無乳鏈球菌單克隆抗體及其制備方法和用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種無乳鏈球菌單克隆抗體及其制備方法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 羅非魚是原產(chǎn)于非洲的熱帶魚類，上世界七八十年代我國(guó)多次從國(guó)外引種，并選 育出長(zhǎng)勢(shì)快、產(chǎn)量高、抗病力強(qiáng)的品種，此后迅速成功推廣養(yǎng)殖。目前，我國(guó)不僅是世界上最 大的羅非魚養(yǎng)殖生產(chǎn)國(guó)，也是最大的羅非魚出口國(guó)。國(guó)內(nèi)羅非魚養(yǎng)殖集中在廣東、海南、廣 西、福建等南方地區(qū)。2009年開始在羅非魚養(yǎng)殖密集區(qū)先后暴發(fā)羅非魚"突眼癥"，該病來 勢(shì)兇猛，發(fā)病率高達(dá)35%，發(fā)病魚死亡率接近100%，且病害持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，藥物防治難以控 制病情，養(yǎng)殖戶損失慘痛。
[0003] 及時(shí)準(zhǔn)確的發(fā)現(xiàn)和診斷病原，是成功預(yù)防和治療羅非魚鏈球菌病的前提。目前，對(duì) 于無乳鏈球菌的診斷，主要采用（1)分子生物學(xué)的方法，如PCR法進(jìn)行診斷，該類方法依賴 于貴重的儀器設(shè)備和專業(yè)的技術(shù)人員，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)4-6個(gè)小時(shí)，非常不利于在基層推廣 運(yùn)用。（2)常規(guī)的分離培養(yǎng)法，依賴于專業(yè)操作人員的顯微鏡形態(tài)判斷，容易造成誤判，此類 方法的培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)18-24個(gè)小時(shí)，也不適用于無乳鏈球菌的快速檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決前述問題，本發(fā)明提供了一種新的無乳鏈球菌單克隆抗體及其制備方 法。
[0005] 本發(fā)明首先提供了一種產(chǎn)生無乳鏈球菌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，它是由中國(guó) 典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)保藏的保藏號(hào)：CCTCCNO:C2015177的細(xì)胞株。
[0006] 本發(fā)明表達(dá)單抗CE12的細(xì)胞株（分類命名為雜交瘤細(xì)胞株TWDB-WR-2)，于2015 年10月21日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)，其地址為：中國(guó).武漢.武漢大學(xué)， 其保藏號(hào)為：CCTCCNO:C2015177。
[0007] 本發(fā)明提供了前述雜交瘤細(xì)胞株的方法，它包括如下步驟：
[0008] (1)以氨基酸序列如SEQIDNO. 1所示重組蛋白為抗原，接種BALB/c小鼠，分離小 鼠脾細(xì)胞；
[0009] (2)取小鼠脾細(xì)胞，與骨髓細(xì)胞融合，篩選，即可。
[0010] 本發(fā)明提供了一種無乳鏈球菌單克隆抗體，它是由前述細(xì)胞株分泌的單克隆抗 體。
[0011] 本發(fā)明提供了前述單克隆抗體的方法，它包括如下步驟：
[0012] 1)取前述雜交瘤細(xì)胞株，注射入BALB/c小鼠腹水中增殖；
[0013] 2)收集腹水，使用ProteinGSepharose親和層析柱純化，即可。
[0014] 本發(fā)明提供了前述無乳鏈球菌單克隆抗體在檢測(cè)無乳鏈球菌中的用途。
[0015] 本發(fā)明提供了前述無乳鏈球菌單克隆抗體在制備檢測(cè)無乳鏈球菌的試劑中的用 途。
[0016] 本發(fā)明提供了前述無乳鏈球菌單克隆抗體在制備檢測(cè)無乳鏈球菌的膠體金快速 檢測(cè)試紙中的用途。
[0017] 優(yōu)選地，待檢樣本為養(yǎng)殖水體或者魚體。
[0018] 采用本發(fā)明制備得到了無乳鏈球菌Sip單抗CE12,其本身的特異性強(qiáng)，僅與無乳 鏈球菌結(jié)合，而與其他細(xì)菌無交叉反應(yīng)，滴度高，結(jié)合能力強(qiáng)，采用該蛋白制備的無乳鏈球 菌檢測(cè)試紙靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好，能準(zhǔn)確檢測(cè)實(shí)際樣品，可以有效解決現(xiàn)有無乳 鏈球菌檢測(cè)存在復(fù)雜、不準(zhǔn)確的問題，應(yīng)用前景良好。
