7β-羥基類固醇脫氫酶突變子及其應(yīng)用和合成方法
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明涉及來自于瘤胃菌屬（Ruminococcus)，特別是活波瘤胃菌屬 (Ruminococcusgnavus)的細(xì)菌的新的 7β-類固醇脫氫酶（7β-hydroxsteroid dehydrogenase, 7β-HSDH)的突變子、編碼這些酶的序列、產(chǎn)生此類酶的方法，及其在膽酸 化合物的酶促合成中，特別是在熊去氧膽酸（UDCA)合成中的用途；此外，本發(fā)明也包括使 用突變子合成UDCA的新方法，以及UDCA的后提取方法。
【背景技術(shù)】：
[0002] 熊去氧膽酸（I，UDCA)是名貴中藥熊膽所含的主要有效成分，它與其相應(yīng)的非對(duì) 映異構(gòu)體鵝去氧膽酸（II，CDCA)在臨床上用于治療各種膽石疾病，各種急性、慢性肝病，具 有良好的效果。從人工養(yǎng)殖的熊的熊膽中提取UDCA收率低，來源有限，而且有違于動(dòng)物保 護(hù)，因而人工合成UDCA具有重要意義。UDCA的合成方法主要有全化學(xué)法合成和化學(xué)酶法相 結(jié)合的方法，起始原料為動(dòng)物來源的膽酸（CA)或去氧膽酸（如CDCA)。
[0003]
[0004]UDCA的經(jīng)典化學(xué)合成方法如下。因?yàn)榛瘜W(xué)氧化是非選擇性的，所以必須借助酯化 來保護(hù)3α-和7α-羥基。此外，7-酮基石膽酸（7-KLCA)的還原用到金屬鈉或者Pd/C催 化氫化，選擇性低，工業(yè)化放大生產(chǎn)不容易控制且不安全。
[0005]
[0006]PCT/EP2009/002190里描述（如下）使用12α-類固醇脫氫酶（12a-HSDH)選擇 性地將膽酸（CA)氧化成12酮-去氧膽酸（12酮-CDCA)，避免了兩個(gè)保護(hù)步驟，但是仍然需 要7-KLCA的還原步驟。
[0007]膽酸一12-酮-CDCA-CDCA- 7-KLCA-UDCA
[0008]Monti,D.，等（AdvancedSynthesis&Catalysis2009, 351，1303-1311)描述了另 外一種酶促轉(zhuǎn)化方法。首先通過來自脆弱桿菌ATCC25285的7a-HSDH和12a-HSDH(Tetra hedron, 2006, 62 (18) : 4535-4539)將CA氧化成 7,12-二酮-LCA，然后通過梭菌ATCC27555 的 70-HSDH(BiochimBiophysActa，1981，665(2):262-269)的還原而形成 12-酮-UDCA， 最后通過wolff-kishner還原反應(yīng)獲得終產(chǎn)物。整個(gè)反應(yīng)需要三種酶的參與，以及相關(guān)輔 酶的再生系統(tǒng)（乳酸脫氫酶和葡萄糖脫氫酶），使得整個(gè)過程比較復(fù)雜。而且因?yàn)榇呋磻?yīng) 的平衡問題，完全轉(zhuǎn)化是不可能的。
[0009]CA- 7,12-二酮-LCA- 12-酮-UDCA-UDCA
[0010]Hirano和Masuda描述了來自產(chǎn)氣柯林斯菌ATCC25986的NADP+依賴性的 7 0_HSDH(ApplEnvironMicrobiol, 1982, 43 (5) :1057-1063),但是沒有公開序列信息。 2007年ATCC25986基因組測(cè)序完成，2011年RolfD.Schmid和德國細(xì)胞制藥公司將此 7β-HSDH基因高效表達(dá)于大腸桿菌中，鑒定了它的酶學(xué)性質(zhì)并用于還原7,12-二酮-LCA或 者 7-KLCA獲得 12-酮-UDCA或者UDCA(ApplMicrobiolBiotechnol, 2011，90:127-135)， 發(fā)現(xiàn)此酶表現(xiàn)出高的選擇性不會(huì)形成副產(chǎn)物。德國細(xì)胞制藥公司在此序列基礎(chǔ)上繼續(xù)優(yōu)化 得到了活性提高和去除底物抑制的突變子（CN201080062617,CN201180067680)，重組產(chǎn)生 的酶7β-HSDH的高轉(zhuǎn)化率和高專一性使得UDCA的酶法大規(guī)模生產(chǎn)成為可能。此外，華東 理工大學(xué)許建和從扭鏈瘤胃球菌RuminococcustorquesATCC35915克隆并高效表達(dá)了其 7β-HSDH基因，UDCA的酶法合成試驗(yàn)證明了此酶也具有與產(chǎn)氣柯林斯菌來源的7β-HSDH 相似的、對(duì)底物7KLCA的高轉(zhuǎn)化率和高特異性。