pTM系列質(zhì)粒載體、其構(gòu)建方法以及在布魯菌表達(dá)外源基因中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明基因工程領(lǐng)域，具體地說(shuō)，本發(fā)明設(shè)及到Ξ個(gè)用于布魯菌突變基因功能性 回復(fù)研究用質(zhì)粒pTMl-Cm、pTM2-Amp和pTM3-Km、一個(gè)用于在布魯菌中對(duì)外源基因進(jìn)行持續(xù) 高效表達(dá)的質(zhì)粒PGH-6X化s，W及一個(gè)用于在布魯菌中對(duì)外源基因進(jìn)行四環(huán)素誘導(dǎo)型可控 表達(dá)質(zhì)粒pZT-6XHis。
【背景技術(shù)】
[0002] 布魯菌病是一種呈世界范圍流行的重要的人畜共患細(xì)菌性傳染病，該病由布魯菌 屬細(xì)菌感染引起W。布魯菌是一種兼性胞內(nèi)寄生的革蘭氏陰性球桿菌，感染動(dòng)物主要引起 孕畜流產(chǎn)、死胎和公畜睪丸炎；感染人類主要引起波浪熱、不孕不育，或轉(zhuǎn)為慢性引起關(guān)節(jié) 炎等?。布魯菌感染可導(dǎo)致嚴(yán)重的發(fā)病率、重大的經(jīng)濟(jì)損失W及引發(fā)重要的公共衛(wèi)生安全 問(wèn)題。該病主要呈地方性流行?。布魯菌感染的一個(gè)重要特點(diǎn)是細(xì)菌定植于宿主的網(wǎng)狀內(nèi) 皮組織系統(tǒng)。不同于常規(guī)致病菌，布魯菌沒(méi)有典型的毒力因子，如外毒素、溶細(xì)胞素、芙膜、 菌毛、質(zhì)粒、溶源性隧菌體、藥物抵抗形式、抗原變異W及內(nèi)毒素特性脂多糖結(jié)構(gòu)等，其毒力 主要體現(xiàn)在入侵宿主細(xì)胞和在胞內(nèi)增殖的能力η53。
[0003] 目前鑒定布魯菌未知的毒力相關(guān)因子依然是研究的熱點(diǎn)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的 發(fā)展，各種新的高通量技術(shù)用來(lái)篩選布魯毒力相關(guān)因子，如轉(zhuǎn)座子隨機(jī)突變、DNA忍片、蛋白 質(zhì)組學(xué)等W ?。迄今已報(bào)道與布魯菌毒力相關(guān)的基因有245個(gè)W，然而，除了脂多糖、四型 分泌系統(tǒng)、BvrS/BvrR雙組份調(diào)控系統(tǒng)和環(huán)β -1，2-葡聚糖等外Μ 1?，大多數(shù)已報(bào)道布魯菌 毒力相關(guān)因子的功能并不十分清楚。
[0004] 布魯菌毒力因子的研究需要對(duì)祀基因進(jìn)行缺失株的構(gòu)建，基因的回補(bǔ)，基因的過(guò) 量表達(dá)W及可控性表達(dá)等技術(shù)，而運(yùn)些技術(shù)都是通過(guò)一系列質(zhì)粒作為載體來(lái)實(shí)現(xiàn)的。目前 用于布魯菌基因功能研究的常用載體為地BR1-MCS，該質(zhì)粒是一種中拷貝的廣宿主質(zhì)粒，適 合多種細(xì)菌缺失株的基因回補(bǔ)研究^/53。然而，pBBRl-MCS質(zhì)粒分子量大、拷貝數(shù)低，在用 于祀基因的功能性互補(bǔ)試驗(yàn)、持續(xù)過(guò)量表達(dá)或可控表達(dá)研究中有所限制。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供W地BR1-MCS質(zhì)粒Μ的復(fù)制起始位點(diǎn)為基礎(chǔ)，構(gòu) 建用于布魯菌基因功能研究的ρΤΜ系列質(zhì)粒載體。
[0006] 本發(fā)明的另一目的在于提供上述系列質(zhì)粒載體的構(gòu)建方法。
[0007] 本發(fā)明的再一目的在于提供上述系列質(zhì)粒載體在用于布魯菌表達(dá)外源基因中的 應(yīng)用。
[000引本發(fā)明首先構(gòu)建分別載有氯霉素（Cm)抗性基因、氨節(jié)青霉素（Amp)抗性基因和卡 那霉素（Km)抗性基因的Ξ個(gè)質(zhì)粒pTMl-Cm、pTM2-Amp和pTM3-Km。隨后WpTMl-Cm為骨架， 構(gòu)建了持續(xù)表達(dá)質(zhì)粒PGH-6X化SW及誘導(dǎo)型表達(dá)質(zhì)粒PZT-6X化S。該系列質(zhì)粒的發(fā)明將 在后續(xù)布魯菌基因功能研究中發(fā)揮重要的作用。構(gòu)建5個(gè)質(zhì)粒載體測(cè)序結(jié)果見(jiàn)序列表。
