組，其下降的程度及速率要緩慢得多，說明本發(fā)明的KPC碳 青霉締酶抑制膚對(duì)KPC-2碳青霉締酶具有明顯的抑制作用；(3)組為陰性對(duì)照，吸光在整個(gè) 過程中基本無變化，說明底物美羅培南的水解是由KPC-2碳青霉締酶催化水解，與酶促反 應(yīng)體系中緩沖液等物質(zhì)無關(guān)。
[0041] 實(shí)施例3KPC碳青霉締酶抑制膚與β內(nèi)酷胺類抗生素協(xié)同抗菌作用測(cè)定
[0042] 為了能夠安全進(jìn)行協(xié)同抗菌實(shí)驗(yàn)，使用相對(duì)安全的基因工程菌E.coli Rosetta(DE3)/pET28a-KPC-2菌株作為耐藥菌株，將E.coliRosetta(DE3)菌株作為陰性 對(duì)照。采用二倍稀釋法測(cè)定最小抑菌濃度（MinimumInhibitoiTConcentration,MIC),通 過MIC值的變化反應(yīng)本發(fā)明的KPC碳青霉締酶抑制膚與β內(nèi)酷胺類抗生素的協(xié)同抗菌作 用。
[0043] 具體方法如下；
[0044] 將-80°C超低溫冰箱中保存的能表達(dá)KPC-2碳青霉締酶的工程菌菌株Ε.coli Rosetta(DE3)/pET28a-KPC-2(耐藥工程菌）W及對(duì)照菌株E.coliRosetta(DE3)分別接種 于滅菌的Luria-Bertani(LB)固體培養(yǎng)基中，于37°C恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)16小時(shí)。用 接種環(huán)挑取單菌落分別轉(zhuǎn)接到滅菌的液體LB培養(yǎng)基中，于37°C、ISOrpm條件下在震蕩培養(yǎng) 至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定600nm波長(zhǎng)處菌液的吸光度值（ODe。。)，根據(jù)10D= 1Xl〇9CFU/mL的換算關(guān)系，分別將表達(dá)KPC-2碳青霉締酶的工程菌菌株W及對(duì)照菌株用滅 菌的LB培養(yǎng)基稀釋至2X105CFU/mL。
[0045] 實(shí)驗(yàn)組均使用能表達(dá)KPC-2碳青霉締酶的工程菌E.coliRosetta(DE^ / 祀T28a-KPC-2。
[004引實(shí)驗(yàn)組（1):首先在無菌96孔板中先加入滅菌的LB培養(yǎng)基100μL;接下來將經(jīng) 0. 22μm微孔濾膜過濾除菌的濃度為1024μgAiL的β-內(nèi)酷胺類抗生素溶液（β-內(nèi)酷胺 類抗生素溶液用滅菌的LB培養(yǎng)基稀釋得到）100μL加入到第1孔中，混合均勻后取100μL 加入第2孔中，依次倍比稀釋，從第12孔吸出100μL棄去；最后向各孔中加入稀釋好的菌 液（上述2X105C即/血的菌液）100μL混合均勻。
[0047]實(shí)驗(yàn)組似：首先在無菌96孔板中先加入滅菌的LB培養(yǎng)基100μL;接下來將經(jīng) 0. 22μm微孔濾膜過濾除菌的濃度為1024μg/mL的β-內(nèi)酷胺類抗生素溶液100μL加入 到第1孔中，混合均勻后取100μL加入第2孔中，依次倍比稀釋，從第12孔吸出100μL 棄去；最后向各孔中加入稀釋好的含有經(jīng)0. 22μm微孔濾膜過濾除菌的濃度為40μmol/L KPC碳青霉締酶抑制膚的菌液（含有40μmol/LKPC碳青霉締酶抑制膚的上述2X105CFU/ 血的菌液）100μL，混合均勻，各孔中抑制膚的終濃度為20μmol/L。
[004引實(shí)驗(yàn)組（3):首先在無菌96孔板中先加入滅菌的LB培養(yǎng)基100μL;接下來向孔中 加入稀釋好的含有經(jīng)0. 22μm微孔濾膜過濾除菌的濃度為40μmol/LKPC碳青霉締酶抑制 膚的菌液100μL混合均勻，孔中抑制膚的終濃度為20μmol/L。
[0049] 對(duì)照組使用不含表達(dá)KPC-2碳青霉締酶質(zhì)粒的空菌E.coliRosetta(DE3)。
[0050] 對(duì)照組：首先在無菌96孔板中先加入100μL滅菌的LB培養(yǎng)基；接下來將經(jīng) 0. 22μm微孔濾膜過濾除菌的濃度為1024μg/mL的β-內(nèi)酷胺類抗生素溶液100μL加入 到第1孔中，混合均勻后取100μL加入第2孔中，依次倍比稀釋，從第12孔吸出100μL棄 去；最后向各孔中加入稀釋好的菌液100μ以混合均勻。
[0051]W上各組于37 +rc震蕩培養(yǎng)18小時(shí)，測(cè)定波長(zhǎng)為600nm處的吸光度值。最小抑 菌濃度（MIC)取檢測(cè)不到細(xì)菌生長(zhǎng)（0成。。《0.01)的孔中各β內(nèi)酷胺類抗生素的終濃度 的最低值，結(jié)果如表2。
