-3〉中所述的方式相同的方式，對細(xì)胞就α-微管蛋白和乙酷α-微管蛋白進(jìn)行免疫染 色。本文所用的一抗為抗α-微管蛋白抗體（兔IgG，1:500 ;Abcam，USA)和抗乙酷α-微 管蛋白抗體（小鼠IgG，l:200 ;Abcam，USA)。本文所用的二抗為綴合Alexa488的山羊抗 兔IgG抗體和綴合切3的山羊抗小鼠IgG抗體。
[0130] 將用5μ ΜUibastatinA處理的CMT-2F-MN或WA09_MN懸浮于含有如下物質(zhì)的 RIPA裂解緩沖液（P冊.0)中：150mM化(：1、1.0%^-40、0.5%脫氧膽酸鋼、0.1%十二烷基 硫酸鋼和50mMTriS。然后，獲得含有細(xì)胞蛋白的上清液，并在12 %SDS-PAGE凝膠上對蛋白 進(jìn)行分離。將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。使用抗乙酷α-微管蛋白抗體（小鼠IgG化，1:1000; 6-11B-1，Abeam)和抗α-微管蛋白抗體（兔，小鼠IgGl，1:1000 ;DM1A，Sigma,USA)對膜進(jìn) 行免疫印跡。通過使用UN-SCAN-IT凝膠軟件（SilkScientific,USA)對帶密度進(jìn)行分析， W測量α-微管蛋白乙酷化的水平。對于陰性對照，W與上述方式相同的方式對未經(jīng)5μΜ 化bastatinA處理的CMT-2F-MN或WA09_MN進(jìn)行免疫染色，隨后進(jìn)行免疫印跡。
[013。 結(jié)果，如圖11中所示，與正常對照WA09_MN相比，當(dāng)未用化bastatinA處理CMT2F-MN時，α-微管蛋白乙酷化的水平下降。同時，當(dāng)用5μΜUAastatinA處理CMT-2F-MN 時，α-微管蛋白乙酷化的水平增加/恢復(fù)至正常對照組的水平（圖11a、圖1化和圖11c)。
[0132] <4-2〉CMT2F-MNα-微管蛋白的移動線粒體
[0133] 如圖13中所示，為了將由CMT患者來源的iPSC分化而來的神經(jīng)元用作CMT藥物 功效測試模型，通過微流體培養(yǎng)，調(diào)查了化bastatinA(組蛋白脫乙酷酶6(HDAC6)抑制劑） 處理后的移動線粒體。并且，確認(rèn)了運動神經(jīng)元（CMT2F-MN)的軸突運輸效率（圖13)。
[0134] 具體而言，通過使用Accutase，將實施例<3-1〉中獲得的CMT-2F-MN或WA09_MN分 離成單細(xì)胞，然后將所述單細(xì)胞W1. 0X1〇5個細(xì)胞/板的密度接種于微通道板（由化.Mok， Seoul化tionalUniversity,Korea提供；ParkJW等，化tProtoc2006;1:2128-2136) 中，隨后在神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基/B27中培養(yǎng)10天。在軸突完全生長通過微米尺寸的槽并伸 展到相對隔室（^compartment)后，通過使用lipofectamine2000(Invit;rogen，USA),用 mit〇-dsRED2轉(zhuǎn)染經(jīng)處理的運動神經(jīng)元。從轉(zhuǎn)染起2天內(nèi)，用5-10μΜ化bastatinA處理 培養(yǎng)基，隨后培養(yǎng)6小時。通過使用巧光顯微鏡，W121快照（snaps)/2min的速度進(jìn)行線 粒體成像。通過使用ImageJ和Kymograph,對運動神經(jīng)元的移動速度進(jìn)行測量。
[0135] 結(jié)果，如圖12、表3和表4中所示，在mit〇-RED2轉(zhuǎn)染的CMT-2F-MN或WA09_MN中 觀測到運動神經(jīng)元的軸突線粒體。當(dāng)未用化bastatinA處理時，線粒體的移動速度在具有S135F突變的CMT2F-MN軸突中顯著下降。在具有P18化突變的CMT2F-MN中，移動線粒體 的百分比下降（圖12曰、圖1化和圖12c)。另一方面，當(dāng)用化bastatinA處理時，在分別具 有S135F突變和P18化突變的CMT2F-MN中，線粒體的移動速度和運輸頻率均顯著增加，幾 乎恢復(fù)到正常對照的水平（圖1化和圖12c)。