[0009] 本發(fā)明pTM系列質(zhì)粒中的pTMl-Cm質(zhì)粒載體，具有SEQIDNO. 1所示的核巧酸序 列。
[0010]所述pTMl-Cm質(zhì)粒載體，W地BR1-MCS、pR326[ie]和pCold質(zhì)粒燈akara)為模板， 采用如下引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增：
[0011]TM01 :5,-GGAATTCCATATGGCCTGCCCCTCCCTTTTGGTG-3'（SEQIDNO. 6)，
[0012] TM02 :5' -CATCAAGCTCTAGTTCGGTGGCGGCCGCATAGTCTGGAACAGCGCACTT-3'(沈QID NO. 7),
[0013]TM03 :5, -AAGTGCGCTGTTCCAGACTATGCGGCCGCCACCGAACTAGAGCTTGATG-3'（SEQID NO. 8),
[0014]TM04 :5, -ATTTGGGTGCAATGAGAATGGACGTCTAATTCGATGGGTTCCGAGG-3'(SEQID NO. 9), 陽(yáng)01引 TM05 :5' -CCTCGGAACCCATCGAATTAGACGTCCATTCTCATTGCACCCAAAT-3'(SEQID NO. 10)，
[0016]TM06 :5, -GAATTCCCATATGGAGCTCGGTACCCTCG-3'（沈QIDNO. 11)。 陽(yáng)017] 本發(fā)明所述pTMl-Cm質(zhì)粒載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟： 陽(yáng)0化]WpBBRl-MCS質(zhì)粒為模板，WTM01和TM02為引物，PCR擴(kuò)增質(zhì)粒的r巧序列；W PR326質(zhì)粒為模板，TM03和TM04為引物，PCR擴(kuò)增Cm抗性基因片段；WpCold質(zhì)粒為模板， TM05和TM06為引物，PCR擴(kuò)增質(zhì)粒的MCS-終止子序列。膠回收W上PCR產(chǎn)物片段。然后， WCm片段和MCS-終止子片段為模板，采用引物TM03和TM06為引物，進(jìn)行一輪融合PCR反 應(yīng)，所得片段膠回收后，與PCR擴(kuò)增獲得rep序列共同作為模板，WTM01和TM06為引物，進(jìn) 行第二輪融合PCR，所得片段膠回收后，經(jīng)限制性酶NdeI酶切和T4DNA連接酶進(jìn)行自連接 成環(huán)，構(gòu)建成pTMl-Cm質(zhì)粒，質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌D冊(cè)α進(jìn)行擴(kuò)增。
[0019] 本發(fā)明pTM2-Amp質(zhì)粒載體，具有SEQIDNO. 2所示的核巧酸序列。
[0020] 所述pTM2-Amp質(zhì)粒載體，WpBBRl-MCS、pUC19 (Invitrogen)和pCold質(zhì)粒為模 板，采用如下引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增：
[0021] TM01 :5, -GGAATTCCATATGGCCTGCCCCTCCCTTTTGGTG-3'（SEQIDNO. 6)，
[0022] TM06 :5, -GAATTCCCATATGGAGCTCGGTACCCTCG-3'（沈QIDNO. 11)，
[0023]TM07 :5' -CGTATCACGAGGCCCTTTCGTCGCGGCCGCATAGTCTGGAACAGCGCACTT-3(沈QID NO. 12)，
[0024]TM08 :5，-AAGTGCGCTGTTCCAGACTATGCGGCCGCGACGAAAGGGCCTCGTGATACG-3,（沈QID NO. 13)，
[0025]TM09 :5' -ATTTGGGTGCAATGAGAATGGACGTCCTACGGGGTCTGACGCTCAGTG-3'(沈QID NO. 14)，
[0026] TMIO :5' -CACTGAGCGTCAGACCCCGTAGGACGTCCATTCTCATTGCACCCAAAT-3' （SEQ ID NO.巧）。
