專利名稱:IgA缺乏者篩查試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及生物化學(xué)領(lǐng)域,尤其涉及IgA缺乏者檢測(cè)技術(shù),特別是一 種IgA缺乏者篩查試劑盒。
背景技術(shù):
IgA是一種免疫球蛋白,根據(jù)其a鏈的不同,可以分為IgAl和IgA2 亞類。IgA2亞類有兩種同種異型A2m (1)和A2m (2) , A2m (1)多見于白 種人,A2m (2)多見于黑人和東方人種。在白人中約有1 / 700 (日本人約 為l/ 18500)血清中IgG和IgM含量正常,而lgA低于0.05g/L,稱為IgA
缺乏癥。
IgA引起的輸血免疫反應(yīng)主要有兩種, 一種是IgA缺乏癥患者受到免疫 刺激后,可產(chǎn)生抗IgA,若輸入含有IgA的血液或血液制品,則導(dǎo)致輸血反 應(yīng);另一種是IgA的不同亞類、亞型之間的血型不相容性輸血,也會(huì)產(chǎn)生 免疫性輸血反應(yīng)。目前在美國(guó)、加拿大、歐洲等國(guó)已建立IgA缺乏者檔 案。而我國(guó)尚沒有開展對(duì)IgA缺乏者的篩查,故不能提供IgA(-)的血液。 因此,我國(guó)IgA缺乏癥患者的輸血存在很大風(fēng)險(xiǎn)。
IgA引起的輸血后過敏反應(yīng)輕重不一,重度可發(fā)生過敏性休克和死 亡。我國(guó)近年來,已有多篇關(guān)于IgA輸血反應(yīng)的報(bào)道。但至今,IgA過敏 性輸血反應(yīng)發(fā)生率還沒有可靠的評(píng)估,因?yàn)樵\斷未標(biāo)準(zhǔn)化,大多數(shù)嚴(yán)重過敏 性輸血反應(yīng)患者缺乏實(shí)驗(yàn)室檢查與隨訪。我國(guó)缺乏對(duì)IgA缺乏癥患者的檢 測(cè),更缺乏提供IgA(-)的血液或血液制品。所以目前我國(guó)IgA缺乏癥患者 的輸血存在很大風(fēng)險(xiǎn)。
基于工gA引起輸血免疫反應(yīng)的嚴(yán)重性,對(duì)于有過敏性輸血反應(yīng)病史和 實(shí)驗(yàn)室確診IgA缺乏癥患者的輸血須慎重,必須輸注采自IgA缺乏者IgA(-) 獻(xiàn)血員的血漿或血小板。若在輸血緊急,且無IgA(-)血液或血液制品時(shí),
3可考慮采用去除IgA( 〈 1.2ug/ml)的靜注免疫球蛋白,或采用經(jīng)多次洗 滌后的紅細(xì)胞,許多血液中心要求洗滌5次,使白蛋白和免疫球蛋白除去 率超過95%。以減低IgA過敏反應(yīng)再次發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。
現(xiàn)有技術(shù)中,有采用放射免疫技術(shù)來進(jìn)行IgA篩查檢測(cè)的方法,這種 方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室要求高,有放射污染,操作復(fù)雜,不適合針對(duì)獻(xiàn)血員的篩査 工作,不利于推廣應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種IgA缺乏者篩查試劑盒,所述的這種IgA缺 乏者篩查試劑盒要解決現(xiàn)有技術(shù)中IgA缺乏檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、實(shí)驗(yàn)室要求高、 對(duì)檢測(cè)人員有危險(xiǎn)的技術(shù)問題。
本發(fā)明的這種IgA缺乏者篩査試劑盒由試劑和盒體構(gòu)成,所述的試劑 放置在盒體中,其中,所述的試劑由樣品稀釋液、抗體稀釋液、洗板液、 封閉液、終止液、包被抗體、酶標(biāo)二抗、人lgA抗原標(biāo)準(zhǔn)品和3, 3' ,5, 5'-四甲基聯(lián)苯胺組成,所述的樣品稀釋液是氯化鈉水溶液,在所述的氯 化鈉水溶液中,氯化鈉的重量百分比在0.8 1.0%之間,所述的抗體稀釋 液是磷酸鹽緩沖液,所述的磷酸鹽緩沖液的濃度在0. 08 0. 12 mol/L之
間,磷酸鹽緩沖液中加入有曲拉通x-ioo,所述的曲拉通X-100在磷酸鹽緩