[013引【表3】
[0137]UibastatinA處理后線粒體的移動速度 [013 引
[013引【表4】
[0140] 化bastatinA處理后線粒體的遷移
[0141]
[0142] a遷移W移動線粒體數(shù)量占線粒體總數(shù)量的百分比（％)表示。
【主權(quán)項】
1. 一種用于從體細(xì)胞制備運動神經(jīng)元的方法，所述體細(xì)胞來源于 Charcot-Marie-Tooth?。–MT)患者，所述方法包括以下步驟： 1) 從Charcot-Marie-Tooth?。–MT)患者獲得人的體細(xì)胞； 2) 用引入有0CT4轉(zhuǎn)基因、S0X2轉(zhuǎn)基因、KLF4轉(zhuǎn)基因和c-MYC轉(zhuǎn)基因的載體轉(zhuǎn)染步驟 1)的來源于CMT患者的所述人的體細(xì)胞，隨后進(jìn)行培養(yǎng)以誘導(dǎo)出誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC); 以及 3) 通過在視黃酸和音猬因子的存在下將步驟2)中制備的所述誘導(dǎo)多能干細(xì)胞進(jìn)行培 養(yǎng)，誘導(dǎo)出運動神經(jīng)元。2. -種用于從體細(xì)胞制備運動神經(jīng)元的方法，所述體細(xì)胞來源于Charcot-Marie-Too th?。–MT)患者，所述方法包括以下步驟： 1) 從Charcot-Marie-Tooth?。–MT)患者獲得人的體細(xì)胞； 2) 用引入有0CT4轉(zhuǎn)基因、S0X2轉(zhuǎn)基因、KLF4轉(zhuǎn)基因和c-MYC轉(zhuǎn)基因的載體轉(zhuǎn)染步驟 1)的來源于CMT患者的所述人的體細(xì)胞，隨后進(jìn)行培養(yǎng)以誘導(dǎo)出誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC); 3) 通過在視黃酸和音猬因子的存在下將步驟2)中制備的所述誘導(dǎo)多能干細(xì)胞進(jìn)行培 養(yǎng)，誘導(dǎo)出運動神經(jīng)元；以及 4) 在神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的存在下，延續(xù)步驟3)中制備的所述運動神經(jīng)元的培養(yǎng)。3. 根據(jù)權(quán)利要求2中所述的制備運動神經(jīng)元的方法，其中，步驟4)的所述神經(jīng)營養(yǎng) 蛋白選自于由如下神經(jīng)營養(yǎng)蛋白所組成的組：神經(jīng)生長因子（NGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子 (BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3(NT-3)和膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（⑶NF)。4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2中所述的制備運動神經(jīng)元的方法，其中，所述 Charcot-Marie-Tooth病為I型CMT、II型CMT、IV型CMT或CMTX〇5. 根據(jù)權(quán)利要求1或2中所述的制備運動神經(jīng)元的方法，其中，步驟1)的所述人的體 細(xì)胞典型地為成纖維細(xì)胞。6. 根據(jù)權(quán)利要求1或2中所述的制備運動神經(jīng)元的方法，其中，步驟2)的所述載體為 仙臺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒。7. 根據(jù)權(quán)利要求4中所述的制備運動神經(jīng)元的方法，其中，所述CMT2F在熱休克蛋白 (HSP) 27中具有第135位氨基酸的突變或第182位氨基酸的突變。8. 