盡管如此，上述由不同來源的7β-HSDH催 化的UDCA的合成反應(yīng)，使用低的底物濃度（4~40g/L)，而且在40g/L的底物濃度下轉(zhuǎn)化 率只有90%，產(chǎn)品收率僅71 % ;-般情況下，酶轉(zhuǎn)化工藝使用100g/L或者更高底物濃度， 且轉(zhuǎn)化率要接近100%，才可視為具有工業(yè)化生產(chǎn)的意義，故表明此酶促反應(yīng)離工業(yè)化大 規(guī)模生產(chǎn)還有一定的距離。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明的目的是獲得來自于瘤胃菌屬（Ruminococcus)，特別是活波瘤胃菌屬 (Ruminococcusgnavus)的新的7β-類固醇脫氫酶（7β-HSDH)的突變子、產(chǎn)生此類重組酶 的發(fā)酵方法以及其在膽酸化合物的酶促合成中，特別是在熊去氧膽酸（UDCA)合成中的用 途；本發(fā)明也包括使用上述酶及突變子合成UDCA的新方法和UDCA的后提取方法。
[0012] -種7β_類固醇脫氫酶的突變子，其特征在于所述突變子的氨基酸序列SeqID NO:4,編碼核苷酸序列為SeqIDNO:3 ;或所述突變子的氨基酸序列SeqIDNO:6,編碼核 苷酸序列為SeqIDNO:5。
[0013] 所述的的突變子的應(yīng)用，其特征在于所述的突變子用于催化底物3α-羥基 -7-氧代_5β-膽烷酸7-KLCA合成熊去氧膽酸UDCA。
[0014] 所述的的突變子的應(yīng)用，其特征在于所述的催化底物3α-羥基-7-氧代-5β-膽 烷酸7-KLCA合成熊去氧膽酸UDCA的反應(yīng)，反應(yīng)中所需要的輔酶由醇脫氫酶催化異丙醇而 合成，從而實(shí)現(xiàn)輔酶的循環(huán)再生；所述的醇脫氫酶的核苷酸序列為SeqIDN0:7、氨基酸序 列為SeqIDN0:8。
[0015] -種熊去氧膽酸的合成方法，其特征在于將采用權(quán)利要求1所述的突變子催化底 物3α-羥基-7-氧代-5β-膽烷酸7-KLCA合成熊去氧膽酸UDCA，同時(shí)采用權(quán)利要求3所 述的醇脫氫酶及異丙醇使得輔酶循環(huán)再生。
[0016] 所述的一種熊去氧膽酸的合成方法，其特征在于獲得熊去氧膽酸粗品在有機(jī)溶劑 中加堿溶解、回流、過濾除去固形物以及酸化分離的獲得精制成品
[0017] 本發(fā)明提供的用于UDCA合成的方法示意如下：
[0018] CA一 7-酮-LCA(7-KLCA) -UDCA
[0019] 以來源于膽酸的氧化產(chǎn)物（化學(xué)法或者酶法）7_KLCA為底物，通過來自于瘤 胃菌屬（Ruminococcus)，特別是活波瘤胃菌屬（Ruminococcusgnavus)的細(xì)菌的新的 7β-類固醇脫氫酶（7β-HSDH)的突變子，其將7-KLCA-步直接還原成UDCA，同時(shí)使用 Lactobacilluskefir來源的醇脫氫酶/異丙醇體系來實(shí)現(xiàn)輔酶NADP+的循環(huán)再生（如圖 1)。此來源的7β-HSDH突變子能高效地、專一地將高濃度底物7-KLCA轉(zhuǎn)化成UDCA，從而能 實(shí)現(xiàn)酶法UDCA合成的工業(yè)化生產(chǎn)。
[0020] 本發(fā)明的目的是具體通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0021] 1、來源于活波瘤胃菌屬（Ruminococcusgnavus)的新的重組 7β-HSDH(RUHSDH) 的獲得
[0022] 密碼子優(yōu)化的來源于活波瘤胃菌屬（Ruminococcusgnavus)的7β-HSDH基 因（GenebankID:WP004843516)被合成后（合成基因序列：SeqIDΝ0:1，編碼蛋白序 列：SeqIDΝ0:2)，插入到表達(dá)載體pET21a(+)的Ndel和Hindlll位點(diǎn)得到重組DNA pET21a(+)-RUHSDH。經(jīng)過測(cè)序驗(yàn)證后，此重組DNA轉(zhuǎn)入大腸桿菌宿主BL21 (DE3)。獲得的 重組大腸桿菌接種在小體積的LB培養(yǎng)基（100μg/mL氨芐）中，30~37°C過夜培養(yǎng)后，以 5-10%的接種量接入相應(yīng)體積的LB培養(yǎng)基（100μg/mL氨芐）中，繼續(xù)在30~37°C培養(yǎng) 直至0D600達(dá)到1. 0。加入終濃度為0. 1~0. 2mM的異丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷 (IPTG)，在25~30°C下誘導(dǎo)表達(dá)3~5小時(shí)后離心收集細(xì)胞。細(xì)胞懸浮于1/20發(fā)酵液體 積的100mM的磷酸緩沖液（pH8.0)并超聲破碎，離心后得到重組的野生型RUHSDH粗酶液。 酶活測(cè)定以去熊氧膽酸或者7-KLCA為底物，在一個(gè)3mL的反應(yīng)混合物中包含：2. 89mL的 0. 2mMNADP+或者NADPH(50mM磷酸鉀緩沖液，pH8