沖液中的重量百分比在0. 8 1. 2。%之間,所述的洗板液是磷酸鹽緩沖液, 磷酸鹽緩沖液的濃度在0.08 0. 12mol/L之間,磷酸鹽緩沖液中加入有聚 氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯,所述的聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯在磷酸 鹽緩沖液中的重量百分比在0. 04 0. 06%之間,所述的封閉液是磷酸鹽緩 沖液,所述的磷酸鹽緩沖液的濃度在0.08 0. 12mol/L之間,磷酸鹽緩沖 液中加入有聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯和脫脂奶粉,所述的聚氧乙烯山 梨醇酐單月桂酸酯在磷酸鹽緩沖液中的重量百分比在0. 04 0. 06%之間, 所述的脫脂奶粉在磷酸鹽緩沖液的重量百分比在4. 0 6. 0%之間,所述的 終止液是硫酸,所述的硫酸的濃度在1.8 2.2mol/L之間,所述的包被抗
4體是羊抗人IgA抗體,所述的酶標(biāo)二抗是辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗人抗 體。
進(jìn)一步的,所述的抗體稀釋液的PH值在7 7.4之間。
進(jìn)一步的,所述的洗板液的PH值在7 7.4之間。
具體的,本發(fā)明中采用的聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯(吐溫20), 其英文名稱為Emulsifier-20; Tween-20、分子式為C58H113026、分子 量為1226. 48,是無色透明液體。略帶苦味,溶于水或極性溶劑,不溶于 礦物油及植物油。屬非離子型表面活性劑,HLB值為16.9,具有良好的乳 化、潤(rùn)濕、增容作用。
在本試劑盒中,樣品稀釋液的作用是將樣品血清1: 10000稀釋;抗
體稀釋液的作用是將抗體l: 50000稀釋;洗板液的作用是將未結(jié)合的抗 原、抗體及蛋白洗脫;封閉液的作用是將酶標(biāo)板中未結(jié)合包被抗體的結(jié)合 位點(diǎn)封閉,避免實(shí)驗(yàn)假陽(yáng)性的產(chǎn)生;終止液的作用是終止HRP對(duì)TMB的 催化作用,使藍(lán)色TMB變?yōu)辄S色;包被抗體的作用是將抗體于酶標(biāo)板
上;酶標(biāo)二抗的作用一是與已和包被抗體相結(jié)合的lgA抗原結(jié)合,二是使 標(biāo)記的HRP催化加入的TMB變?yōu)樗{(lán)色;IgA抗原標(biāo)準(zhǔn)品作用是建立此實(shí) 驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線;TMB的作用是被HRP催化后變色,使陽(yáng)性孔變色為藍(lán) 色。
本發(fā)明的工作原理是利用固定于酶標(biāo)板上的抗體和酶標(biāo)二抗分別與 樣品中被檢測(cè)抗原分子上兩個(gè)抗原決定簇結(jié)合,形成固相抗體-抗原-酶標(biāo) 抗體免疫復(fù)合物。由于反應(yīng)系統(tǒng)中固相抗體和酶標(biāo)抗體的量相對(duì)于待測(cè)抗 原是過量的,因此復(fù)合物的形成量與待測(cè)抗原的含量成正比(在方法可檢測(cè) 范圍內(nèi))。測(cè)定復(fù)合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物質(zhì)量(OD 值),即可確定待測(cè)抗原含量。
本發(fā)明與已有技術(shù)相對(duì)照,其效果是積極和明顯的。本發(fā)明因快速、 經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便、檢測(cè)數(shù)量大,本發(fā)明的IgA的檢測(cè)試劑盒可以應(yīng)用于臨床醫(yī)療單位及血站的常規(guī)血液檢測(cè),為IgA缺乏癥患者減少輸血風(fēng)險(xiǎn),提高了
輸血的安全性。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的IgA缺乏者篩査試劑盒,由試劑和盒體構(gòu)成,所述的試劑放 置在盒體中,其中,所述的試劑由樣品稀釋液、抗體稀釋液、洗板液、封