根據(jù)權(quán)利要求1或2中所述的制備運動神經(jīng)元的方法，其中，步驟3)由如下子步驟 構(gòu)成： (3-1)將上述制備的所述誘導(dǎo)多能干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)以獲得胚狀體（EB)，然后使所獲得 的EB分化成神經(jīng)球；以及 (3-2)使上述制備的所述神經(jīng)球分化成運動神經(jīng)元。9. 一種用于預(yù)防和治療Charcot-Marie-Tooth病的組合物的篩選方法，所述篩選方法 包括以下步驟： 1) 在體外用CMT治療物質(zhì)候選物對通過權(quán)利要求1或2所述的方法制備的所述運動神 經(jīng)元進(jìn)行處理； 2) 測量在步驟1)中用所述治療物質(zhì)候選物處理的細(xì)胞中的CMT指標(biāo)；以及 3) 通過與對照進(jìn)行比較，選擇表現(xiàn)出增加或減少步驟2)中獲得的所述CMT指標(biāo)的候選 物。10. 根據(jù)權(quán)利要求9中所述的用于預(yù)防和治療Charcot-Marie-Tooth病的組合物的篩 選方法，其中，所述Charcot-Marie-Tooth病為I型CMT、II型CMT、IV型CMT或CMTX。11. 根據(jù)權(quán)利要求10中所述的用于預(yù)防和治療Charcot-Marie-Tooth病的組合物的篩 選方法，其中，CMT2F在熱休克蛋白（HSP) 27中具有第135位氨基酸的突變或第182位氨 基酸的突變。12. 根據(jù)權(quán)利要求9中所述的用于預(yù)防和治療Charcot-Marie-Tooth病的組合物的篩 選方法，其中，所述CMT指標(biāo)為乙酰α-微管蛋白、軸突運輸指標(biāo)或移動線粒體。13. 根據(jù)權(quán)利要求9中所述的用于預(yù)防和治療Charcot-Marie-Tooth病的組合物的篩 選方法，其中，步驟3)的特征在于選擇能夠增加CMT指標(biāo)的候選物，所述CMT指標(biāo)例如為乙 酰α-微管蛋白、軸突運輸指標(biāo)和移動線粒體。14. 根據(jù)權(quán)利要求9中所述的用于預(yù)防和治療Charcot-Marie-Tooth病的組合物的篩 選方法，其中，所述CMT指標(biāo)的測量通過選自于由如下方法所組成的組中的方法之一實施： RT-PCR、ELISA、免疫組織化學(xué)（IHC)、蛋白質(zhì)印跡、FACS和全細(xì)胞膜片鉗。15. -種CMT患者特異性治療物質(zhì)的篩選方法，所述篩選方法包括以下步驟： 1) 在體外用CMT治療藥物對通過權(quán)利要求1或2所述的方法制備的所述運動神經(jīng)元進(jìn) 行處理； 2) 測量在步驟1)中用所述CMT治療藥物處理的細(xì)胞中的CMT指標(biāo)水平；以及 3) 通過與對照的水平進(jìn)行比較，選擇增加或減少步驟2)中的所述CMT指標(biāo)水平的CMT 治療藥物。
【專利摘要】本發(fā)明涉及誘導(dǎo)多能干細(xì)胞和通過使用由所述誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化而來的運動神經(jīng)元篩選用于Charcot-Marie-Tooth病(CMT)的治療劑的方法。具體而言，本發(fā)明使得如下方面成為可能：從源自CMT患者的人成纖維細(xì)胞制備誘導(dǎo)多能干細(xì)胞；通過使用由所述誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化而來的運動神經(jīng)元，經(jīng)由篩選CMT治療劑候選物質(zhì)來確定藥物的有效性；以及，經(jīng)由用于制備所述誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法來制備自體運動神經(jīng)元，從而用于篩選患者個性化治療藥物和患者個性化治療。
【IPC分類】C12N5/079, G01N33/15, C12Q1/68, C12N5/10
【公開號】CN105264068
【申請?zhí)枴緾N201480031644
【發(fā)明人】金潤泰, 崔炳玉, 禹昭妍, 金枝妍, 鄭圣哲, 洪永彬, 樸晉模
【申請人】三星生命公益財團, 株式會社鐘根堂
【公開日】2016年1月20日
【申請日】2014年4月1日
【公告號】US20160011177