對(duì)至少一種試驗(yàn)反應(yīng)陽(yáng)性，則認(rèn)為該患者被感染。在所列出的實(shí)施例中，沒有通過(guò)IP-10試驗(yàn)為陽(yáng)性的陰性QFT-IT應(yīng)答。<table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table>表14.將QFT-IT和IP-10試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行結(jié)合，并闡述為如果患者在至少一種測(cè)試為陽(yáng)性，則認(rèn)為該患者被感染。對(duì)于IP-10試驗(yàn)的截止點(diǎn)定義在空白相應(yīng)之上的36pg/ml的抗原特異性IP-10應(yīng)答，這種應(yīng)答任意地基于在11位健康對(duì)照平均結(jié)果+3標(biāo)準(zhǔn)偏差(實(shí)施例4中的患者)。另一種構(gòu)建結(jié)合的生物標(biāo)記物的更復(fù)雜的方法參見表16?？乖禺愋訧P-10和IFN-y應(yīng)答通過(guò)加法和乘法而結(jié)合。對(duì)7位未暴露的對(duì)照和8位具有活動(dòng)性TB的患者進(jìn)行評(píng)估。從表14看出抗原特異性IP-10和IFN-y應(yīng)答的中位值和范圍，以及這種相加或相乘后的IP-10和IFN-y的中位值和范圍。通過(guò)加法在最高應(yīng)答對(duì)照和對(duì)低應(yīng)答患者之間的跨度得到增加對(duì)IFN-y為從62pg/ml，并且對(duì)IP-10為從1727pg/ml,到1863pg/ml，并且通過(guò)乘法到164642(pg/ml)2。這種通過(guò)乘法在跨度上的令人意外的斯塔克增加(starkincrease)還增加了相對(duì)倍數(shù)差別，基于難以置信的379274倍平均值，這是與具有619倍的在患者和對(duì)照之間的差別抗原特異性IP-10或者具有1074倍差別的IFN-y相比。<table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table>表15.抗原特異性IP-10和抗原特異性IFN-y相加或相乘以構(gòu)建IP-10/IFN-y生物標(biāo)記物的結(jié)合。將小于0的抗原特異性測(cè)量結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化到0。實(shí)施例19使用IP-10分析對(duì)沙眼衣原體感染的診斷從來(lái)自7位具有沙眼衣原體感染的患者和7位沒有衣原體感染記錄史的供給者中分離PBMC。將PBMC在5天培養(yǎng)物中進(jìn)行刺激，并使用luminex分析上清液中的IP-10生成以及使用ELISA分析IFN-y生成。從表16可以看出通過(guò)用沙眼衣原體血清型D提取物抗原刺激來(lái)誘導(dǎo)高水平(>0.5ng/ml)的PBMC培養(yǎng)物上清液IP-IO，所述沙眼衣原體血清型D來(lái)自忍受沙眼衣原體生殖器感染的患者。顯然地，一些對(duì)照對(duì)這種非特異性刺激進(jìn)行應(yīng)答，但是應(yīng)答水平較低。有>0.5ng/ml的高抗原特異性IP-10產(chǎn)生。綜上，IP-10是一種用于沙眼衣原體感染的新穎的診斷生物標(biāo)記物。<table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table>表16.在PBMC中培養(yǎng)5天后空白、抗原以及抗原特異性的IP-10水平參考文獻(xiàn)阿布拉莫C,美加戈登KE，加西亞D,弗蘭肯KL，克萊因MR,科克aj等人著，在巴西肺結(jié)核患者中的由干擾素y誘導(dǎo)的單核因子以及IFN-y對(duì)結(jié)核分歧桿菌ESAT-6和CFP-10融合蛋白的應(yīng)答.微生物學(xué)(AbramoC，MeijgaardenKE，GarciaD,FrankenKL,KleinMR,KolkAJetal.MonokineinducedbyinterferongammaandIFN-gammaresponsetoafusionproteinofMycobacteriumtuberculosisESAT-6andCFP-10inBraziliantuberculosispatients.Microbes)布蓋瑞特，A.G.卡瑟蘭，V.馬丁內(nèi)斯、C拉斯科，V.德凱，B.奎爾，E.維克特，P'H.拉格朗日，D塞雷尼和B.奧特朗.2006.在肺結(jié)核和HIV共同感染患者中的結(jié)核菌素特異性Thl應(yīng)答誘導(dǎo)免疫重建綜合癥的探索。