一種雞新城疫、傳染性支氣管炎病毒同胚培養(yǎng)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種雞新城疫、傳染性支氣管炎病 毒同胚培養(yǎng)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 新城疫（Newcastledisease,ND)是由新城疫病毒（Newcastlediseasevirus, NDV)引起的一種烈性病毒性傳染病，是當今全球范圍內(nèi)最嚴重的家禽傳染病之一，也是我 國所有雞病中危害最大的一種，被國際獸疫局（OIE)列為A類傳染病。
[0003] 雞傳染性支氣管炎（IB)，是由傳染性支氣管炎病毒（IBV)引起的雞的一種急性、 高度接觸性傳染的病毒性疾病，W氣管羅音、咳嗽、打噴曖為主要特征，是危害養(yǎng)雞業(yè)的主 要疫病之一。雞傳染性支氣管炎的血清型眾多，目前已報道的血清型有30余種，不同血清 型毒株在毒力、致病性和組織嗜性上存在著很大差異，相互間沒有或僅有部分交叉免疫性， 同時新的血清型不斷出現(xiàn)，給IBV的預(yù)防帶來了諸多困難。
[0004] 二聯(lián)疫苗的制備，可W-針防治兩種傳染病，同時可W解決使用多種疫苗分次免 疫，造成的雞群的其它的不良反應(yīng)，簡化免疫程序，降低投入的成本。
[0005] 目前病毒的培養(yǎng)有動物接種、組織培養(yǎng)和雞胚培養(yǎng)3種方法。其中雞胚培養(yǎng)是病 毒培養(yǎng)中最常用的方法之一。雞胚是正在發(fā)育中的機體，多種動物病毒能在雞胚中增殖和 傳代。雞胚的優(yōu)點在于胚胎的組織分化程度低，而且可W選擇不同的日齡和接種途徑，病毒 在雞胚中易于增殖，部分病毒感染雞胚W后可W產(chǎn)生豆瓣，引起充血、出血、壞死灶和死亡 等特異性的感染指征。感染病毒的雞胚組織和液體中含有大量病毒，容易采集和處理，而且 來源充足，設(shè)備和操作簡便易行。
[0006] 當前國內(nèi)生產(chǎn)的新城疫、雞傳染性支氣管炎疫苗基本都是采用雞胚接種病毒后進 行增殖，收獲尿囊液制備而成。傳統(tǒng)的二聯(lián)疫苗均由單一疫苗分別生產(chǎn)后混合在一起制成 二聯(lián)疫苗，該工藝費時費力，生產(chǎn)成本較高。同胚培養(yǎng)是近年來獸用生物制品行業(yè)提出的生 產(chǎn)工藝，即將兩種病毒W(wǎng)合適的比例混合后同時接種到雞胚中進行增殖，該工藝減少了生 產(chǎn)工藝環(huán)節(jié)，縮短的生產(chǎn)周期，減少人力物力投入，大大降低了生產(chǎn)成本。但是截至到目前 為止同胚培養(yǎng)的工藝仍存在缺陷，培養(yǎng)過程中由于病毒之間的互相干擾，兩種病毒的含量 均不穩(wěn)定，批次間差異較大，困擾著該品種的生產(chǎn)，嚴重影響了后期疫苗的品質(zhì)。
[0007] 氨基酸，是生物功能大分子蛋白質(zhì)的基本組成單位，是構(gòu)成動物營養(yǎng)所需蛋白質(zhì) 的基本物質(zhì)。維生素是維持機體生命活動必須的一類有機物質(zhì)，也是保持機體健康的重要 活性物質(zhì)。維生素是酶的輔酶或者是輔酶的組成分子，維生素是維持和調(diào)節(jié)機體正常代謝 的重要物質(zhì)。在體內(nèi)砸和維生素E協(xié)同，能夠保護細胞膜，防止不飽和脂肪酸的氧化。
