專利名稱：新型的免疫刺激分子及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及新型的免疫刺激分子(Immune Stimulation Molecules，ISM)及其制備方法，更具體地說，涉及具有特定功能基序的寡核苷酸、寡核苷酸功能基序的連結方式及其制備方法。
背景技術：
近年來研究發(fā)現(xiàn)，細菌DNA和人工合成的寡脫氧核苷酸(Oligodeoxynucleotide，ODN)具有免疫刺激活性，序列中均含有未甲基化的胞嘧啶和鳥嘌呤二核苷酸基序，其研究成為當今頗具希望的前沿領域之一。
含胞嘧啶和鳥嘌呤二核苷酸-DNA的發(fā)現(xiàn)遺傳信息DNA除編碼基因物質(zhì)之外，還有直接的免疫刺激作用。約七十年前問世的福氏佐劑(Freund′s adjuvant)包括多種免疫刺激物質(zhì)，推測細菌(滅活的結核桿菌)DNA成份可能是其中之一。上世紀七十年代，牛型分枝桿菌的卡介苗(BCG)對動物和人腫瘤的治療作用引起研究者的關注。1984年，Tokunaga等發(fā)現(xiàn)從BCG中提純的核酸具有抗腫瘤作用，稱其為MY-1。它刺激脾細胞分泌干擾素(IFN)和增強自然殺傷細胞(NK)的活性，使腫瘤縮小。研究還發(fā)現(xiàn)MY-1的生物活性能被DNA酶消化而失活。Yamamoto等人繼續(xù)以誘導IFN分泌和刺激NK活性為標準，終于從MY-1中鑒定出一種由45個堿基組成的寡脫氧核苷酸(在本括號中加入文獻信息，書寫格式有參考)。其后，他們又根據(jù)編碼BCG蛋白的cDNA合成了不同的ODN，針對ODN免疫學研究發(fā)現(xiàn)并非所有的ODN均可刺激機體免疫反應，只有那些含一個或多個回文序列(palindromic sequence)的ODN才具有免疫學活性(在本括號中加入文獻信息，書寫格式有參考)。經(jīng)過深入研究，最終發(fā)現(xiàn)所有刺激性回文序列均含有未甲基化的胞嘧啶核苷酸和鳥嘌呤核苷酸組成的二核苷酸(在本括號中加入文獻信息，書寫格式有參考)。
另一項有重要意義的研究源于Missena等人的工作(在本括號中加入文獻信息，書寫格式有參考)。他們發(fā)現(xiàn)細菌DNA在體外具有B淋巴細胞有絲分裂原的作用，而來自脊椎動物的DNA則無此作用。如果將細菌DNA的胞嘧啶核苷酸甲基化后，也完全失去了對B淋巴細胞的有絲分裂原作用。在此實驗基礎上的研究最終認識到細菌、病毒和無脊椎動物富含未甲基化的胞嘧啶和鳥嘌呤二核苷酸結構，而脊椎動物除所含胞嘧啶和鳥嘌呤二核苷酸相對缺乏外，其胞嘧啶每5位碳原子多為甲基化。一般而言，前者未甲基化的胞嘧啶和鳥嘌呤二核苷酸結構為后者的100倍之多。這提示，在長期的進化過程中，脊椎動物DNA所形成的這種有別于細菌DNA的結構特征有其重要的生物學意義。即通過識別未甲基化的胞嘧啶和鳥嘌呤二核苷酸，辯別細菌、病毒等外源DNA，并對其產(chǎn)生免疫反應。Krieg等將純化B細胞與各種來源的DNA共同培養(yǎng)，僅細菌DNA和末甲基化的胞嘧啶和鳥嘌呤二核苷酸組成的ODN具有刺激作用。若將細菌DNA及ODN先用甲基化酶處理，或?qū)⑵湫蛄刑鎿Q成鳥嘌呤和胞嘧啶二核苷酸或其它序列，則失去激活作用，表明激活B細胞是未甲基化胞嘧啶和鳥嘌呤二核苷酸特異的(在本括號中加入文獻信息，書寫格式有參考)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，當此二核苷酸5′端接二個嘌呤、3′端接二個嘧啶時，刺激作用最強(在本括號中加入文獻信息，書寫格式有參考)。從而證實，細菌DNA中未甲基化胞嘧啶和鳥嘌呤二核苷酸基序具有免疫刺激作用。
胞嘧啶和鳥嘌呤二核苷酸-ODN序列活性的研究哺乳動物可以識別未甲基化的胞嘧啶和鳥嘌呤二核苷酸基序，誘生免疫應答。所述的基序由位于中央的胞嘧啶和鳥嘌呤二核苷酸、5′端二個嘌呤、3′端二個嘧啶組成的六堿基序列。有三項重要發(fā)現(xiàn)極大地、有效地促進了人工合成ODN的迅速發(fā)展。其一，以硫代磷酸酯(Phosphorothionate)為支架的ODN有很強的抗核酸酶作用，從而保持其活性；其二，刺激人免疫反應最強的胞嘧啶和鳥嘌呤二核苷酸基序為5′GTCGTT 3′，刺激鼠免疫反應最強的基序為5′GTCGTT 3′；第三，最有效的ODN一般含有2-3個所述的基序，含有3個所述基序的ODN并不能進一步增強其活性，而只含有1個基序的ODN的免疫活性又太低。因此，人工合成的胞嘧啶和鳥嘌呤二核苷酸-ODN大都是在22個堿基以上，由硫代磷酸化修飾、含有2-3個5′GTCGTT 3′基序。