艾滋病20:F1-F7(Bourgarit,A"G.Carcelain,V.Martinez,C.Lascoux,V.Delcey,B.Gicquel,E.Vicaut,P.H.Lagrange,D.Sereni，andB.Autran.2006.Explosionoftuberculin-specificThl-responsesinducesimmunerestorationsyndromeintuberculosisandHIVco-infectedpatients.AIDS20:F1-F7)。休，A.J，哈欽森，T.古丁，N.J.弗利茲，S'R'霍爾茲沃思和P.D.約翰遜.2005.使用ESAT-6和胞內(nèi)細(xì)胞因子計(jì)量學(xué)診斷結(jié)核分枝桿菌.臨床實(shí)驗(yàn)免疫學(xué).142:132-139(Hughes,A.J.，P.Hutchinson,T.Gooding,N.J.Freezer,S.R.Holdsworth,andP.D.Johnson.2005.DiagnosisofMycobacteriumtuberculosisinfectionusingESAT-6andintracellularcytokinecytometry.Clin.Exp.Immunol.142:132-139)派，M.，R.喬希、S.格拉、D.K.門迪拉塔，P.納朗，S.卡蘭特里，A'L.萊因戈?duì)柕?，J.M'小科爾弗德，L.W.萊利和D'門吉斯.2006.使用干擾素y分析對(duì)醫(yī)護(hù)工作者進(jìn)行對(duì)肺結(jié)核的系列試驗(yàn).美國(guó)呼吸和重癥護(hù)理醫(yī)學(xué)雜志(Pai，M.,R.Joshi,S.Dogra,D.K.Mendiratta，P.Narang，S.Kalantri,A.L.Reingold，J.M.ColfordJr，L.W.Riley，andD.Menzies.2006.SerialTestingofHealthCareWorkersforTuberculosisusingInterferon-^Assay.Am.J.Respir.CritCareMed)權(quán)利要求1.一種免疫學(xué)方法，該方法包括以下步驟a)用至少一種受試抗原孵育從哺乳動(dòng)物獲得的樣品，b)測(cè)定所述樣品中的IP-10的水平，c)將所測(cè)定的IP-10的水平與參考水平進(jìn)行比較，從而確定所述哺乳動(dòng)物先前是否遇到過(guò)產(chǎn)生對(duì)所述受試抗原的免疫學(xué)反應(yīng)性的所述至少一種受試抗原，或者先前是否遇到過(guò)產(chǎn)生對(duì)所述受試抗原的免疫學(xué)交叉反應(yīng)性的其它抗原。2.—種用于診斷感染的方法，該方法包括以下步驟a)用至少一種受試抗原孵育從哺乳動(dòng)物獲得的樣品，在所述受試抗原不是PPD的條件下，b)測(cè)定所述樣品中的IP-10的水平，c)將所測(cè)定的IP-10的水平與參考水平進(jìn)行比較，從而確定所述哺乳動(dòng)物是否感染了微生物，d)如果所測(cè)定的IP-10的水平在參考水平之上，確定所述哺乳動(dòng)物是否被感染。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述樣品被分為至少兩部分，并且a)用受試抗原孵育所述樣品的第一部分以產(chǎn)生應(yīng)答樣品，b)用無(wú)活性溶液孵育所述樣品的第二部分以產(chǎn)生空白樣品，c)測(cè)定在所述兩部分中IP-10的水平，d)通過(guò)將從所述應(yīng)答樣品中測(cè)定的IP-10中減去從所述空白樣品中測(cè)定的IP-10水平來(lái)確定樣品的抗原依賴IP-10應(yīng)答，e)將所述抗原依賴IP-10應(yīng)答或由該應(yīng)答得到的數(shù)值與所述參考水平或由該參考水平得到的數(shù)值進(jìn)行比較，從而確定所述哺乳動(dòng)物先前是否遇到過(guò)該受試抗原并因而產(chǎn)生對(duì)該受試抗原的免疫學(xué)反應(yīng)性，或者先前是否遇到過(guò)產(chǎn)生對(duì)該受試抗原的免疫學(xué)交叉反應(yīng)性的其它抗原。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，該方法還包括將所述樣品分為3部分，并且將所述樣品的第三部分用T細(xì)胞活化劑進(jìn)行孵育以產(chǎn)生陽(yáng)性對(duì)照。5.根據(jù)權(quán)利要求2-4中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，高于所述參考水平的抗原依賴IP-10應(yīng)答連同空白指示所述哺乳動(dòng)物具有活動(dòng)性感染、潛伏性感染、近期感染和/或長(zhǎng)期潛伏性感染。6.根據(jù)權(quán)利要求2-5中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述感染是或曾經(jīng)是由微生物引起。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述微生物選自由分枝桿菌、利什曼原蟲、衣原體、錐蟲和血吸蟲所組成的組中。