br>[0070] 為了測量藥物候選物的細胞毒性，將運些候選物W不同濃度處理正常對照 和CMT來源的神經(jīng)元，然后確定不損害細胞存活的濃度。實施MTT(3-(4, 5-二甲基嚷 挫-2-基）-2, 5-二苯基四氮挫漠鹽）測試來評價細胞存活率。
[0071] 在用CMT藥物候選物處理上述所制備的細胞后，對CMT指標進行測量，W調(diào)查運些 藥物候選物是否具有作為藥物的可用性。所述CMT指標優(yōu)選為軸突運輸指標，特別是選自 于由W下指標所組成的組中的一種或多種指標：乙酷α-微管蛋白、移動線粒體和動作電 位振幅（電生理學指標），更優(yōu)選乙酷α-微管蛋白或/和移動線粒體之一或運兩者，但不 總限于此。
[0072] 本發(fā)明人確認了，在用CMT藥物候選物處理的細胞中，乙酷α-微管蛋白的濃度增 加，運表明所選擇的候選物在治療CMT中有效。此時，當相比未經(jīng)候選物處理的細胞而言， 乙酷α-微管蛋白水平的增加高于至少20%、優(yōu)選高于至少30%、更優(yōu)選高于至少35%時， 認為該候選物在治療CMT中有效。
[0073] 當用CMT藥物候選物處理的細胞中的移動線粒體和動作電位振幅恢復到正常對 照神經(jīng)元的水平時，認為該候選物在治療CMT中有效。
[0074] 此時，可通過本領域技術人員公知的各種方法實施對蛋白表達的定量。例如，可 使用ELISA、蛋白質(zhì)印跡或免疫細胞化學（ICC)。可通過RT-PCR(Sambrook等，Molecular Cloning.ALaboratoryManual，第 3 版，ColdSpringHarborPress(2001))、Northern目P 跡（PeterB.Kaufman等，MolecularandCellularMethodsinBiologyandMedicine， 102-108,CRC出版）和使用cDNA微陣列的雜交（Sambrook等，MolecularCloning.A L油oratoryManual,第 3 版，ColdSpring化rborPress(2001))實施對基因表達的測量。 [00巧]在步驟 1)中，Charcot-Marie-Tooth病可為I型CMT、II型CMT、IV型CMT或CMTX， 優(yōu)選為CMT2F。CMT2F的特征為如下突變：其中，熱休克蛋白化S巧27第404位和第545 位的胞喀晚被置換為胸腺喀晚。本文中的突變蛋白的特征為：野生型HSP27第135位的氨 基酸"絲氨酸"被置換為苯丙氨酸，或者第182位的氨基酸"脯氨酸"被置換為亮氨酸。
[0076] 在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明人使用由CMT患者來源的iPSC分化而來 的神經(jīng)元作為CMT藥物功效評價模型，來確認軸突運輸系統(tǒng)缺陷（運是CMT2F的主要癥 狀）中所設及的微管蛋白軌道（micro化bulintrack)的功能。為做到運一點，本發(fā)明人通 過測量α-微管蛋白乙酷化的水平和移動線粒體，來調(diào)查CMT2F-MN的運動神經(jīng)元中的軸 突運輸效率。結(jié)果，CMT2F-MN中α-微管蛋白乙酷化的水平相比正常對照WA09_MN中的水 平而言有所下降（參見圖11)。CMT2F-MN中的移動線粒體相比正常對照中的移動線粒體 而言也有所減少（參見圖12)。然而，當用組蛋白脫乙酷酶6化DAC6)抑制劑"tubastatin A"處理CMT2F-MN后，α-微管蛋白乙酷化和移動線粒體的水平顯著增加，二者均恢復至正 常對照的正常水平（參見圖1化、圖11c、圖1化和圖12c)。
[0077] 本發(fā)明的CMT患者來源的iPSC含有與作為CMT病因的突變相同的突變，同時能夠 經(jīng)由神經(jīng)球分化成自體運動神經(jīng)元，并且也有利于在不直接將CMT藥物候選物給予患者的 情況下對藥物處理后顯示出的CMT指標的減少或增加進行確認，因此，它們使得展現(xiàn)出優(yōu) 異效果的患者特異性藥物選擇成為可能，同時有利于選擇具有最少細胞毒性的藥物。
[007引如下列實施例中所示的，本發(fā)明的實用和目前優(yōu)選的實施方式是說明性的。
[0079] 然而，可W理解的是，在考慮本公開的基礎上，本領域技術人員可在本發(fā)明的精神 和范圍內(nèi)進行修改和改進。
[0080] 實施例
[0081] 實施例1 :通過皮膚活檢分離CMT患者來源的細胞
[0082] 皮膚活檢是用于皮膚損傷（skinlesion)病理診斷的安全的、低侵入的且經(jīng)濟 的方法。在倫理審查委員會（inst;Uutionalreviewboard)的批準下，本發(fā)明人訪問了 在服P27基因中展現(xiàn)出S135F或P18化突變的CMT2F患者W及正常志愿者（EwhaWomans 化iversityMokdong化spital，韓國）。為了實施皮膚活檢，對正常志愿者和CMT患者給予 局部麻醉，并通過使用具有直徑為4mm的圓刀（roundblade)的鉆孔器（punch)來實施皮 膚活檢。將通過皮膚活檢獲得的皮膚組織加載于補充有W下物質(zhì)的DMEM中：10mg/mlIV型 膠原酶（Invitrogen，USA)、50U/ml分散酶（Roche)和0. 05%膜蛋白酶/邸TA，接著在37°C 下反應40分鐘。通過尼龍細胞過濾器（可通過大小高達70μm的顆粒）將得到的細胞懸 浮液進行過濾。將所得到的成纖維細胞培養(yǎng)在補充有20%FBS和100μg/ml青霉素/鏈霉 素的DMEM中。如表1中所示，對每個樣品進行分類。