北京萬賽生物醫(yī)藥技術發(fā)展有限公司自成立之始，不失時機地傾力研究胞嘧啶和鳥嘌呤二核苷酸-ODN的化學、免疫和毒理，取得大量有價值的資料。依上述三項原則，合成了數(shù)十種序列不同的ODN之后，最終篩選出作用較強的ISM系列作為免疫刺激劑進一步開發(fā)。研究結果表明，ISM頗具臨床潛力，顯示出較好的應用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種免疫調(diào)節(jié)分子，它具有功能基序5′GTCGTT 3′。
優(yōu)選地，本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)分子是以硫代磷酸酯為支架的寡脫氧核苷酸。
更優(yōu)選地，本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)分子中含有2-3個所述的功能基序。
最優(yōu)選地，本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)分子具有SEQ ID NO.1～14中的任意一個所述的序列。
本發(fā)明還提供了上述免疫調(diào)節(jié)分子在制備用于治療和/或預防免疫性疾病的藥物中的應用。
優(yōu)選地，上述的藥物還含有其它具有治療和/或預防疾病功能的活性成分。更優(yōu)選地，所述的活性成分是疫苗。特別優(yōu)選地，所述的疫苗是下述疫苗中的一種或多種甲肝疫苗、乙肝疫苗、丙肝疫苗、流感疫苗、艾滋病疫苗、腦炎疫苗、脊髓灰質(zhì)炎疫苗、肺炎疫苗、腮腺炎疫苗、水痘疫苗、麻疹疫苗、風疹疫苗。
優(yōu)選地，上述的免疫性疾病是腫瘤、自身免疫病、病毒感染性疾病或細菌感染性疾病。
本發(fā)明還提供了一種合成上述的免疫調(diào)節(jié)分子的方法，其中包括下面的A組或者B組步驟A組a)將帶保護的脫氧核糖核苷酸單體脫保護；b)與新加入的堿基進行耦聯(lián)反應；c)封閉堿基上的未反應的5’-OH；d)使核苷酸間的亞磷酸三酯進行氧化反應，生成磷酸三酯；e)合成循環(huán)。
B組a)將帶保護的脫氧核糖核苷酸單體脫保護；b)與新加入的堿基進行耦聯(lián)反應；c)將堿基間磷酸上的一個氧用硫取代；d)封閉堿基上的未反應的5’-OH；e)合成循環(huán)。
實驗證明，ISM有激活細胞免疫的作用、促進巨噬細胞的吞噬作用。ISM作為佐劑與抗原類物質(zhì)合用時，也能加強特異性細胞免疫反應、巨噬細胞的吞噬作用。ISM的特點在于加強細胞免疫，尤其在免疫力低下時更具有現(xiàn)實意義，針對廣大免疫力低下人群具有治療的效應。一般的抗原物質(zhì)主要是激發(fā)生物機體的體液免疫途徑，而ISM則會激發(fā)細胞免疫，因此可與疫苗同時應用。
具體實施例方式
下面以實施例進一步解釋本發(fā)明，但是本發(fā)明的保護范圍并不限于這些實施例。
實施例1 ISM系列寡核苷酸的合成及純化原理采用亞磷酸三酯固相儀器合成法，一個核苷上的活性3’-磷酸基團與另一個核苷上的5’-OH耦聯(lián)。前者是在溶液中傳送的單體，后者被固定在固相載體上，核苷酸間的鍵因此形成。為了下一步耦聯(lián)，使DNA鏈增長，必須有另外三個化學反應。用這種方法，每完成一個合成循環(huán)，就增加一個核苷單體。所需要的序列及長度由合成儀來控制。
當鏈完成時，粗品DNA(寡核苷酸)必須從載體上切割下來，并脫去保護基，然后還需要合適的分離純化方法，才能得到所需純度的DNA產(chǎn)品。
合成方法原料結合有所要合成的目的物3’末端堿基的可控孔玻璃珠(controled pore glass，ISM)、四種帶保護的脫氧核糖核苷酸單體(A、T、C、G)、以及其他一些必需試劑。
a)脫保護，用三氯乙酸或者二氯乙酸將核苷酸單體上5’-OH末端用來封閉5’-OH的dmt基團脫掉，使5’-OH暴露出來，準備下一部反應。
b)耦聯(lián)，核苷酸單體上的5’-OH暴露出來后，先加入四唑?qū)⑵浠罨?，然后同時再加入四唑和核苷酸單體，使活化的5’-OH與新加入的單體反應，這樣就生成了多一個堿基的寡核苷酸鏈。
c)封閉，由于有機合成反應進行的不完全性，所以在上一步反應中，有部分5’-OH并未參與反應。為了保證合成序列的完整性、減少合成產(chǎn)物中的雜質(zhì)，需要將這部分未反應的5’-OH封閉起來。乙酐和1-甲基咪唑同時輸送到反應容器中，將反應生成一種強有力的乙?；噭?。這種乙?；噭┡c未反應的5’-OH反應使其失活無法參加下一步反應，從而減少了終產(chǎn)物中的雜質(zhì)。