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述分枝桿菌屬于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合有才兒體(結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌以及非洲分枝桿菌)，和其中差別區(qū)域(RD1)沒有被去除的分枝桿菌(堪薩斯分枝桿菌、蘇加分枝桿菌、海分枝桿菌、轉(zhuǎn)黃分枝桿菌、胃氏分枝桿菌)，或人致病性分枝桿菌(鳥分枝桿菌、和麻風(fēng)分枝桿菌或其它非結(jié)核分枝桿菌)。9.根據(jù)權(quán)利要求7-8中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述分枝桿菌為結(jié)核分枝桿菌。10.根據(jù)前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中，所述至少一種受試抗原選自由ESAT-6、CFP-IO、TB7.7、Ag85、HSP65和RD-1抗原所組成的組中。11.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述微生物為衣原體。12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述衣原體選自由沙眼衣原體、肺炎衣原體、鸚鵡熱衣原體、鼠型沙眼衣原體和豬衣原體所組成的組中。13.4艮據(jù)權(quán)利要求11-12中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述抗原選自由D血清型提取物、主要外膜蛋白(MOMP)、富含半胱胺酸的外膜蛋白(OMPs)、OMP2、OMP3、多態(tài)OMPs(POMPs)、衣原體肺炎的二磷酸A泉苦/三磷酸腺苷移位酶、孔蛋白B蛋白(PorBs)和CT521所組成的組中。14.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述微生物為利什曼原蟲。15.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述微生物為錐蟲。16.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述微生物為血吸蟲。17.根據(jù)前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中，所述樣品得自血。18.根據(jù)前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，該方法還包括a)測(cè)定對(duì)抗原刺'激應(yīng)答的MCP-1的水平，b)將所測(cè)定的IP-10水平和MCP-1水平進(jìn)行結(jié)合，以及c)將所述結(jié)合的水平與結(jié)合的參考水平進(jìn)行比較。19.根據(jù)前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，該方法還包括a)測(cè)定對(duì)抗原刺激應(yīng)答的IL-2的水平，b)將所測(cè)定的IP-10水平和IL-2水平進(jìn)行結(jié)合，以及c)將所述結(jié)合的水平與結(jié)合的參考水平進(jìn)行比較。20.根據(jù)前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，該方法還包括a)測(cè)定對(duì)抗原刺激應(yīng)答的INF-y以及任選的MCP-1和/或IL-2的水平，b)將所測(cè)定的IP-10水平和INF-y以及任選的MCP-1和/或IL-2水平進(jìn)行結(jié)合，以及c)將所述結(jié)合的水平與結(jié)合的參考水平進(jìn)行比較。全文摘要本發(fā)明的方法涉及一種免疫學(xué)方法，更具體地說(shuō)，涉及一種基于IP-10的產(chǎn)生的用來(lái)測(cè)量哺乳動(dòng)物內(nèi)的細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)性(CMI)的方法。本發(fā)明進(jìn)一步公開了測(cè)量對(duì)使用全血或其它合適的生物樣品的抗原的CMI的測(cè)定法和試劑盒。本發(fā)明的方法是對(duì)人類、牲畜以及獸醫(yī)學(xué)和野生動(dòng)物應(yīng)用有用的治療和診斷方案，因此本發(fā)明還涉及用來(lái)診斷哺乳動(dòng)物內(nèi)的感染的方法。文檔編號(hào)G01N33/68GK101523217SQ200780032976公開日2009年9月2日申請(qǐng)日期2007年9月5日優(yōu)先權(quán)日2006年9月5日發(fā)明者佩妮萊·拉文,耶斯珀·歐金-奧爾森,莫滕·魯瓦爾德申請(qǐng)人:哈維德夫醫(yī)院