[0008]多糖是中藥活性成分之一，大量研究表明，多糖及糖復(fù)合物在生物體內(nèi)不僅是作 為能量資源和構(gòu)成材料，更重要的是它存在于一切細胞膜結(jié)構(gòu)中，參與生命現(xiàn)象中細胞的 各種活動。多糖類物質(zhì)是所有生命有機體的重要組成部分，具有清除自由基、提高抗氧化酶 活性和抑制脂質(zhì)過氧化的能力。但是中藥多糖的作用并不具有廣譜性，同常某種或某幾種 多糖協(xié)同作用具有特異性的活性作用。
[0009] 本發(fā)明基于上述技術(shù)背景，提出一種同胚培養(yǎng)的方法，具體是一種特別適用于雞 新城疫、傳染性支氣管炎病毒同胚培養(yǎng)的方法，解決了新城疫病毒、雞傳染性支氣管炎病毒 同胚培養(yǎng)穩(wěn)定性差、批次間差異大的培養(yǎng)難題，提高了兩種病毒的穩(wěn)定性、收獲量和病毒滴 度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計提供一種雞新城疫、傳染性支 氣管炎病毒同胚培養(yǎng)的方法的技術(shù)方案，通過該方法，可同時提高兩種病毒的穩(wěn)定性、收獲 量和病毒滴度。
[0011] 所述的一種雞新城疫、傳染性支氣管炎病毒同胚培養(yǎng)的方法，其特征在于采用雞 新城疫病毒稀釋液稀釋新城疫病毒至1000-5000倍，用雞傳染性支氣管炎病毒稀釋液稀釋 雞支氣管炎病毒至5000-10000倍，分別在4°C解育30-60分鐘后按1:1比例混合均勻，接種 9-10日齡雞胚，0. 1-0. 15ml/胚，36-37°C繼續(xù)培養(yǎng)至96小時，棄去48小時前死亡雞胚，收 獲48-96小時死活胚液，既得雞新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒混合病毒液。
[0012] 所述的一種雞新城疫、傳染性支氣管炎病毒同胚培養(yǎng)的方法，其特征在于所述的 雞新城疫病毒稀釋液為每1000 ml憐酸緩沖液中含有W下重量配比的組分：氨基酸組合3~ 5g、維生素組合6~lOg、亞砸酸鋼0~IOmg和復(fù)方中藥多糖30~lOOg。
[0013]所述的一種雞新城疫、傳染性支氣管炎病毒同胚培養(yǎng)的方法，其特征在于所述的 雞傳染性支氣管炎病毒稀釋液為每1000 ml憐酸緩沖液中含有W下重量配比的組分：氨基 酸組合2~6g、維生素組合4~8g、亞砸酸鋼0~IOmg和復(fù)方中藥多糖20~60邑。
[0014] 所述的一種雞新城疫、傳染性支氣管炎病毒同胚培養(yǎng)的方法，其特征在于所述的 雞新城疫病毒稀釋液和雞傳染性支氣管炎病毒稀釋液的pH為6. 6~7。
[0015] 所述的一種雞新城疫、傳染性支氣管炎病毒同胚培養(yǎng)的方法，其特征在于所述的 氨基酸組合含有W下重量百分比含量的氨基酸：苯丙氨酸10~50%、脫氨酸20~40%和亮 氨酸30~60%，所述的維生素組合含有W下重量百分比的維生素：維生素B2 15~40%、維 生素D20~50%和維生素E20~40%。
