一種基于細(xì)菌表面展示系統(tǒng)的病毒受體捕獲體系的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體設(shè)及一種基于細(xì)菌表面展示系統(tǒng)的病毒受體捕獲 體系，尤其是對(duì)無法體外培養(yǎng)的病毒的受體的捕獲體系。
【背景技術(shù)】
[0002] 分析和鑒定病毒受體是探索研究病毒入侵細(xì)胞和宿主感染機(jī)制的關(guān)鍵步驟。目 前，病毒受體分析主要依賴于體外培養(yǎng)并富集的大量病毒顆粒，并對(duì)病毒受體進(jìn)行特異性 吸附處理；然后，W超高速離屯、獲得病毒與其受體的復(fù)合物；最后，對(duì)上述復(fù)合物進(jìn)行分析 和鑒定，從而獲得病毒受體的組分和結(jié)構(gòu)，也用于探索病毒新受體。
[0003] 經(jīng)典的病毒受體分析方法主要針對(duì)于可體外培養(yǎng)的病毒。對(duì)于目前無法進(jìn)行體外 培養(yǎng)的病毒（如：人源諾如病毒，humannoroviruses)來說，病毒雙體分析變得非常艱難。 如何大量獲得病毒顆?；虿《疽職さ鞍壮蔀榻鉀Q相關(guān)病毒受體分析的關(guān)鍵步驟。若獲得大 量病毒顆粒只有通過感染人體，且樣本處理較為繁瑣，運(yùn)顯然不適于科學(xué)研究。隨著分子生 物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，體外表達(dá)系統(tǒng)逐漸完善，使體外表達(dá)不能體外培養(yǎng)的病毒衣殼蛋白 成為最為可行的病毒受體分析和鑒定途徑。但是，體外表達(dá)蛋白質(zhì)的純化成本高、效率低、 費(fèi)時(shí)費(fèi)力且對(duì)操作人員的技術(shù)W及相關(guān)實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求高。
[0004] 細(xì)菌細(xì)胞表面展示系統(tǒng)是指通過脫氧核糖核酸重組技術(shù)，將某外源蛋白的編碼基 因與可錯(cuò)定于受體細(xì)菌表面的編碼基因進(jìn)行融合，通過融合蛋白在受體細(xì)胞中表達(dá)、分泌， 最終將融合蛋白跨膜錯(cuò)定在宿主細(xì)胞的表面，達(dá)到研究融合蛋白功能或?qū)θ诤系鞍走M(jìn)行應(yīng) 用的目的。冰核蛋白（ice-nucleationprotein,INP)可通過糖基憐脂酷肌醇而錯(cuò)定在細(xì) 菌表面，利于大分子蛋白的表面展示。INP的N端結(jié)構(gòu)域也具有完整INP的表面展示功能。 錯(cuò)定于細(xì)胞表面的外源蛋白可W克服融合蛋白在細(xì)菌胞內(nèi)無法正確折疊等弊端。另外，細(xì) 胞表面展示的外源蛋白可與細(xì)胞外環(huán)境中的特定反應(yīng)物直接接觸并發(fā)生相互作用，捕獲環(huán) 境中的特定反應(yīng)物；輔W簡單的低速離屯、即可獲得特定反應(yīng)物與細(xì)胞展示體系的復(fù)合物， 從而免去不得不從細(xì)胞內(nèi)提取與純化等一系列復(fù)雜低效的操作過程，也為探索可與外源蛋 白結(jié)合的新物質(zhì)提供一套簡便的方法。但是，截至目前，未見將細(xì)菌細(xì)胞表面展示體系用于 病毒受體分析的報(bào)道。 陽0化]此外，文獻(xiàn)表明，諾如病毒是誘發(fā)病毒性胃腸炎最主要的病原體，病毒性胃腸炎病 例中約占90%。諾如病毒可W在任何年齡段人群、任何場所暴發(fā)。而引發(fā)病毒感染宿主細(xì) 胞的主要介質(zhì)就是病毒受體。因此，研究病毒受體是了解病毒致病機(jī)制的一個(gè)重要手段。
[0006] 因此，本領(lǐng)域的技術(shù)人員致力于開發(fā)一種成本低、效率高、降低對(duì)時(shí)間和設(shè)備要求 的捕獲病毒受體的方法，特別是用于捕獲不能體外培養(yǎng)的病毒的受體的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 有鑒于現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種成本低、效 率高、降低對(duì)時(shí)間和設(shè)備要求的捕獲病毒受體的方法，特別是用于捕獲不能體外培養(yǎng)的病 毒的受體的方法，尤其是針對(duì)諾如病毒的病毒受體的捕獲方法。
[0008] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種基于細(xì)菌表面展示系統(tǒng)的病毒受體捕獲體 系，包括W下步驟：
[0009] 1)將病毒的衣殼蛋白編碼基因片段與編碼冰核蛋白N端結(jié)構(gòu)域的編碼基因片段 融合，獲得融合基因片段；
[0010] 2)將所述融合基因片段插入誘導(dǎo)型原核表達(dá)質(zhì)粒中，得到重組誘導(dǎo)型表達(dá)質(zhì)粒；
[0011] 3)將所述重組誘導(dǎo)型表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入宿主菌，獲得所述病毒的衣殼蛋白的細(xì)菌表 面展不系統(tǒng)；
[0012] 4)在誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)下使所述病毒的衣殼蛋白展示在所述細(xì)菌的表面，獲得所述病 毒的病毒受體捕獲體系。
