一種芋螺毒素變異體gmviia及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明公開了一種芋螺毒素變異體GMVIIA的制備方法，屬于基因工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]芋螺毒素是由海洋軟體動物芋螺iConus)分泌的一類用于自衛(wèi)和捕食的活性肽類毒素，通常由10-30個(gè)氨基酸殘基組成，大多富含半胱氨酸，具有高度保守的二硫鍵骨架。芋螺毒素能特異性地作用于體內(nèi)多種(鉀、鈉、鈣等)離子通道、細(xì)胞膜上的各種神經(jīng)遞質(zhì)和激素的受體，從而干擾細(xì)胞或神經(jīng)中的信號傳遞。因此，在治療慢性疼痛、急性疼痛、癲癇、神經(jīng)保護(hù)、心血管疾病、精神失常、運(yùn)動失調(diào)、痙攣癥、癌癥及中風(fēng)等方面具有廣泛的應(yīng)用前景。ω -芋螺毒素MVIIA ( ω -MVIIA)來源于海洋生物幻芋螺(Conus magus,也稱僧袍芋螺)，能特異地阻斷鈣離子通道，阻止疼痛信號的傳導(dǎo)，以其為有效成分的Ziconotide (商品名 Prialt?)已被FDA批準(zhǔn)用于治療慢性疼痛(Terlau, Olivera.Conus venoms: a richsource of novel 1n channel-targeted peptides.Phys1l Rev.2004, 84: 41-68)。
[0003]由于芋螺中芋螺毒素含量低，且大量采集海洋生物也不利于保持生態(tài)平衡，所以，利用經(jīng)典的生化提取的方法直接從芋螺中分離芋螺毒素已經(jīng)難以滿足研究和藥物生產(chǎn)的需要。許多科學(xué)家希望采用多肽固相合成的方法來解決這一困難，但是人工合成芋螺毒素的成本很高，還不能完全滿足作為藥物商業(yè)化生產(chǎn)的要求。因此，有科學(xué)家提出可將芋螺毒素的基因轉(zhuǎn)化到大腸桿菌等微生物中表達(dá)(Zhan et al.A fus1n protein of conotoxinMVIIA and th1redoxin expressed in Escherichia coli has significant analgesicactivity.B1chem B1phys Res Commun.2003, 311: 495-500)。
[0004]在表達(dá)的重組芋螺毒素中，Trx標(biāo)簽(硫氧還蛋白標(biāo)簽)不僅有利于目的蛋白的可溶性表達(dá)，還能促進(jìn)三對二硫鍵的正確形成。但是Trx標(biāo)簽本身長度為109個(gè)氨基酸殘基，分子量較大，如不切除，會極大程度地影響芋螺毒素的在體內(nèi)的滲透性，從而影響鎮(zhèn)痛效果。在理論上，使用腸激酶切割重組蛋白即可去除Trx標(biāo)簽，但是在天然的成熟ω-MVIIA的C末端為半胱氨酸殘基(Cys)，當(dāng)腸激酶切割位點(diǎn)(DDDDK)之后為半胱氨酸殘基(Cys)時(shí)，腸激酶不能有效地切割。為了克服這一問題，本發(fā)明在ω-MVIIA的C末端引入了一個(gè)側(cè)鏈集團(tuán)較小的甘氨酸殘基(Gly)，研究證實(shí)，甘氨酸殘基(Gly)的引入，可使芋螺毒素變異體GMVIIA被腸激酶有效切割下來。利用本發(fā)明提出的方案制備的芋螺毒素變異體GMVIIA表現(xiàn)出較高的鎮(zhèn)痛活性，具有極大的應(yīng)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于公開一種高效表達(dá)具鎮(zhèn)痛活性的芋螺毒素變異體GMVIIA的制備方法及其應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的:
一種芋螺毒素變異體GMVIIA的制備方法，其特征在于，包含以下步驟:
(!)設(shè)計(jì)并合成ω-MVIIA變異體基因GMVIIA ； (2)利用步驟(I)合成的ω-MVIIA變異體基因GMVIIA構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-32a_GMVIIA，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入宿主菌，得到基因工程菌；
(3)將步驟(2)得到的基因工程菌接種于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后高效表達(dá)產(chǎn)生可溶性重組蛋白Trx-GMVIIA ;