d)氧化，耦聯(lián)反應中生成的核苷酸間的鍵是一個亞磷酸三酯，亞磷酸酯鍵非常不穩(wěn)定，很容易被酸和堿切斷。因此，封閉后的亞磷酸三酯鍵需要立即被氧化成穩(wěn)定的磷酸三酯。碘在堿性四氫呋喃溶液中作為一種溫和的氧化劑，可以完成這步反應。
e)硫代，生物體內(nèi)的很多酶都可以分解外來的DNA。但是，如果把堿基間磷酸上的一個氧用硫取代，生成硫代磷酸酯寡核苷酸，就可以增加DNA在生物體內(nèi)的穩(wěn)定性。二硫代四乙基硫脲在室溫下可以完成這步反應。如果需要硫代的話，就要去掉氧化這一步，并且將硫代放到封閉之前進行。
f)合成循環(huán)，氧化后，核苷酸加成的一個循環(huán)就完成了，寡聚物的5’末端被保護基保護。通過第一步脫保護，然后重復后面的堿基加成，繼續(xù)DNA合成的另一個循環(huán)，直到特定長度的DNA完全合成為止。結束合成時，通過儀器確定最后一個堿基5’末端保護基是保留還是除去。
切割和脫保護將反應后的容器取下，取出里面的ISM，按一定的比例加入濃氨水，在密閉容器中于55℃水浴保溫8-15小時或80℃保溫2-3小時?？梢酝瑫r將DNA從固相載體上切割下來，并且切去堿基上的保護基。
定量和貯存通過測定260nm處的光吸收值就可以將其定量。
可以將氨解后的產(chǎn)品抽干放置于-20℃凍存，或者氨解后直接凍存在-20℃。
分離與純化氨解后的樣品使用0.45um的濾膜過濾除去ISM后，就可以使用制備型HPLC將其分離純化。
流動相0.1M的醋酸三乙胺，與乙腈組成混合流動相，梯度洗脫就可以達到分離純化的目的。根據(jù)不同的序列以及長度，需要微調(diào)乙腈的起始以及終止?jié)舛龋梢苑蛛x得到純度大于95％的產(chǎn)品。
ISM的質(zhì)量標準a)保證寡核苷酸序列的正確性。寡核苷酸的序列分析方法主要包括改進的Maxam-Gilbert化學測序法、質(zhì)譜法、紫外或HPLC堿基分析法；b)理化特性的測定。對寡核苷酸的長度、序列、均一性、修飾基團等理化特性進行分析，便于安全有效地使用，分析方法主要包括高效液相色譜(HPLC)法、毛細管電泳(CE)法、聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)法、紫外分光光度法；
c)生物學活性的測定，一般包括細胞培養(yǎng)、轉染、斷續(xù)培養(yǎng)、評價藥物作用等步驟；d)安全性的評價，除了保證無病毒、無菌、無致熱原、無致敏原等一般安全要求外，還要保證無致突變、無致癌、無致畸等要求；e)穩(wěn)定性的評價，要使用理化、生化和免疫化學分析技術對活性成分的理化及生物學活性等方面的變化情況進行全面的檢測，并準確檢測在儲存過程中由于氧化、聚合或降解等所造成的變化，方法包括電泳(PAGE)、高分辨率的HPLC、CE以及MS、NMR分析等。
上述質(zhì)量控制項目的標準如表1所示。
表1 ISM常規(guī)質(zhì)量控制項目檢測項目 檢測方法 標準規(guī)定寡核苷酸的序列分析改進的Maxam-Gilbert化樣品應與對照品一致學測序法質(zhì)譜法 樣品應與對照品一致與靶基因的雜交性質(zhì)紫外分光光度法 50-70℃純度分析 高效液相色譜法 不低于95.0％毛細管電泳法或SDS- 不低于95.0％PAGE法紫外分光光度法樣品應與對照品一致修飾基團的結合率 離子交換高效液相色譜法不低于90％失敗序列 IP-HPLC法或CE法 不超過5％PH值 《中國藥典》的附錄方法 應為6.0-8.0溶液的澄清度與顏色 《中國藥典》的附錄方法 應符合規(guī)定水分 卡氏水分測定法不超過1.0％無菌試驗 無菌試驗方法 應符合規(guī)定本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)分子中的特定功能基序之間可以有若干種不同的連接方式。按照上述方法制備出的優(yōu)選的免疫調(diào)節(jié)分子及其序列如表2所示。
表2優(yōu)選的免疫調(diào)節(jié)分子編號 結構(5’→3’)24301TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT22301TCGTCGTTGTCGTTTTGTCGTT22302TCGTCGTTTTGTCGTTGTCGTT20301TCGTCGTTGTCGTTGTCGTT22303TCGTCGTTTTCGTTTTGTCGTT22304TCGTCGTTGTCGTTTTGTCGTT22305TCGTCGTTTTGTCGTTTTCGTT20302GCGTCGTTGTCGTTGTCGTT19301TGTCGTTGTCGTTGTCGTT23301TGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT14201TCGTCGTTGTCGTT21301TGTCGTTTGTCGTTTGTCGTT22306TCGTCGTTTGTCGTTTGTCGTT18301TCGTCGTTTTGTCGTTTT上述免疫調(diào)節(jié)分子的命名原則如下●自左向右的首起兩位數(shù)字表示該產(chǎn)物核苷酸數(shù)目；●自左向右第3位數(shù)字表示該產(chǎn)物中包含功能基序的數(shù)目；●自左向右的最后兩位為該產(chǎn)物的自然編碼。
