一種底物特異性提高的膽固醇氧化酶突變體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種底物特異性提高的膽固醇氧化酶突變體及其應(yīng)用，屬于酶工程技 術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 膽固醇氧化酶（Cholesteroloxidase;EC1. 1. 3. 6 ;C0D)屬于黃素氧化酶類，能特 異性氧化含C3-0H的類固醇底物，為催化膽固醇降解的第一步作用酶，氧化膽固醇C3-0H， 隨后異構(gòu)化類固醇環(huán)上A5-6雙鍵，其中以氧氣為電子受體生成膽留-4-烯-3-酮和H202。
[0003] 膽固醇氧化酶具有重要醫(yī)學(xué)檢測價值，可用于定量血樣膽固醇的含量，如動脈粥 樣硬化性疾病需評估高密度脂蛋白或低密度脂蛋白的含量，以及評估血栓形成的風(fēng)險等， 而將膽固醇氧化酶固定在膜上采用電化學(xué)生物傳感器測定膽固醇的含量是最近研究的熱 潮；膽固醇氧化酶具有廣泛的底物特異性，可以轉(zhuǎn)化大量的3β-羥留類化合物，同時伴隨 有異構(gòu)化作用，為工業(yè)類固醇藥物留體激素或留體類藥物的合成生產(chǎn)提供有用的中間體。 例如R.equiDSM89-133被用來轉(zhuǎn)化膽固醇和其他的留醇生產(chǎn)雄留-4-烯-3, 17-二酮和雄 甾-1，4-二烯-3, 17-二酮。膽固醇氧化酶在生物催化方面的應(yīng)用前景廣闊，要求膽固醇氧 化酶具有不同的底物特異性。
[0004] 膽固醇，谷留醇，孕烯酮醇，膽留烷醇是四種膽固醇氧化酶常見的底物，它們有相 同的環(huán)結(jié)構(gòu)，差異在于R側(cè)鏈不同。在生物催化生產(chǎn)類固醇藥物前體物質(zhì)需要膽固醇作用 于不同側(cè)鏈的類固醇。
[0005] 為了提高膽固醇氧化酶的應(yīng)用價值，對酶分子改造主要是改變底物特異性。 Nishiya采用隨機(jī)突變的方式找到V145E/G405S突變株能提高Km值并適于臨床檢測膽固醇 含量；也有報道對StreptomycesSA-COO源CODs進(jìn)行突變，發(fā)現(xiàn)突變酶對脫氧異雄酮的催化 效率提高了，對囊泡膽固醇的催化效率降低了，這可能是因為突變損壞酶的疏水通道，破壞 對疏水活性中心的保護(hù)。
[0006] 目前，還鮮有關(guān)于提高膽固醇氧化酶對孕烯酮醇的特異性的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種對孕烯酮醇底物特異性提高的膽固醇氧化 酶突變體。
[0008] 所述突變體的氨基酸序列是在NCBI上GenBank:ABC75776. 1的膽固醇氧化酶氨基 酸序列的基礎(chǔ)上，缺失了第125位至第128位的氨基酸。
[0009] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述突變體，是在Rhodococcussp.源（以前被分類 命名為Brevibacteriumsp.DGCDC-82)的膽固醇氧化酶基礎(chǔ)上進(jìn)行氨基酸刪除突變得到 的。
[0010] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述Rhodococcussp.源的膽固醇氧化酶（CODr)的 氨基酸序列，GenBank:ABC75776. 1〇
[0011] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述Rhodococcussp.源的CODr的核苷酸序列，如 Genebank:DQ345780. 1〇
[0012] 所述突變體對孕烯酮醇的底物特異性提高了 5倍。
[0013] 本發(fā)明還要求保護(hù)表達(dá)所述突變體的載體、工程菌，以及所述突變體在食品、環(huán) 境、制備藥物等方面的應(yīng)用。
[0014] 本發(fā)明還提供一種提高Rhodococcussp.源的膽固醇氧化酶底物特異性的方法， 所述方法是對Rhodococcussp.源的膽固醇氧化酶進(jìn)行氨基酸刪除突變。
[0015] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述方法是刪除Rhodococcussp.源的膽固醇氧化 酶的第125位至第128位的氨基酸。
[0016] 本發(fā)明的有益效果：
[0017] 原始的Rhodococcussp.源的膽固醇氧化酶對膽固醇，谷留醇，孕稀酮醇，膽甾燒 醇這4種底物的活性差不多，而本發(fā)明的突變體CODr-ΜΙ的底物特異性有顯著變化，對孕烯 酮醇的活性最高，是對膽固醇的活性的5. 3倍。通過本發(fā)明的方法，有效提高了膽固醇氧化 酶對底物孕烯酮醇的特異性。