(4)用鎳離子親和層析純化后獲得重組蛋白Trx-GMVIIA。
[0007](5)切割重組蛋白Trx-GMVIIA獲得重組芋螺毒素變異體GMVIIA。
[0008]其中，步驟(I)中所述的設(shè)計(jì)并合成ω -MVIIA變異體基因GMVIIA的具體方法為:根據(jù)大腸桿菌密碼子使用頻率優(yōu)化芋螺毒素ω-MVIIA基因的密碼子，在優(yōu)化后的芋螺毒素ω-MVIIA的N端引入一個(gè)甘氨酸(Gly)殘基，命名為GMVIIA，其核苷酸序列如SEQ IDN0.1所示。
[0009]其中，步驟(2)中所述的重組質(zhì)粒是將步驟(I)合成的ω-MVIIA變異體基因GMVIIA經(jīng)KpnVHindYW雙酶切后，連入經(jīng)同樣酶切的原核表達(dá)載體pET_32a得到的；所述宿主菌為大腸桿菌Origami (DE3)菌株感受態(tài)細(xì)胞。
[0010]其中，步驟(5)中所述的切割重組蛋白Trx-GMVIIA具體操作為:采用腸激酶切割重組蛋白Trx-GMVIIA釋放出GMVIIA，進(jìn)一步用鎳離子親和層析去除Trx標(biāo)簽，獲得重組芋螺毒素變異體GMVIIA。
[0011]本發(fā)明還提供一種根據(jù)上述方法得到的重組芋螺毒素變異體GMVIIA，所述重組芋螺毒素變異體GMVIIA具有鎮(zhèn)痛活性。
[0012]本發(fā)明另外提供一種所述重組芋螺毒素變異體GMVIIA在制備鎮(zhèn)痛藥物中的應(yīng)用。
[0013]本發(fā)明的有益效果:
本發(fā)明借助基因工程手段在大腸桿菌中高效表達(dá)可溶性的Trx-GMVIIA(15.3 kDa)，經(jīng)鎳離子親和層析分離純化后，采用腸激酶切割Trx-GMVIIA，進(jìn)而去除Trx標(biāo)簽及His標(biāo)簽，獲得分子量較小(2.8 kDa)的重組芋螺毒素變異體GMVIIA。以2.0 mg/kg劑量注射小鼠，進(jìn)行小鼠醋酸扭體實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，注射GMVIIA后，小鼠的平均扭體次數(shù)為3.55次，與注射生理鹽水陰性對照相比，具有顯著的鎮(zhèn)痛活性，與注射Trx-GMVIIA的陽性對照組相比，小分子量GMVIIA具有更強(qiáng)的鎮(zhèn)痛活性。因此，使用本發(fā)明制備的重組芋螺毒素變異體GMVIIA具有極高的鎮(zhèn)痛活性，在鎮(zhèn)痛領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
【附圖說明】
[0014]圖1:重組芋螺毒素Trx-GMVIIA、Trx-ω-MVIIA結(jié)構(gòu)示意圖。Trx標(biāo)簽?zāi)艽龠M(jìn)重組蛋白的可溶性表達(dá)，并促進(jìn)形成正確的二硫鍵。His標(biāo)簽為多聚His標(biāo)簽，可用于鎳離子親和層析分離純化重組蛋白。箭頭所示為腸激酶的切割位點(diǎn)。X表示雖有腸激酶切割位點(diǎn)，但腸激酶并不能有效切割。
[0015]圖2:腸激酶切割重組蛋白后的電泳結(jié)果。M:蛋白質(zhì)marker，1:未經(jīng)腸激酶切割的重組蛋白Trx-GMVIIA，2:重組蛋白Trx-co-MVIIA的腸激酶切割產(chǎn)物，3:重組蛋白Trx-GMVIIA的腸激酶切割產(chǎn)物，4:純化的GMVIIA。箭頭所示為腸激酶切割后GMVIIA對應(yīng)條帶。
[0016]圖3:重組芋螺毒素GMVIIA的鎮(zhèn)痛活性分析結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0017]在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非有另外說明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。下面結(jié)合具體的實(shí)施例，并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。這些實(shí)施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0018]本發(fā)明實(shí)施例所用的表達(dá)載體pET_32a易被類似功能的表達(dá)載體替換，本發(fā)明所用的表達(dá)菌株也可被類似功能的大腸桿菌菌株替換。
[0019]實(shí)施例1:芋螺毒素GMVIIA基因的合成與鑒定
根據(jù)大腸桿菌密碼子使用頻率，對芋螺毒素ω-MV