[008引【表1】
[0084] 正常對照組和CMT2F患者組樣品
[0085]
[0086] 結(jié)果，如圖1中所示，確認了分離自正常組和CMT患者的成纖維細胞在形態(tài)上是相 同的（圖1)。
[0087] 實施例2 :制備CMT患者來源的誘導多能干細胞（iPSC)和胚狀體
[0088] <2-1〉誘導源自CMT患者的iPSC發(fā)育
[0089] 為了從通過實施例1中的皮膚活檢由CMT患者獲得的成纖維細胞制備出iPSCW 用于神經(jīng)元的分化，用含有4種轉(zhuǎn)錄因子化lf4、0ct3/4、Sox2和c-Myc)的仙臺病毒系統(tǒng) (CellBiol油s，USA)轉(zhuǎn)染正常對照組的成纖維細胞和CMT患者的成纖維細胞。所使用的仙 臺病毒并未插入宿主基因組，相反它在幾個繼代培養(yǎng)后消失，運表明可得到更穩(wěn)定的iPSC。 仙臺病毒的劑量被確定為M0I(感染復數(shù)）3。用仙臺病毒過夜感染細胞，然后將培養(yǎng)基替換 為補充有10%FBS的DMEM，隨后進一步培養(yǎng)6天W使細胞穩(wěn)定。然后，將細胞轉(zhuǎn)移到S化 飼養(yǎng)細胞（用絲裂霉素C(Invitrogen)處理的小鼠胚胎成纖維細胞（ME巧）（CellBiol油S， USA),并與補充有4ng/mlbFGF的ESC/iPSC培養(yǎng)基（Knockout?,USA)混合。在培養(yǎng)過程中 每天都用新鮮的培養(yǎng)基對培養(yǎng)基進行替換。仙臺病毒感染后30天，選擇并分離iPSC樣細 胞集落。對分離出的iPSC進行核巧酸序列分析，W確認導致CMT的基因突變是否被保留。
[0090] 結(jié)果，如表1、圖3和圖4中所示，CMT患者來源的iPSC(CMT2F-iPSC)展現(xiàn)出服P27 基因中的404OT或5450T突變，由此合成的服P27蛋白展現(xiàn)出突變體形式的形成（該突 變體中存在S135F或P18化突變）（表1和圖3)。另外，確認了由分離自正常組和CMT患者 的成纖維細胞分化而來的iPSC具有扁平卵石（flatpebble)的形態(tài)學或與普通的人多能 干細胞的形態(tài)學相同的形態(tài)學（圖4)。
[00川 <2-2〉CMT2F-iPSC內(nèi)源多能性基因的表達
[0092] 為了調(diào)查CMT2F-iPSC是否顯示出多能性，對內(nèi)源基因KLF4、0CT4、S0X2和c-Myc 的表達進行了確認。
[0093] 具體而言，將實施例2中制備的CMT2F-iPSC或正常對照WA09_hESC培養(yǎng)經(jīng)過10 個細胞傳代，隨后懸浮于TRIzol(Gibco，USA)中。根據(jù)制造商的方案，從CMT2F-iPSC或 WA09_hESC中提取總RNA。然后，將1μg所提取的RNA和AMV逆轉(zhuǎn)錄酶（Promega，USA)與 oligo-dT及表2中列出的正向引物和反向引物混合，隨后合成各KLF4、0CT4、S0X2和c-Myc 基因的cDNA。對合成的各cDNA進行擴增，并通過電泳在mRNA水平上測量各基因的表達。
[0094]【表2】
[0095] 用于確認多能性標志物基因表達的引物序列
[0096]
[0097] 結(jié)果，如圖5中所示，確認了內(nèi)源基因KLF4、0CT4、S0X2和c-Myc的表達（圖5)。
[009引 <2-3〉CMT2F-iPSC多能性標志物蛋白的表達
[0099] 為了確認CMT來源的iPSC中的干細胞標志物，另外調(diào)查了干性標志物蛋白SSEA4 和NAN0G的表達。
[0100] 具體而言，在明膠涂覆的腔室玻片化油-TekII)中將實施例2中制備的CMT 2F-iPSC或正常對照WA09_hESC與S化細胞混合，隨后進行培養(yǎng)。一周后，將培養(yǎng)的細胞用 4%多聚甲醒固定，隨后使用10%正常山羊血清（NGS;Gibco,USA)和0. 2%TritonX-100 進行免疫染色。本文所用的一抗是抗SSEA4抗體（小鼠IgG3，l:100 ;MC-813-70，DS皿，USA) 和抗NANOG抗體（小鼠IgGl，l:500 ;NNG-811，Abcam，USA)。使用綴合切3的山羊來源的抗 小鼠IgG二抗和DAPI復染劑進行可視化。
[0101] 結(jié)果，如圖6中所示，確認了通常表達于細胞核中的NAN0G蛋白和通常表達于質(zhì)膜 中的SSEA4在CMT2F-iPSC中均顯著表達（圖6)。
[0102] <2-4〉從CMT2F-iPSC分化邸和組織
[010引為了在體外確認CMT2F-iPSC的多能性，從CMT2F-iPSC誘導邸的分化，然后還 從分化的邸誘導外胚層、中胚層和內(nèi)胚層