【附圖說明】
[0018] 圖1 :底物結(jié)構(gòu)式；
[0019] 圖2 :底物特異性比較。
【具體實施方式】
[0020] 實施例1 :突變株的構(gòu)建
[0021] (1)化學(xué)合成CODr基因片段，序列如GenBank登錄號為DQ345780. 1(Rhodococcus sp.來源的膽固醇氧化酶）所示，將該基因片段連接到pET28a(+)，轉(zhuǎn)化E.coli。提取重組 E.coli，質(zhì)粒，驗證正確的質(zhì)粒，即為重組質(zhì)粒pET28a(+)_C0Dr。
[0022] (2)以pET28a(+)-CODr為模板，PriMl(cagccggtcagcaacggcatcaacaagagc，序列 如SEQIDN0.1)為引物進(jìn)行PCR，根據(jù)全質(zhì)粒擴(kuò)增突變原理，用quickcutDpnI消化PCR 產(chǎn)物，去除模板質(zhì)粒。得到相對于GenBank:ABC75776. 1的膽固醇氧化酶的第125位至128 位氨基酸發(fā)生缺失的突變質(zhì)粒pET28a(+) -CODr-ΜΙ。
[0023] (3)將pET28a(+)-C0Dr-Ml轉(zhuǎn)化得到大腸桿菌Ε·coliBL21 (DE3)中，驗證重組 轉(zhuǎn)化子，驗證正確的即為突變體菌株E.coli-CODr-Ml，突變體菌株所產(chǎn)膽固醇氧化酶即為 CODr-ΜΙ〇
[0024] 實施例2 :突變株發(fā)酵產(chǎn)酶與酶純化
[0025] (1)粗酶液的制備
[0026] 種子液的培養(yǎng)條件：采用250mL搖瓶培養(yǎng)，裝液為20%的LB培養(yǎng)基，并在培養(yǎng)基 中加入過濾除菌的l〇〇mg·mL1硫酸卡那霉素50yL，取單菌落至培養(yǎng)基中，37°C，200rpm， 過夜培養(yǎng)。
[0027] 發(fā)酵液培養(yǎng)條件：采用500mL搖瓶培養(yǎng)，裝液為20 %的發(fā)酵培養(yǎng)基，其中的 MgS04 · 7H20,葡萄糖，甘油分別配成母液，單獨(dú)滅菌，用時添加相應(yīng)的量，并加入過濾除菌 100mg·mL1的硫酸卡那霉素100μL，加入5 %的種子液，37°C，200rpm，培養(yǎng)8h，加入20 % 的乳糖誘導(dǎo)液，28°C，200rpm，誘導(dǎo)培養(yǎng)20h。
[0028] 菌體的收集及粗酶液的獲得：將發(fā)酵液8000rpm離心5min，稱得濕重，按lg濕菌 體加入20mLpH7. 5,20mmol·mL1的磷酸緩沖液的比例重懸菌體，進(jìn)行超聲破碎，使用過程 破壁4min，停lmin，并吹打菌液，防止破壁過程中因溫度過高導(dǎo)致酶的失活，破壁30min后 8000rpm離心lOmin，上清即為粗酶液。
[0029] (2)COD的純化
[0030] 以瓊脂糖為基質(zhì)，2-羥基-1，3-丙二胺連接臂，8-氯咯嗪為配體合成的介質(zhì)進(jìn)行 親和純化。
[0031] 1.樣品制備：將上樣粗酶液的的電導(dǎo)率與20mmol*L1磷酸緩沖液（pH7. 5)的電 導(dǎo)率調(diào)節(jié)到一致。
[0032] 2.裝柱：15mL塑料小柱垂直固定，柱子下端導(dǎo)管打開，裝入3mL介質(zhì)，靜置沉淀，使 柱中乙醇流出約至略高出介質(zhì)界面。
[0033] 3.平衡：用20mmol·L1磷酸緩沖液（pH7. 5)平衡10個柱體積。
[0034] 4.上樣：取20mL粗酶液加到平衡好的親和介質(zhì)中。
[0035] 5.洗滌：用20mmol*L1磷酸緩沖液（pH7. 5)洗10個柱體積，洗去未結(jié)合的蛋白， 再用含0.lmol·LWaCl的磷酸緩沖液（pH7. 5)洗去部分與介質(zhì)結(jié)合不牢固的雜蛋白。
[0036] 6.洗脫：以含0. 5mol*LWaCl的磷酸緩沖液（pH7. 5)為洗脫液，收集并測定C0D 活性用SDS-PAGE檢測蛋白的分子量大小和純度。
[0037] 實施例3 :突變前后膽固醇氧化酶的底物特異性比較
[0038] 選取膽固醇，谷甾醇，孕烯酮醇，膽甾烷醇四種底物（結(jié)構(gòu)式如圖1所示），都配成 21. 3mmol·L1的檢測液B，測定酶活，并以膽固醇為底物時的活性為100%，計算以其他類 固醇為底物時的相對活性，比較酶的底物特異性。
[0039] C0D酶活的測定：
