免 疫，劑量同初次。二次免疫后14天測定H1N1流感抗原特異性抗體滴度。具體測定方法參 考實施例4。實驗結(jié)果見附圖4,A-B。
[0135] 實驗結(jié)果表明：初次免疫后14天，1.Omg/鼠PCP-100能顯著促進(jìn)H1N1流感抗原 免疫小鼠血清特異性抗體滴度的產(chǎn)生（P〈〇. 05)。二次免疫后14天，單獨(dú)抗原免疫組小鼠 抗體滴度明顯升高，但聯(lián)用PCP后抗體滴度顯著高于單獨(dú)抗原或加入鋁佐劑組，表明PCP對 H1N1流感抗原有明顯佐劑活性。
[0136]實施例6 :對乙肝抗原的佐劑活件評價
[0137] 將實施例1制備的茯苓多糖（PCP-55,本實施例及附圖中亦簡稱為PCP)作為佐劑， 以乙肝重組蛋白（HBsAg)為抗原（大連漢信生物制藥有限公司生產(chǎn)），PCP按照1.Omg/鼠 的劑量與乙肝抗原（2yg/鼠）配伍肌肉注射免疫小鼠。實驗分為生理鹽水對照組、單獨(dú) HBsAg抗原組、HBsAg+PCP組（1.Omg/鼠）和HBsAg+鋁佐劑組（0· 2mg/鼠）。小鼠初次免 疫后14天，ELISA方法測定乙肝抗原特異性抗體滴度。初次免疫后28天進(jìn)行二次免疫，劑 量同初次。二次免疫后14天測定乙肝抗原特異性抗體滴度。ELISA法檢測血清HBsAg特異 性抗體滴度。
[0138] 具體操作如下：
[0139] (1)HBsAg抗原包被：重組乙型肝炎表面抗原（HBsAg)用抗原包被液（0. 05M碳酸 鹽緩沖液，PH9. 6)稀釋至終濃度3mg/L，加入96孔板中，100μL/孔，置于濕盒，于4°C包被 過夜。
[0140] (2)封閉：設(shè)置好洗板儀程序，取出包被過夜的96孔酶標(biāo)板用PBST洗3次， 200μL/孔，吸去洗液后加入1%BSA(PBS配制），200μL/孔，37°C封閉1小時。
[0141] (3)加血清樣品：封閉后的96孔酶標(biāo)板用PBST洗滌3次，小鼠初次免疫血清從1 : 400開始，用PBST按2倍倍比稀釋6個梯度，加入96孔酶標(biāo)板，100μL/孔，37°C孵育1小 時；加強(qiáng)免疫后的血清從1 :4000倍倍比稀釋到1 :128000測定。
[0142] (4)加山羊抗小鼠IgG-HRP抗體：棄去血清樣品，PBST洗滌，200μL/孔，洗滌3次。 HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體用PBST1 :1000倍稀釋，加入酶標(biāo)板中，100μL/孔，37°C孵育1 小時。
[0143] (5)酶標(biāo)底物顯色：棄去二抗，PBST洗滌5次，200μL/孔。加入新鮮配制的TMB 底物顯色液，100μL/孔，室溫避光顯色15分鐘。
[0144] (6)終止顯色：加入0. 2Μ硫酸溶液終止顯色，50μL/孔，并用酶標(biāo)儀測定450nm吸 光度（A45。)。
[0145] 實驗結(jié)果表明：茯苓多糖與乙肝抗原配伍初次免疫小鼠14天，能顯著促進(jìn)抗原特 異性抗體滴度的產(chǎn)生（P〈〇. 05)，效果優(yōu)于鋁佐劑。二次免疫后茯苓多糖組和鋁佐劑組均顯 示明顯的佐劑效果，茯苓多糖的作用仍優(yōu)于鋁佐劑（見附圖5,A-B)。
[0146] 盡管本發(fā)明的【具體實施方式】已經(jīng)得到詳細(xì)的描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解。根 據(jù)已經(jīng)公開的所有教導(dǎo)，可以對那些細(xì)節(jié)進(jìn)行各種修改和替換，這些改變均在本發(fā)明的保 護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的全部范圍由所附權(quán)利要求及其任何等同物給出。
【主權(quán)項】
1. 一種茯苓多糖，其中，組成該茯苓多糖的單糖包括巖藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的茯苓多糖，其中，巖藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖之間的摩 爾比依次為 1 :(1 - 2) :(0.3 - 4) :(2 - 3.5);具體地，為 1 :(1 - 1.5) :(0.5 - 3.5): (2 - 3. 5);更具體地，為 I : (1. 3 - 1. 5) : (0? 5 - 1. 8) : (2. 6 - 3)。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的茯苓多糖，其中，按照葡萄糖計算，其含糖量為20% - 80%、 20%- 60%、20%- 40%、40%- 80% 或 40%- 60%。