[0013] 其中，在步驟1)或2)之后，還可W包括驗(yàn)證所述融合基因片段的脫氧核糖核酸序 列的步驟，用W確認(rèn)插入片段的正確性。
[0014] 進(jìn)一步地，步驟1)中的病毒為諾如病毒。
[0015] 進(jìn)一步地，步驟1)中的病毒的衣殼蛋白編碼基因片段為衣殼蛋白全長編碼基因， 其序列如SEQIDN0:1所示。
[0016] 可選地，步驟1)中的病毒的衣殼蛋白編碼基因片段是衣殼蛋白C端結(jié)構(gòu)域編碼基 因片段，其序列如SEQIDNO:2所示。
[0017] 進(jìn)一步地，步驟1)中的冰核蛋白N端結(jié)構(gòu)域的編碼基因片段，其序列如SEQID NO: 3所示。
[0018] 進(jìn)一步地，擴(kuò)增衣殼蛋白全長編碼基因的特異性引物為：
[0019] P1：GGAAGATCTATGAAGATGGCGTCG
[0020] P2 ：CCGGAATTCTTATAAAGCACGTCTG；
[0021] 擴(kuò)增衣殼蛋白C端結(jié)構(gòu)域編碼基因片段的特異性引物為：
[0022] P3 ：CCATGGATGGATCTCGACAAGGCG
[0023] P4 ：AGATCTGGTCTGCAAATTCTGCGG；
[0024] 擴(kuò)增冰核蛋白N端結(jié)構(gòu)域的編碼基因片段的特異性引物為： 陽0巧]P5 :AGATCTTCAAGAACTAAACCATTCTC
[0026] P6 :GAATTCTTATAGTGCACGCCTACGCC。
[0027] 進(jìn)一步地，步驟4)中的誘導(dǎo)包括W下步驟：
[0028] (i)將轉(zhuǎn)化有重組誘導(dǎo)型表達(dá)質(zhì)粒的宿主菌接種于培養(yǎng)基中，在3(TC~37Γ條件 下震搖培養(yǎng)12小時(shí)~14小時(shí)；
[0029] αU將步驟ω中的細(xì)菌培養(yǎng)物W體積比1%~10%的接種量，轉(zhuǎn)接于新鮮培養(yǎng) 基中，在30°C~37°C條件下震搖培養(yǎng)；
[0030] (iii)待步驟（ii)中的細(xì)菌培養(yǎng)物ODe。。為0. 5~0. 9時(shí)，無菌條件下添加終濃度 為0.Immol/L~1.Ommol/L異丙基硫代-β-D-半乳糖巧，16°C~26°C條件下繼續(xù)震搖培養(yǎng) 12小時(shí)~24小時(shí)。
[0031] 進(jìn)一步地，宿主菌為大腸桿菌化21。
[0032] 本發(fā)明還提供了對(duì)上述基于細(xì)菌表面展示系統(tǒng)的病毒受體捕獲體系的應(yīng)用，用于 難W進(jìn)行體外培養(yǎng)的病毒的受體研究。
[0033] 進(jìn)一步地，上述基于細(xì)菌表面展示系統(tǒng)的病毒受體捕獲體系可用于吸附和分離病 毒的受體。
[0034] 本方法的優(yōu)勢在于：可W通過簡單的誘導(dǎo)方式使病毒衣殼蛋白高效表達(dá)并錯(cuò)定于 宿主細(xì)菌的表面，從而應(yīng)用于病毒受體的吸附、富集W及病毒新受體的探索。
[0035] 本發(fā)明通過基因工程手段將病毒衣殼蛋白與表面展示相關(guān)的蛋白融合，通過簡單 的誘導(dǎo)方式使病毒衣殼蛋白高效表達(dá)并錯(cuò)定于宿主細(xì)菌的表面，免去了純化病毒衣殼蛋白 的繁雜步驟，運(yùn)不僅大大降低了獲取病毒衣殼蛋白的成本，而且大幅縮短病毒衣殼與病毒 受體復(fù)合物的回收周期，也更容易分離環(huán)境中相應(yīng)的病毒受體，具有節(jié)約、環(huán)保的有益效 果。
[0036] W下將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的構(gòu)思、具體結(jié)構(gòu)及產(chǎn)生的技術(shù)效果作進(jìn)一步說明，W 充分地了解本發(fā)明的目的、特征和效果。
【附圖說明】
[0037]圖1是本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施例的病毒衣殼蛋白編碼基因片段（0RF2)及其3'端 基因片段（即P基因片段）和ina化基因RT-PCR或PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。 其中，Ml:DM5000Ladder;M2 :100bpLadder;1 :0RF2 片段（1623bp) ;2:P片段巧60bp); inaQn片段巧25bp)。 W38] 圖2是本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施例的重組表達(dá)質(zhì)粒祀T28a-ina化-0RF2和 祀T28a-inaG!n-P的酶切驗(yàn)證瓊脂糖凝膠電泳圖。其中，M:DMSOOOLadder;1、2 :分別W化0 I和EcoRI雙酶切祀T28a-inaG!n-0RF2 和祀T28a-inaG!n-P的產(chǎn)物。
[0039] 圖3是本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施例的人源諾如病毒細(xì)菌細(xì)胞表面展示體系與病毒 受體結(jié)合效率的檢測。
【具體實(shí)施方式】
[0040] 本發(fā)明的一個(gè)【具體實(shí)施方式】，提供一種基于細(xì)菌表面展示的病毒受體捕獲體系。 將病毒中的編碼識(shí)別并與病毒受體結(jié)合的蛋白的基因序列與負(fù)責(zé)跨膜、定位和轉(zhuǎn)運(yùn)的冰核 蛋白N端結(jié)