[0052] 表2KPC碳青霉締酶抑制膚與β內(nèi)酷胺類抗生素協(xié)同抗菌作用結(jié)果（MIC/(μg/ 血)）
[0053]
[005引由表2結(jié)果可知，對(duì)照組中各e-內(nèi)酷胺類抗生素對(duì)不耐藥的菌株E.coli Rosetta(DE3)具有良好的抑制作用（MIC《0. 5μg/mL)，說明不含表達(dá)耐藥酶KPC-2碳青 霉締酶質(zhì)粒的空菌對(duì)各抗生素均敏感。實(shí)驗(yàn)組（1)使用的菌株為表達(dá)KPC-2耐藥酶的工程 菌，除單環(huán)β-內(nèi)酷胺類抗生素氨曲南外，其余各抗生素對(duì)該工程菌的MIC> 512μg/mL， 說明該工程菌因表達(dá)KPC-2碳青霉締酶而具有多藥耐藥性。實(shí)驗(yàn)組（3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一一菌株 E.coliRosetta(DE3)/pET28a-KPC-2在僅含有20μmol/L抑制膚的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)18小 時(shí)后菌液十分渾濁，在600nm處的吸光度0成。。> 4,仍正常生長(zhǎng)，表明KPC碳青霉締酶抑制 膚本身并無抑菌活性。實(shí)驗(yàn)組（2)與實(shí)驗(yàn)組（1)相比各抗生素的MIC大幅度降低，表明各 0 -內(nèi)酷胺類抗生素與KPC碳青霉締酶抑制膚合用后，由于抑制膚抑制了KPC-2碳青霉締酶 水解底物β-內(nèi)酷胺類抗生素的活性，使得各β-內(nèi)酷胺類抗生素不被酶水解破壞而發(fā)揮 其抗菌活性。
[0056] 從實(shí)驗(yàn)組的MIC可W看出，當(dāng)KPC碳青霉締酶抑制膚與各β-內(nèi)酷胺類抗生素聯(lián) 合使用時(shí)，通過協(xié)同作用能明顯提高各β-內(nèi)酷胺類抗生素的抗菌活性，特別是實(shí)驗(yàn)組（2) 當(dāng)KPC碳青霉締酶抑制膚濃度(? = 20μmol/L時(shí)，美羅培南的抗菌活性（MIC值）提高了 至少 1024 倍巧 12μg/血今0. 5μg/血=1024)。
[0057]實(shí)施例4KPC碳青霉締酶抑制膚溶血活性（HCJ的測(cè)定
[005引采集人靜脈血，將所采集的血液與阿氏液（AlseverSolution,葡萄糖20. 5g、巧樣 酸鋼8.Og、巧樣酸0. 5g、氯化鋼4. 2g，加蒸饋水至1000血，混合后加熱溶化，115°C滅菌10 分鐘，4°C保存）按1:1 (體積比）比例混合置于離屯、管中，10(K)rpm離屯、6分鐘，用滅菌生理 鹽水洗涂至上清液無色。將上述洗涂好的紅細(xì)胞懸浮于抑值為7. 4的0. 01MPBS緩沖液中， 制備紅細(xì)胞懸浮液巧％，v/v)。將KPC碳青霉締酶抑制膚溶解于pH值為7. 4的0. 01MPBS 緩沖液中，配成濃度為15mg/mL的儲(chǔ)備液，取10支ImL滅菌的化pendorf管并編號(hào)，首先在 2-10管中加入0. 5mLPBS緩沖液，第1管、第2管加入0. 5mL抑制膚儲(chǔ)備液；然后將第2管 中的溶液混勻后吸取0. 5mL至第3管中并混勻，依次倍比稀釋；最后從第10管中吸出0. 5mL 棄去。補(bǔ)加0. 5血配好的5 %人血紅細(xì)胞懸浮液至終體積為ImL，輕輕混勻，于37 +rC恒溫 培養(yǎng)箱中保溫60分鐘，300化pm離屯、12分鐘，取上清液在415皿波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，進(jìn)行比 色。W紅細(xì)胞懸浮于PBS緩沖液中為陰性對(duì)照，W紅細(xì)胞懸浮于1 %TritonX-100中為陽 性對(duì)照。HCw為用溶血百分率為50%時(shí)的KPC碳青霉締酶抑制膚濃度，即肥W為半數(shù)溶血 量。
[0059] 溶血百分率用W下公式計(jì)算：
[0060]
[0061] 樣品的吸光度=抑制膚處理組吸光度值一陰性對(duì)照組吸光度值，
[0062] 溶血樣品吸光度=陽性對(duì)照組吸光度值一陰性對(duì)照組吸光度值。
[006引結(jié)果表明，本發(fā)明的KPC碳青霉締酶抑制膚在本實(shí)驗(yàn)所達(dá)到的最高濃度7. 5mg/mL時(shí)未見溶血（溶血百分率< 1% )。
[0064] 實(shí)施例5
[0065] 取本發(fā)明的KPC碳青霉締酶抑制膚（Pro-Asn-Gln-Trp) 0.Ig、淀粉2g、糊精2g混 合，質(zhì)量濃度為30%的藥用級(jí)聚乙締化咯燒酬（PV巧為粘合劑，制粒，壓片，既得片劑。