[0027] 本發(fā)明pTM2-Amp質(zhì)粒載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟： 陽(yáng)02引 WpBBRl-MCS質(zhì)粒為模板，TM01和TM07為引物，PCR擴(kuò)增rep區(qū)序列，WpUC19質(zhì) 粒為模板，TM08和TM09為引物，PCR擴(kuò)增Amp抗性基因，WpCo1d質(zhì)粒為模板，TM10和TM06 為引物，PCR擴(kuò)增MCS-終止子區(qū)序列?？剐曰蚱魏蚆CS-終止子區(qū)序列為模板，TM08和TM06為引物，進(jìn)行一輪PCR，膠回收一輪融合片段，與PCR擴(kuò)增獲得rep序列共同作為模板， TM01和TM06為引物，進(jìn)行二輪融合PCR反應(yīng)，將二輪融合PCR產(chǎn)物膠回收，NdeI酶切后， T4連接酶自連接，構(gòu)建成pTM2-Amp質(zhì)粒。
[0029] 本發(fā)明的pTM3-Km質(zhì)粒載體，具有SEQ ID NO. 3所示的核巧酸序列。
[0030] 所述的pTM3-Km質(zhì)粒載體，W地BR1-MCS、祀T28a(Novagen)和pCold質(zhì)粒為模板， 采用如下引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增：
[0031]TM01 :5, -GGAATTCCATATGGCCTGCCCCTCCCTTTTGGTG-3'（SEQIDNO. 6)，
[0032]TM06 :5, -GAATTCCCATATGGAGCTCGGTACCCTCG-3'（沈QIDNO. 11)，
[0033]TMll:5，-CACCACTTCAAGAACTCTGTAGGCGGCCGCATAGTCTGGAACAGCGCACTT-3,（SEQID NO. 16)，
[0034]TM12 :5'-AAGTGCGCTGTTCCAGACTATGCGGCCGCCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTG-3'(沈QID NO. 17)，
[0035]TM13 :5, -ATTTGGGTGCAATGAGAATGGACGTCCAGGTGGCACTTTTCGGGGA-3'(SEQID NO. 18)，
[0036] TM14 :5' -TCCCCGAAAAGTGCCACCTGGACGTCCATTCTCATTGCACCCAAAT-3'(SEQID NO. 19)。 陽(yáng)037] 本發(fā)明所述的pTM3-Km質(zhì)粒載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟： 陽(yáng)03引 WpBBRl-MCS質(zhì)粒為模板，TM01和TM11為引物，PCR擴(kuò)增r巧區(qū)序列，W祀T28a質(zhì) 粒為模板，TM12和TM13為引物，PCR擴(kuò)增Km抗性基因，WpCold質(zhì)粒為模板，TM14和TM06 為引物，PCR擴(kuò)增MCS-終止子區(qū)序列?？剐曰蚱魏蚆CS-終止子區(qū)序列為模板，TM12和 TM06為引物，進(jìn)行一輪PCR，膠回收一輪融合片段，與PCR擴(kuò)增獲得rep序列共同作為模板， TM01和TM06為引物，進(jìn)行二輪融合PCR反應(yīng)，將二輪融合PCR產(chǎn)物膠回收，NdeI酶切后， T4連接酶自連，構(gòu)建成pTM3-Km質(zhì)粒。
[0039] 本發(fā)明的持續(xù)表達(dá)質(zhì)粒pGH-6X化s，具有SEQIDN0.4所示的核巧酸序列。 W40] 所述持續(xù)表達(dá)質(zhì)粒PGH-6X化S，W流產(chǎn)布魯菌S2308基因組為模板，WpTMl-Cm為 骨架，采用如下引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增：
[0041]groE-F:5, -GGGGTACCCCGCTGTTCGCGCAAAAACGCCA-3'（沈QIDNO.20)，
[0042]groE-R:5，-CGGGATCCATGATGATGATGATGGTGCATGGTATAACCCTTGGTGTTATAGACGTT-3' 佛QIDNO. 21)。
[0043] 本發(fā)明所述pGH-6X化s質(zhì)粒載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟：
[0044] W流產(chǎn)布魯菌S2308基因組為模板，g