[0016] 所述的一種雞新城疫、傳染性支氣管炎病毒同胚培養(yǎng)的方法，其特征在于所述的 復(fù)方中藥多糖由赤巧、丹參、白薇、商陸和蟲草提取得到，具體通過W下步驟得到： 按W下步驟制得： a、 按赤巧20~40份、丹參5~20份、白薇10~30份、商陸5~20份和蟲草10~30 份稱取各中藥原料，切碎、洗凈后用冷水浸泡過夜，再加入原料重量15倍的純化水，水浴至 90°C，并保持在90°C，熬制2小時，熬制過程中每10分鐘攬拌一次； b、 棄去a中藥渣，收集藥液，室溫冷卻后經(jīng)1000化pm離屯、10分鐘，棄去沉淀，收集上 清； C、將b中上清進行醇沉，沉淀得到粗制中藥多糖； t用滅菌純化水洗涂C中粗制中藥多糖，洗涂后用20倍量的42°C滅菌純化水進行溶 解，溶解后，按0. 5%比例加入活性炭4°C吸附過夜，吸附后經(jīng)1000化pm離屯、10分鐘，棄去沉 淀，收集上清； e、 將d中上清液進行10倍濃縮，制得中藥多糖濃縮液； f、 將e中中藥多糖濃縮液進行真空冷凍干燥制得復(fù)合中藥多糖凍干粉。
[0017]所述的一種雞新城疫、傳染性支氣管炎病毒同胚培養(yǎng)的方法，其特征在于所述的 氨基酸組合包括W下重量百分比的氨基酸：蛋氨酸20~30%、色氨酸20~40%、酪氨酸10~ 30%，亮氨酸10~30%，所述的維生素組合包括W下重量百分比的維生素：維生素B2 15~ 40%、維生素D20~50%和維生素E20~40〇/〇。
[0018]所述的一種雞新城疫、傳染性支氣管炎病毒同胚培養(yǎng)的方法，其特征在于所述的 復(fù)方中藥多糖由仙茅、杜仲、巧等和續(xù)斷提取得到，具體通過W下步驟得到： a、 按仙茅10~30份、杜仲10~20份、巧等20~40份和斷續(xù)5~20份稱取各中藥 原料，切碎、洗凈后用冷水浸泡過夜，再加入原料重量15倍的純化水，水浴至90°C，并保持 在90°C，熬制2小時，熬制過程中每10分鐘攬拌一次； b、 棄去a中藥渣，收集藥液，室溫冷卻后經(jīng)1000化pm離屯、10分鐘，棄去沉淀，收集上 清； C、將b中上清進行醇沉，沉淀得到粗制中藥多糖； t用滅菌純化水洗涂C中粗制中藥多糖，洗涂后用20倍量的42°C滅菌純化水進行溶 解，溶解后，按0. 5%比例加入活性炭4°C吸附過夜，吸附后經(jīng)1000化pm離屯、10分鐘，棄去沉 淀，收集上清； e、 將d中上清液進行10倍濃縮，制得中藥多糖濃縮液； f、 將e中中藥多糖濃縮液進行真空冷凍干燥制得復(fù)合中藥多糖凍干粉。
[0019] 所述的一種雞新城疫、傳染性支氣管炎病毒同胚培養(yǎng)的方法，其特征在于所述的 憐酸緩沖液由氯化鋼6~lOg，氯化鐘0. 05~0. 5g，憐酸氨二鋼1~1. 2g，憐酸二氨鐘 0. 05~0. 5g，氯化巧0. 05~0. 2g，含6個結(jié)晶水的氯化儀0. 05~0. 2g溶于1000 ml雙蒸 水中得到。
[0020] 本發(fā)明具有積極有益的效果： (1)本發(fā)明所制備的稀釋液，可接種低日齡雞胚，因低日齡雞胚組織分化程度較低，與 現(xiàn)有技術(shù)相比，病毒更易在雞胚組織中增殖。
[0021] (2)本發(fā)明所制備的稀釋液接種雞胚后，可提高雞胚耐受病毒的能力，延長死亡時 間，即延長了病毒增殖時間，與現(xiàn)有技術(shù)相比提高了病毒滴度2~8倍。
[0022] (3)按本發(fā)明方法培養(yǎng)收獲的病毒液提高了同胚培養(yǎng)的穩(wěn)定性，大大降低了批次 間差異，為后續(xù)疫苗生產(chǎn)工藝提供了優(yōu)質(zhì)的抗原液。
【具體實施方式】
[0023] 為了使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解， 運些