ISM具有明顯的免疫刺激和免疫佐劑效應。我們對它的功效進行了深入的研究。實驗中以ISM24301為主要實驗物，并與其它ISM進行了比較。實驗中分為ISM單獨應用和與抗原聯(lián)合應用兩部分。
實施例2 ISM免疫刺激作用的功效實驗為了了解ISM單獨用藥的免疫刺激作用，將24個連續(xù)堿基T(TTTTTTTT……)的無效序列與ISM給每只小鼠肌肉注射20μg，隔10天注射一次，連續(xù)注射3次以后，采集血清測γ-干擾素、總IgG；或制備脾細胞懸浮液作淋巴細胞轉化實驗；或收集腹腔巨噬細胞進行其吞噬功能的檢測。
ISM增強動物的體液免疫反應γ-干擾素的檢測實驗方法與原理用抗小鼠γ-干擾素包被的ELISA試劑盒檢測小鼠血清中的γ-干擾素含量。
干擾素是由病毒等誘導劑作用于寄生細胞而產(chǎn)生的一類具有生物活性的糖蛋白，有抗病毒、抗腫瘤和調(diào)節(jié)免疫反應等活性?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)干擾素有多種，γ-干擾素是抗原刺激下淋巴細胞所產(chǎn)生的。干擾素具有很強的抗病毒活性，而且一種干擾素能夠抑制多種病毒的增殖，在醫(yī)學上是一類廣譜的抗病毒藥物。干擾素可治療肝炎、流行性感冒等常見病毒性疾病，也有抗癌細胞增殖的作用，并已應用于乳腺癌、骨髓癌等多種癌癥的治療。
實驗分組與結果如表3所示。
表3實驗分組與結果分組例數(shù)OD值均數(shù)±標準差 配對t-test P值正常對照8 0.06350±0.03338524T-正常對照0.79324T對照 8 0.06800±0.031094ISM-正常對照0.006ISM243018 0.19825±0.091470ISM-24T0.007結論24T對照組與正常對照組比較產(chǎn)生的γ-干擾素增多在統(tǒng)計學上沒有顯著性意義(P＞0.05)；ISM24301與正常對照組、24T對照組比較產(chǎn)生的γ-干擾素增多在統(tǒng)計學上具有顯著性意義(P＜0.05)。
血清總IgG的檢測實驗方法與原理用單向免疫擴散試驗來定量測定小鼠血清中的IgG。
單向免疫擴散試驗是在凝膠中進行的沉淀反應。將抗體混入加熱溶解的瓊脂中，傾注于玻片上，制成含有抗體的瓊脂板，在適當位置打孔，將抗原材料加入瓊脂板的小孔內(nèi)，讓抗原從小孔向四周的瓊脂中擴散，與瓊脂中的抗體相遇形成免疫復合物。當復合物體積增加到一定程度時停止擴散，出現(xiàn)以小孔為中心的圓形沉淀圈，沉淀圈的直徑與加入的抗原濃度成正相關。
實驗分組與結果如表4所示。
表4實驗分組與結果

結論ISM24301與24T對照組比較引起的總的IgG的產(chǎn)生量增多在統(tǒng)計學上沒有顯著性的意義(P＞0.05)。
ISM增強動物的非特異性淋巴細胞轉化率實驗方法與原理T細胞能被非特異的物質(zhì)如有絲分裂原ConA所激活而向淋巴母細胞轉化。用MTT檢測法在光學顯微鏡下計數(shù)轉化后的淋巴細胞數(shù)。MTT是一種甲氮唑鹽，它是細胞線粒體脫氫酶的底物，細胞內(nèi)的酶可將MTT分解產(chǎn)生藍黑色甲簪(fromazan)產(chǎn)物。該產(chǎn)物的多少與活性細胞數(shù)正相關。結果可用酶標檢測儀(490nm和630nm雙波長)測量，做為MTT法的檢查指標。
實驗分組與結果如表5所示。
表5實驗分組與結果

結論ISM24301與24T對照組比較引起的淋巴細胞轉化數(shù)量的增多在統(tǒng)計學上具有顯著性的意義(P＜0.05)，表明ISM有激活細胞免疫的作用。
ISM增強動物的巨噬細胞吞噬功能實驗方法與原理巨噬細胞具有較強的吞噬功能，常用比細菌大的細胞性抗原作為被吞噬顆粒，如雞紅細胞。其檢測原理是將受檢細胞與適量的顆?？乖u紅細胞混合后，置37℃保溫0.5～1h，其間時加振搖，最后離心取測定細胞制成涂片，染色鏡檢，分別計數(shù)出吞噬百分數(shù)和吞噬指數(shù)。
實驗分組與結果如表6所示。