閉液、終止液、包被抗體、酶標(biāo)二抗、人IGA抗原標(biāo)準(zhǔn)品和3, 3' ,5, 5'-四甲基聯(lián)苯胺組成,所述的樣品稀釋液是氯化鈉水溶液,在所述的氯 化鈉水溶液中,氯化鈉的重量百分比在0.8 1.0%之間,所述的抗體稀釋 液是磷酸鹽緩沖液,所述的磷酸鹽緩沖液的濃度在0. 08 0. 12 mol/L之
間,磷酸鹽緩沖液中加入有曲拉通x-ioo,所述的曲拉通X-100在磷酸鹽緩
沖液中的重量百分比在0. 8 1. 2%之間,所述的洗板液是磷酸鹽緩沖液, 磷酸鹽緩沖液的濃度在0.08 0. 12mol/L之間,磷酸鹽緩沖液中加入有聚 氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯,所述的聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯在磷酸 鹽緩沖液中的重量百分比在0. 04 0. 06%之間,所述的封閉液是磷酸鹽緩 沖液,所述的磷酸鹽緩沖液的濃度在0.08 0. 12mol/L之間,磷酸鹽緩沖 液中加入有聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯和脫脂奶粉,所述的聚氧乙烯山 梨醇酐單月桂酸酯在磷酸鹽緩沖液中的重量百分比在0. 04 0. 06%之間, 所述的脫脂奶粉在磷酸鹽緩沖液的重量百分比在4. 0 6. 0%之間,所述的 終止液是硫酸,所述的硫酸的濃度在1.8 2.2mol/L之間,所述的包被抗 體是羊抗人IgA抗體,所述的酶標(biāo)二抗是辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗人抗 體。
進(jìn)一歩的,所述的抗體稀釋液的PH值在7 7. 4之間。 進(jìn)一歩的,所述的洗板液的PH值在7 7.4之間。 實(shí)施例 檢測(cè)方法如下
器材96孔平底板,試管,濕盒,水浴箱,酶標(biāo)儀,吸水紙,移液器使用抗體稀釋液將包被抗體(一塊板50ul)稀釋20倍,再使用雙蒸水 稀釋至200倍終濃度,每孔加入稀釋后抗體100ul。 4° C孵育過夜使用 TW-PBS洗板3次扣干后加入200ul封閉液37° C水浴30min,后再洗板3 次扣干,4° C低溫保存。
平底板每孔加入10000倍稀釋的待測(cè)血清100ul, 37° C水浴l小時(shí)。
將孔內(nèi)液體甩干,使用TW-PBS洗板5次,扣干,每孔加入40000倍稀 釋的酶標(biāo)二抗100ul, 37° C水浴l小時(shí)。
將孔內(nèi)液體甩干,使用TW-PBS洗板5次,扣干,每孔加入TMB100ul, 暗室反應(yīng)5-8分鐘,后加入2M硫酸終止反應(yīng)進(jìn)行。
酶標(biāo)儀讀取結(jié)果。
酶標(biāo)儀讀數(shù)0D值轉(zhuǎn)化為濃度后低于50ng/ml (0. 05ng/ul)即為陰性。 96孔板格局
標(biāo)準(zhǔn) 卩 1 口口 1標(biāo)準(zhǔn)樣品 i樣品 1樣品 9樣品 9樣品 17樣品 17樣品 25樣品 25樣品 33樣品 33
標(biāo)準(zhǔn) 口口 z標(biāo)準(zhǔn) 口 , 口口 Z樣品 2樣品 2樣品 10樣品 10樣品 18樣品 18樣品 26樣品 26樣品 34樣品 34
標(biāo)準(zhǔn) 口口 j標(biāo)準(zhǔn) 口 3 口口 j樣品 3樣品 3樣品 11樣品 11樣品 19樣品 19樣品 27樣品 27樣品 35樣品 35
標(biāo)準(zhǔn) 品4標(biāo)準(zhǔn) 品4樣品 4樣品 4樣品 12樣品 12樣品 20樣品 20樣品 28樣品 28樣品 36樣品 36
標(biāo)準(zhǔn) 口《 口口 ^標(biāo)準(zhǔn) 口 《 口n樣品樣品樣品 13樣品 13樣品 21樣品 21樣品 29樣品 29樣品 37樣品 37
標(biāo)準(zhǔn) 口《 口口 t)標(biāo)準(zhǔn) 口口 ()樣品 6樣品 6樣品 14樣品 14樣品 22樣品 22樣品 30樣品 30樣品 38樣品 38