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的茯苓多糖，其分子量在IXlO4Da - SXlO5Da之間；具體地， 所述茯苓多糖包含兩個多糖組分，其分子量范圍分別為I X IO4Da - 8 X IO4Da和2 X IO5Da - 8 X IO5Da05. -種制備茯苓多糖的方法，包括下述步驟： 1) 將茯苓藥材用水進(jìn)行浸提，得到水提液； 2) 將步驟1)中得到的水提液在50°C - 60°C下減壓濃縮，濃縮液加入乙醇進(jìn)行沉淀，得 到沉淀物； 3) 將步驟2)中得到的沉淀物加水溶解，溶解液進(jìn)行透析或超濾； 4) 將步驟3)中透析所得的袋內(nèi)透析液或者超濾截留液在50°C - 60°C下減壓濃縮，得 到濃縮液； 5) 將步驟4)中得到的濃縮液進(jìn)行冷凍干燥或噴霧干燥，得到茯苓多糖。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于如下的（1) 一（14)項中的任意一項或 者多項： (1) 步驟1)中，所述的茯苓藥材為茯苓塊、茯苓片或茯苓粉； (2) 步驟1)中，所用水為蒸餾水或去離子水； (3) 步驟1)中，水浸提的溫度為(TC 一 KKTC，優(yōu)選為20°C - 70°C，更優(yōu)選為50°C - 70°C，進(jìn)一步優(yōu)選為 50°C - 60°C ; (4) 步驟1)中，將浸提后得到的茯苓按照相同條件進(jìn)行一次或多次浸提（例如2或3 次），合并水提液； (5) 步驟1)中，水的用量為能夠浸沒茯苓的用量，優(yōu)選為茯苓的5 - 20倍量（L/kg); (6) 步驟1)中，浸提期間進(jìn)行攪拌； (7) 步驟1)中，浸提的時間為1 一 48小時； (8) 步驟2)中，加入的乙醇的體積為濃縮液的1 一 4倍； (9) 步驟2)中，乙醇沉淀的時間為大于12小時，例如為48 - 72小時； (10) 步驟2)中，醇沉后上清液中乙醇的終濃度為50% - 80%，優(yōu)選為60% - 70% ; (11) 步驟3)中，乙醇沉淀后離心，得到的沉淀物加水進(jìn)行一次或多次溶解，離心，合并 上清液，得到溶解液； (12) 步驟3)中，透析所用的透析袋的截留分子量大于1000 ; (13) 步驟3)中，用自來水和/或蒸餾水進(jìn)行透析；透析進(jìn)行一次或多次； (14) 步驟5)中，噴霧干燥的溫度低于80°C。7. -種茯苓多糖，其由權(quán)利要求5或6所述的制備方法制得。8. -種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1至4中任一項或者權(quán)利要求7所述的茯苓多糖； 具體地，所述藥物組合物為疫苗；具體地，所述疫苗為動物或人用的減毒疫苗、滅活疫苗、蛋 白質(zhì)疫苗、DNA疫苗或多肽疫苗；更具體地，為HlNl疫苗或者乙肝疫苗。9. 一種疫苗佐劑，其包含權(quán)利要求1至4中任一項或者權(quán)利要求7所述的茯苓多糖； 具體地，所述疫苗佐劑為選自如下疫苗的佐劑：動物或人用的減毒疫苗、滅活疫苗、蛋 白質(zhì)疫苗、DNA疫苗和多肽疫苗； 更具體地，為為HlNl疫苗佐劑或者乙肝疫苗佐劑。10. 權(quán)利要求1至4中任一項或者權(quán)利要求7所述的茯苓多糖在制備疫苗、疫苗佐劑或 者抗體中的用途； 具體地，所述藥物組合物為疫苗；具體地，所述疫苗為動物或人用的減毒疫苗、滅活疫 苗、蛋白質(zhì)疫苗、DNA疫苗或多肽疫苗；更具體地，為HlNl疫苗或者乙肝疫苗； 具體地，所述疫苗佐劑為選自如下疫苗的佐劑：動物或人用的減毒疫苗、滅活疫苗、蛋 白質(zhì)疫苗、DNA疫苗和多肽疫苗；更具體地，為為HlNl疫苗佐劑或者乙肝疫苗佐劑。
【專利摘要】本發(fā)明屬于中藥學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域，涉及一種茯苓多糖、其制備方法及用途。具體地，組成該茯苓多糖的單糖包括巖藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖。本發(fā)明還涉及一種藥物組合物以及所述茯苓多糖用于制備疫苗佐劑、疫苗組合物或抗體的用途。本發(fā)明制備的茯苓多糖具有良好的疫苗佐劑作用。
【IPC分類】C08B37/00, A61P31/14, A61K39/39, A61P31/16
【公開號】CN105237649
【申請?zhí)枴緾N201410330603
【發(fā)明人】王玉霞, 單俊杰, 李帥, 李海霞, 賈培媛, 麻浩, 武軍華, 刁玉林, 劉圓圓, 張永平
【申請人】中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所, 北京中安佐際生物科技有限公司
【公開日】2016年1月13日
【申請日】2014年7月11日