表6實驗分組與結果分組例吞噬百分數(shù)(％) 吞噬指數(shù) 配對t-test數(shù)均數(shù)±標準差 均數(shù)±標準差 P值正常對照1045.8800±15.779041.4440± 吞噬百吞噬指0.86411分數(shù) 數(shù)ISM243015 80.7320±12.254634.1140± 0.017 0.031.38996ISM223015 71.4520±20.635043.9620± 0.018 0.052.09611ISM203015 58.3360±16.015594.5640± 0.230 0.1042.56135ISM223035 66.5080±16.627705.8320± 0.050 0.0082.34878ISM203025 57.8840±15.957695.1800± 0.162 0.1473.00227結論ISM20301、ISM20302與正常對照動物比較吞噬百分數(shù)和吞噬指數(shù)在統(tǒng)計學上沒有顯著性意義(P＞0.05)；ISM24301、ISM22301、ISM22303與正常對照動物比較吞噬百分數(shù)和吞噬指數(shù)在統(tǒng)計學上具有顯著性意義(P＜0.05)，表明它們可以促進巨噬細胞的吞噬作用。
ISM對免疫抑制模型動物的免疫增強作用實驗方法與原理給每只小鼠一定劑量的環(huán)磷酰胺造成免疫缺陷，觀察免疫刺激分子ISM各個不同序列在免疫低下動物身上的免疫反應強度。用MTT檢測法在光學顯微鏡下計數(shù)轉化后的淋巴細胞數(shù)。結果可用酶標檢測儀(490nm和630nm雙波長)測量，做為MTT法的檢查指標。
實驗分組與結果如表7所示。
表7實驗分組與結果分組例(μg/只)MTT沉淀配對t-test數(shù)CYISM OD值均數(shù)±標準差 P值缺陷對照7 200 0.04880±0.035808 與免疫缺陷比較ISM243015 20300.39280±0.161083 0.012ISM223015 20300.24180±0.128085 0.052ISM203015 20300.29340±0.111285 0.019ISM223035 20300.20340±0.101318 0.051ISM203025 20300.30480±0.269402 0.124注CY環(huán)磷酰胺，隔日給藥三次，抗原、ISM于CY給藥后第2天、第10天給藥兩次，第17天采血。
結論在免疫低下條件下，ISM各種不同序列引起的淋巴細胞轉化數(shù)量不同，其中ISM24301、ISM20301與對照動物比較在統(tǒng)計學上具有顯著性意義(P＜0.05)；ISM22301、ISM22303與對照動物比較在統(tǒng)計學上接近有顯著性意義(P＝0.05)；ISM20302與對照動物比較在統(tǒng)計學上沒有顯著性意義(P＞0.05)。說明ISM有激活細胞免疫的作用。
實施例3 ISM作為佐劑加強特異性免疫反應的功效實驗與抗原類物質(zhì)合用增強動物的體液免疫反應特異性抗體、特異性抗體亞類的檢測實驗方法與原理1.用不同劑量配伍的乙肝抗原與免疫刺激分子(ISM)免疫小鼠后一個月左右采集血清，分裝保存。用酶聯(lián)免疫吸附法檢測乙肝表面抗體及其亞類IgG1和IgG2α的表達強度。
2.酶聯(lián)免疫吸附法的檢測原理是把受檢標本血清(測定其中的抗體HBsAb)與固相載體表面的抗原(HbsAg)起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他物質(zhì)分開，最后結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關，故可根據(jù)顏色反應的深淺程度定性或定量分析。由于酶的催化頻率很高，故可極大地放大反應效果，從而使測定方法達到很高的敏感度。
3.特異性抗體的IgG1和IgG2α兩種亞類數(shù)量的比例關系代表不同的免疫途徑被啟動，如果Ig Gt/Ig G2α比值大于1，說明TH2型免疫途徑占優(yōu)勢，以體液免疫為主；如果Ig G1/Ig G2α比值小于1，說明TH1型免疫途徑占優(yōu)勢，以細胞免疫為主。
實驗分組與結果如表8-10所示。
表8特異性抗體(HBsAb)的檢測結果分組 例 Ag(μg)ISM(μg)OD值均數(shù)±標兩組獨立樣本數(shù)準差T-test P值Ag18 1 0 0.0905± 與Ag1比較0.06339 0.0019124301-59 1 5 0.61394±6.1462E-60.38822 0.0015