標(biāo)準(zhǔn) 叩/標(biāo)準(zhǔn) 口口 /樣品樣品 7樣品 15樣品 15樣品 23樣品 23樣品 31樣品 31樣品 39樣品 39
空白空白樣品 8樣品 8樣品 16樣品 16樣品 24樣品 24樣品 32樣品 32樣品 40樣品 40
將標(biāo)準(zhǔn)品以500ng/ml為初始濃度倍比稀釋后加入空內(nèi),
標(biāo)準(zhǔn)
品1-7:
即:500ng/ml (標(biāo)準(zhǔn)品1) 、 250ng/ml (標(biāo)準(zhǔn)品2) 、 125ng/ml (標(biāo) 準(zhǔn)品3 ) 、 62.5ng/ml (標(biāo)準(zhǔn)品4 ) 、 31.25ng/ml (標(biāo)準(zhǔn)品5 ) 、 15.6ng/ml
(標(biāo)準(zhǔn)品6) 、 7.8ng/ml (標(biāo)準(zhǔn)品7) 樣品1 40分別是40個(gè)測(cè)試者的待測(cè)血清樣品。
權(quán)利要求
1.一種IgA缺乏者篩查試劑盒,由試劑和盒體構(gòu)成,所述的試劑放置在盒體中,其特征在于所述的試劑由樣品稀釋液、抗體稀釋液、洗板液、封閉液、終止液、包被抗體、酶標(biāo)二抗、人IgA抗原標(biāo)準(zhǔn)品和3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺組成,所述的樣品稀釋液是氯化鈉水溶液,在所述的氯化鈉水溶液中,氯化鈉的重量百分比在0.8~1.0%之間,所述的抗體稀釋液是磷酸鹽緩沖液,所述的磷酸鹽緩沖液的濃度在0.08~0.12mol/L之間,磷酸鹽緩沖液中加入有曲拉通X-100,所述的曲拉通X-100在磷酸鹽緩沖液中的重量百分比在0.8~1.2%之間,所述的洗板液是磷酸鹽緩沖液,磷酸鹽緩沖液的濃度在0.08~0.12mol/L之間,磷酸鹽緩沖液中加入有聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯,所述的聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯在磷酸鹽緩沖液中的重量百分比在0.04~0.06%之間,所述的封閉液是磷酸鹽緩沖液,所述的磷酸鹽緩沖液的濃度在0.08~0.12mol/L之間,磷酸鹽緩沖液中加入有聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯和脫脂奶粉,所述的聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯在磷酸鹽緩沖液中的重量百分比在0.04~0.06%之間,所述的脫脂奶粉在磷酸鹽緩沖液的重量百分比在4.0~6.0%之間,所述的終止液是硫酸,所述的硫酸的濃度在1.8~2.2mol/L之間,所述的包被抗體是羊抗人IgA抗體,所述的酶標(biāo)二抗是辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗人抗體。
2. 如權(quán)利要求l所述的IgA缺乏者篩查試劑盒,其特征在于所述的抗 體稀釋液的PH值在7 7. 4之間。
3. 如權(quán)利要求l所述的IgA缺乏者篩査試劑盒,其特征在于所述的洗 板液的PH值在7 7.4之間。
全文摘要
一種IgA缺乏者篩查試劑盒,由試劑和盒體構(gòu)成,所述的試劑由由樣品稀釋液、抗體稀釋液、洗板液、封閉液、終止液、包被抗體、酶標(biāo)二抗、人IgA抗原標(biāo)準(zhǔn)品、TMB組成,本發(fā)明的IgA的檢測(cè)試劑盒可以應(yīng)用于臨床醫(yī)療單位及血站的常規(guī)血液檢測(cè),為IgA缺乏癥患者減少輸血風(fēng)險(xiǎn),提高了輸血的安全性。
文檔編號(hào)G01N33/543GK101661035SQ20081004209
公開日2010年3月3日 申請(qǐng)日期2008年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月26日
發(fā)明者馮明亮, 劉達(dá)莊, 彪 印, 彤 沈 申請(qǐng)人:上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司;上海市血液中心