[0040] 利用膽固醇氧化酶與辣根過氧化物酶的耦合反應(yīng)，膽固醇氧化酶氧化類固醇底物 產(chǎn)生的H202，可以在辣根過氧化酶的作用下使苯酚與4-氨基-安替比林產(chǎn)生紅色苯醌亞胺 類化合物，在A500處有最大吸收峰。具體操作：比色管中加入3mL檢測液A(4-氨基-安 替比林，lmmol/L;苯酸，6mmol/L;疊氮鈉，0. 2g/L;過氧化物酶，5, 000U/L;磷酸鉀緩沖 液，25mmol/L，pH7. 5) +50uL酶液+150uL類固醇底物（異丙醇為溶劑），三種組分振蕩混勻 后，37°C水浴15min，立即用沸水煮3min，使酶失活，放冷水中冷卻；9000rpm，離心2min;上 清A500處測吸光值，平行實驗測三次，取平均值。酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定參見文獻(xiàn)（陳亦.膽 固醇氧化酶親和純化及酶穩(wěn)定性研究〔D〕.無錫.江南大學(xué).2013)。酶活力單位定義：在 37°C下，每分鐘催化1μmol類固醇底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物所需的酶量定義為1個酶活力單位（U)。
[0041] 結(jié)果如圖2所示。結(jié)果顯示，原酶（wild-type)對4種底物的活性差不多，對孕 烯酮醇的活性稍好，C0Dr-M2(在129G和1301之間插入丙氨酸）對四種底物的特異性跟原 酶相似，CODr-Ml的底物特異性有顯著變化，對孕烯酮醇的活性最高，是對膽固醇的活性的 5. 3倍。這可能是由于突變后膽固醇氧化酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，限制了lid區(qū)與帶有較長側(cè) 鏈底物的接觸，而便于與帶有較短側(cè)鏈的留醇（比如孕烯酮醇）接觸、作用。本發(fā)明的突變 體，改變酶的底物特異性，對孕烯酮醇的活性較好。
[0042] 雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技 術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范 圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
【主權(quán)項】
1. 一種膽固醇氧化酶突變體，其特征在于，所述突變體的氨基酸序列是在NCBI上 GenBank:ABC75776. 1的膽固醇氧化酶氨基酸序列的基礎(chǔ)上，缺失了第125位至第128位的 氨基酸。2. 編碼權(quán)利要求1所述突變體的核苷酸序列。3. 表達(dá)權(quán)利要求1所述突變體的基因工程菌。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是以大腸桿菌為 宿主而得到的。5. 權(quán)利要求1所述突變體在食品、環(huán)境或制備藥物方面的應(yīng)用。6. -種提高Rhodococcussp.源的膽固醇氧化酶的底物特異性的方法，其特征在于， 所述方法是在Rhodococcussp.源的膽固醇氧化酶的基礎(chǔ)上，缺失其氨基酸序列的第125 位至第128位。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述Rhodococcussp.源的膽固醇氧化酶 是NCBI上GenBank:ABC75776. 1所示的膽固醇氧化酶。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種底物特異性提高的膽固醇氧化酶突變體及其應(yīng)用，屬于酶工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的突變體，是在Rhodococcus？sp.源(以前被分類命名為Brevibacterium？sp.DGCDC-82)的膽固醇氧化酶的基礎(chǔ)上進(jìn)行氨基酸刪除突變得到的。原始的Rhodococcus？sp.源的膽固醇氧化酶對膽固醇，谷甾醇，孕烯酮醇，膽甾烷醇這4種底物的活性差不多，而本發(fā)明的突變體CODr-M1的底物特異性有顯著變化，對孕烯酮醇的活性最高，是對膽固醇的活性的5.3倍。通過本發(fā)明的方法，有效提高了膽固醇氧化酶對底物孕烯酮醇的特異性。
【IPC分類】C12N15/53, A23L33/18, A61K38/44, C12N1/21, C12N9/04
【公開號】CN105274071
【申請?zhí)枴緾N201510788289
【發(fā)明人】張玲, 楊海麟, 辛瑜, 王武, 袁曄
【申請人】江南大學(xué)
【公開日】2016年1月27日
【申請日】2015年11月17日