24301-10 9 1 10 0.41772± 1.17243E-5，0.1234522303-5 8 1 50.41256±0.2226822303-10 9 1 10 0.32539±0.08453Ag5 9 5 00.14183± 與Ag5比較0.06298 5.49071E-624301-5 5 5 50.6763± 5.08655E-70.19604 0.0085724301-10 8 5 10 0.74181±9.86676E-50.2058222303-5 9 5 50.68989±0.5453422303-10 9 5 10 0.83894±0.40192注Ag為重組乙肝疫苗，給藥方式為脛骨前肌肌肉注射給藥。下列各表相同。
結論在抗原劑量相同的情況下，ISM各組均較抗原對照組產(chǎn)生的抗體數(shù)量多，且在統(tǒng)計學上具有顯著性意義(P＜0.05)。
表9 ELISA法檢測特異性抗體(HBsAb)亞類的OD值比值(Ig G1/IgG2α)(動物分組同上)Ag1 24301-5 24301-10 22303-5 22303-102.9543570.626417 0.869876 0.876999 0.79635412.3908 0.550573 0.91494 0.991916 0.75746515.427140.856306 0.868001 0.769936 0.6022342.3802940.542002 0.668952 1.597459 0.803871
0.840074 0.7773270.9070570.7905940.615856.920872 0.7114720.5246261.1102640.7865294.558888 0.62672 0.6759370.6974780.8178289.11708740.4606510.7591790.7131280.4497840.64357 0.575682表9(續(xù))Ag5 24301-5 24301-1022303-5 22303-102.657157 1.1421941.0941060.9786620.9531382.916078 0.9823170.6660921.3258980.8668344.52005 0.9263090.8251 0.9157830.8165337.179487 1.3170370.9759110.8271110.91452410.815 0.9520411.1416960.7657237.448276 0.8873851.2171520.9333249.550082 0.9452140.9522491.10327823.23404 1.0666310.9385140.8266431.2319950.702096結論抗原對照組Ag1和Ag5組內(nèi)絕大多數(shù)動物Ig G1/Ig G2α比值都大于1，說明抗原給藥只引起TH2型的體液免疫反應；而抗原與ISM聯(lián)合給藥各組內(nèi)絕大多數(shù)動物Ig G1/Ig G2α比值都小于1，說明抗原與ISM聯(lián)合給藥引起了TH1型的細胞免疫反應。
表10不同ISM序列的特異性抗體檢測分組例Ag ISMOD值均數(shù)±標準差 配對T-test P值數(shù)Ag 105μg0 0.19200±0.113069與Ag比較ISM243015 5μg20μg 1.43160±0.5661300.012ISM223015 5μg20μg 0.57260±0.2293220.031
ISM2030155μg20μg0.43740±0.191341 0.032ISM2230355μg20μg0.36760±0.043793 0.019ISM2030255μg20μg0.61580±0.187161 0.023結論合用不同的ISM各序列與單用抗原比較產(chǎn)生的特異性抗體數(shù)量增多均在統(tǒng)計學上具有顯著性意義(P＜0.05)γ-干擾素的檢測實驗方法與原理用抗小鼠γ-干擾素包被的ELISA試劑盒檢測小鼠血清中的γ-干擾素含量。
實驗分組與結果如表11所示。
表11實驗分組與結果分組 例數(shù)Ag ISMOD值均數(shù)±標準配對t-test P差值Ag 10 5μg0 0.30015±V-ISM50.075492 0.002ISM24301-5 10 5μg5μg 0.42515±V-ISM300.0000.106407ISM24301-3010 5μg30μg 0.70670± ISM5-ISM300.084270 0.000注給藥程序----隔周給藥兩次后過一周采血。