[006引實(shí)施例6
[0067] 取的KPC碳青霉締酶抑制膚（Pro-Asn-Gln-T巧）1.Og、甘露醇15g，置于容器中，加 適量憐酸鹽緩沖液化〇5mol/LpH7. 8)溶解，加注射用水至200mU搖勻，加2~4g針用活 性炭，室溫?cái)埌?5~90分鐘，粗濾，用0. 22μm濾膜過濾除菌，分裝，每瓶ImU采用速凍的 方法，每分鐘降溫5~15°C，降溫至-45°C，維持2. 5小時(shí)，抽真空，在真空狀態(tài)下緩慢升溫， 升溫速度每小時(shí)0. 5~10°C，溫度升至30°C時(shí)停止升溫，待溫度降至室溫后取出，加蓋密 封，既得凍干粉針劑。
[0068] 上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種KPC碳青霉烯酶抑制肽，其特征在于：所述的KPC碳青霉烯酶抑制肽的氨基酸 序列為Pr〇-Asn-Gln_Trp。2. 權(quán)利要求1所述的KPC碳青霉烯酶抑制肽的制備方法，其特征在于：所述的方法為 固相合成法。3. 權(quán)利要求1所述的KPC碳青霉烯酶抑制肽在抑制KPC碳青霉烯酶中的應(yīng)用。4. 權(quán)利要求1所述的KPC碳青霉烯酶抑制肽在制備預(yù)防和/或治療耐藥菌感染疾病 的藥物和/或抗菌藥物中的應(yīng)用；所述的耐藥菌為因產(chǎn)KPC碳青霉烯酶而獲得耐藥性的細(xì) 菌，所述的抗菌為抗所述耐藥菌。5. -種抗菌藥物組合物，其特征在于：包含權(quán)利要求1所述的KPC碳青霉烯酶抑制肽。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的抗菌藥物組合物，其特征在于：還包含所述的KPC碳青霉烯 酶抑制肽在藥學(xué)上可接受的鹽和/或藥學(xué)上可接受的載體。7. -種抗菌藥物組合物，其特征在于：包含權(quán)利要求1所述的KPC碳青霉烯酶抑制肽 和β-內(nèi)酰胺類抗生素。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的抗菌藥物組合物，其特征在于：所述的β-內(nèi)酰胺類抗生素 為氨芐西林、阿莫西林、哌拉西林、替卡西林、氟氧頭孢、頭孢替唑、頭孢噻肟、頭孢曲松鈉、 頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢洛林、亞胺培南、美羅培南、比阿培南、多尼培南、厄他培南、氨曲 南中的一種或多種。9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的抗菌藥物組合物，其特征在于：還包含所述的KPC碳青霉烯 酶抑制肽和β-內(nèi)酰胺類抗生素藥學(xué)上可接受的鹽和/或藥學(xué)上可接受的載體。10. 根據(jù)權(quán)利要求5-9任一項(xiàng)所述的抗菌藥物組合物，其特征在于：所述的抗菌藥物為 注射劑、片劑、注射用無菌粉末、注射用無菌粉末、粉劑、顆粒劑、膠囊劑、□服液、膏劑或霜 劑；所述的抗菌藥物通過注射、口服、滴鼻、滴眼、物理或化學(xué)介導(dǎo)的方法導(dǎo)入肌肉、內(nèi)皮、皮 下、靜脈或粘膜組織，或是被其他物質(zhì)混合或包裹后導(dǎo)入肌體。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種KPC碳青霉烯酶抑制肽及其應(yīng)用，屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。本發(fā)明的KPC碳青霉烯酶抑制肽的氨基酸序列為Pro-Asn-Gln-Trp，通過固相合成法可制備得到，其對(duì)KPC碳青霉烯酶具有明顯的抑制作用。本發(fā)明的抑制肽與β-內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)合使用可避免抗生素被酶水解破壞而失效，可用于制備預(yù)防和/或治療耐藥菌感染疾病的藥物和/或抗菌藥物。本發(fā)明的KPC碳青霉烯酶抑制肽具有較強(qiáng)的酶抑制活性，溶血活性低，人工合成便捷，適合產(chǎn)業(yè)化，為開發(fā)新的抗菌藥物及復(fù)方制劑提供了新的選擇，在治療耐藥菌感染領(lǐng)域具有良好的開發(fā)前景。
【IPC分類】A61K38/07, A61P31/04, C07K1/04, C07K5/117
【公開號(hào)】CN105254711
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510689211
【發(fā)明人】沈秉正, 高翔, 祝成亮, 宋金春, 曾智, 彭燕
【申請(qǐng)人】武漢大學(xué)
【公開日】2016年1月20日
【申請(qǐng)日】2015年10月22日