結論合用小劑量ISM24301(5μg)比單用抗原引起的γ-干擾素分泌增多在統(tǒng)計學上具有顯著性意義(P＜0.05)；合用大劑量ISM24301(30μg)比單用抗原引起的γ-干擾素分泌增多在統(tǒng)計學上具有極其顯著性的意義(P＜0.001)；合用大劑量ISM24301(30μg)比合用小劑量ISM24301(5μg)引起的γ-干擾素分泌增多在統(tǒng)計學上具有極其顯著性的意義(P＜0.001)血清總IgG的檢測實驗方法與原理1.用單向免疫擴散試驗來定量測定小鼠血清中的IgG。
實驗分組與結果如表12所示。
表12實驗分組與結果分組例 抗原(μg) ISM(μg) 沉淀環(huán)直徑(mm)均數(shù) 配對t-test數(shù) ±標準差P值Ag 6 5 0 13.200±0.305ISM243016 5 2010.683±1.2656 0.000結論合用ISM24301比單用抗原引起的總的IgG的產(chǎn)生量增多在統(tǒng)計學上具有極其顯著性的意義(P＜0.001)。
與抗原類物質(zhì)合用增強動物的非特異性淋巴細胞轉化率實驗方法與原理T細胞能被非特異的物質(zhì)如有絲分裂原ConA所激活而向淋巴母細胞轉化。用MTT檢測法在光學顯微鏡下計數(shù)轉化后的淋巴細胞數(shù)。MTT是一種甲氮唑鹽，它是細胞線粒體脫氫酶的底物，細胞內(nèi)的酶可將MTT分解產(chǎn)生藍黑色甲簪(fromazan)產(chǎn)物。該產(chǎn)物的多少與活性細胞數(shù)正相關。結果可用酶標檢測儀(490nm和630nm雙波長)測量，做為MTT法的檢查指標。
實驗分組與結果如表13所示。
表13實驗分組與結果分組例數(shù)抗原(μg)ISM(μg)MTT沉淀 配對t-testOD值均數(shù) P值±標準差Ag 8 50 0.37700±0.209145 0.036ISM243018 520 0.74738±0.295753
結論合用ISM24301比單用抗原引起的淋巴細胞轉化數(shù)量的增多在統(tǒng)計學上具有顯著性的意義(P＜0.05)。
與抗原類物質(zhì)合用增強動物的巨噬細胞吞噬功能實驗方法與原理巨噬細胞具有較強的吞噬功能，常用比細菌大的細胞性抗原作為被吞噬顆粒，如雞紅細胞。其檢測原理是將受檢細胞與適量的顆?？乖u紅細胞混合后，置37℃保溫0.5～1h，其間時加振搖，最后離心取測定細胞制成涂片，染色鏡檢，分別計數(shù)出吞噬百分比和吞噬指數(shù)。
實驗分組與結果如表14所示。
表14實驗分組與結果分組 例數(shù) 抗原 ISM 吞噬百分數(shù)(％) 吞噬指數(shù)(μg)(μg) 均數(shù)±標準差 均數(shù)±標準差正常對照N 800 47.000± 0.7750±10.0780 0.33428Ag 850 56.850± 1.5537±12.5633 0.75432ISM24301 8520 74.588± 3.3088±16.1745 1.23268配對t-test P值吞噬百分數(shù)----N-Ag 0.219；Ag-ISM 0.045；吞噬指數(shù)N-Ag 0.17；Ag-ISM 0.004。
結論Ag組與正常對照組比較，吞噬百分數(shù)和吞噬指數(shù)的P值都大于0.05，說明抗原與正常對照相比引起巨噬細胞吞噬功能的增強在統(tǒng)計學上沒有顯著性意義；ISM24301組與Ag組比較，吞噬百分數(shù)和吞噬指數(shù)的P值都小于0.05，說明合用ISM24301與單用抗原比引起巨噬細胞吞噬功能的增強在統(tǒng)計學上具有顯著性意義。
與抗原類物質(zhì)合用在免疫低下動物身上的免疫增強作用實驗方法與原理給每只小鼠一定劑量的環(huán)磷酰胺造成免疫缺陷，然后對比抗原Ag和免疫刺激分子ISM。
在此條件下的免疫反應強度。用酶聯(lián)吸附反應試劑盒檢測HbsAb的表達強度。
實驗分組與結果如表15所示。
表15實驗分組與結果分組 例數(shù) (μg/只)HBsAb配對CY Ag ISM OD值均數(shù) t-test±標準差 P值Ag7 20 5 00.06386±0.012802 0.023ISM24301 7 20 5 28 0.26943±0.183126注CY環(huán)磷酰胺，隔日給藥三次，抗原、ISM于CY給藥后第2天、第10天給藥兩次，第17天采血。
結論在免疫缺陷條件下，合用ISM24301較單用抗原引起的特異性抗體增強在統(tǒng)計學上具有顯著性意義(P＜0.05)。
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<210>5<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>5tcgtcgtttt cgttttgtcg tt 22<210>6<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>6tcgtcgttgt cgttttgtcg tt 22<210>7<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>7tcgtcgtttt gtcgttttcg tt 22<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>8gcgtcgttgt cgttgtcgtt20<210>9<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>9tgtcgttgtc gttgtcgtt 19
<210>10<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>10tgtcgttttg tcgttttgtc gtt23<210>11<211>14<212>DNA<213>人工序列<400>11tcgtcgttgt cgtt 14<210>12<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>12tgtcgtttgt cgtttgtcgt t 21<210>13<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>13tcgtcgtttg tcgtttgtcg tt 22<210>14<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>14tcgtcgtttt gtcgtttt 18
權利要求
1.免疫調(diào)節(jié)分子，其特征在于，它具有功能基序5′GTCGTT 3′。
2.根據(jù)權利要求1所述的免疫調(diào)節(jié)分子，其特征在于，它是以硫代磷酸酯為支架的寡脫氧核苷酸。
3.根據(jù)權利要求1所述的免疫調(diào)節(jié)分子，其特征在于，所述的功能基序的數(shù)目為2-3個。
4.根據(jù)權利要求1所述的免疫調(diào)節(jié)分子，其特征在于，它具有SEQ IDNO.1～14中的任意一個所述的序列。
5.權利要求1～4中的任意一項所述的免疫調(diào)節(jié)分子在制備用于治療和/或預防免疫性疾病的藥物中的應用。
6.根據(jù)權利要求5所述的應用，其特征在于，所述的藥物還含有其它具有治療和/或預防疾病功能的活性成分。
7.根據(jù)權利要求5所述的應用，其特征在于，所述的活性成分是疫苗。
8.根據(jù)權利要求7所述的應用，其特征在于，所述的疫苗是下述疫苗中的一種或多種甲肝疫苗、乙肝疫苗、丙肝疫苗、流感疫苗、艾滋病疫苗、腦炎疫苗、脊髓灰質(zhì)炎疫苗、肺炎疫苗、腮腺炎疫苗、水痘疫苗、麻疹疫苗、風疹疫苗。
9.根據(jù)權利要求5所述的應用，其特征在于，所述的免疫性疾病是腫瘤、自身免疫病、病毒感染性疾病或細菌感染性疾病。
10.一種合成免疫調(diào)節(jié)分子的方法，其中包括下面的A組或者B組步驟A組a)將帶保護的脫氧核糖核苷酸單體脫保護；b)與新加入的堿基進行耦聯(lián)反應；c)封閉堿基上的未反應的5’-OH；d)使核苷酸間的亞磷酸三酯進行氧化反應，生成磷酸三酯；e)合成循環(huán)。B組a)將帶保護的脫氧核糖核苷酸單體脫保護；b)與新加入的堿基進行耦聯(lián)反應；c)將堿基間磷酸上的一個氧用硫取代；d)封閉堿基上的未反應的5’-OH；e)合成循環(huán)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種免疫調(diào)節(jié)分子，它具有功能基序5′GTCGTT 3′。免疫調(diào)節(jié)分子優(yōu)選地是以硫代磷酸酯為支架的寡脫氧核苷酸，更優(yōu)選地含有2－3個所述的功能基序。本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)分子最優(yōu)選地具有SEQ ID NO.1～14中的任意一個所述的序列。本發(fā)明還提供了上述免疫調(diào)節(jié)分子的制備方法及其在制備用于治療和/或預防免疫性疾病的藥物中的應用。
文檔編號A61K39/12GK1660881SQ20051000191
公開日2005年8月31日 申請日期2005年1月12日 優(yōu)先權日2005年1月12日
發(fā)明者李求是 申請人:北京萬賽生物醫(yī)藥技術發(fā)展有限公司