[0019] 在本抗體制備的試紙成功研制之前，國(guó)際上尚無針對(duì)無乳鏈球菌的快速檢測(cè)試紙 的報(bào)道。從已有文獻(xiàn)來看，研制該試紙所需要的生物材料非常難以制備和獲取。因此，成功 研制由本抗體制備的試紙?jiān)谑澜缟仙袑偈状?，處于世界領(lǐng)先水平。
[0020] 顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離 本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0021] 以下通過實(shí)施例形式的【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說 明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容 所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
【附圖說明】
[0022] 圖1本發(fā)明單抗的純化結(jié)果；
[0023] 圖2水產(chǎn)常見細(xì)菌免疫印跡結(jié)果。1-A第一抗體：NC7b;1_B第一抗體：CE12 ;
[0024] 圖3試紙的結(jié)構(gòu)，1 :PVC底板；2 :硝酸纖維素膜；3 :膠體金墊；4 :吸水墊；5 :檢測(cè) 線；6 :質(zhì)控線；7 :樣品塾；
[0025] 圖 4 靈敏度檢測(cè)結(jié)果。1 :6X101QCFU/ml;2 :6X109CFU/ml;3 :6X10sCFU/ml;4 : 6X107CFU/ml;5 :6X106CFU/ml;CLine:質(zhì)控線；TLine:檢測(cè)線；
[0026] 圖5試紙條的特異性測(cè)試；
[0027] 圖6發(fā)病魚組織及水體的檢測(cè)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照試劑盒 說明書選擇。
[0029] 實(shí)驗(yàn)材料：
[0030]細(xì)菌：無乳鏈球菌TW3用于克隆和制備重組抗原，無乳鏈球菌（ATCC51487)、無乳 鏈球菌C918 (牛源）、無乳鏈球菌TW7 (魚源）、無乳鏈球菌TW10 (魚源）、鮰愛德華氏菌、糞腸 球菌、海豚鏈球菌、豚鼠氣單胞菌、鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、霍亂弧菌、副溶血弧 菌、嗜水氣單胞菌、枯草芽孢桿菌、溶藻弧菌、陰溝腸桿菌、腐敗希瓦氏菌、肺炎克雷伯氏菌、 幽門螺桿菌、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌、奇異變形桿菌、熱帶念珠菌、傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏 菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、大腸埃希氏菌、白色念珠菌、弗氏檸檬酸桿菌、綠膿桿菌、溶血葡萄球菌、 鮑曼不動(dòng)桿菌和淋病柰瑟氏菌由通威股份動(dòng)物保健研究所保存。
[0031]
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[0033]
[0034]
[0035]
[0036]
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[0040]
[0041]
[0042] 實(shí)施例1本發(fā)明無乳鏈球菌Sip單抗NC7b的制備
[0043] 1、雜交瘤制備
[0044] 1. 1重組抗原的制備
[0045] 1)基因克隆。用Promega公司的DNA提取試劑盒提取無乳鏈球菌TW3的基因組 DNA，根據(jù)無乳鏈球菌sip基因（羅非魚源，HQ878436. 1，Genbank)，設(shè)計(jì)如表1所示的引物， 上下游引物分別包含BamHI和SalI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。采用設(shè)計(jì)的引物對(duì)擴(kuò)增sip基 因，擴(kuò)增條件如下：DNA94°C預(yù)變性5min后，設(shè)置程序94°C、30s，55°C、35s和72°C、78s，共 30個(gè)循環(huán)；然后72°C延伸lOmin。
[0046] 2)轉(zhuǎn)化、表達(dá)與純化。將擴(kuò)增后的sipDNA連接到pET32a載體上，該載體含有編 碼六聚組氨酸的序列。用pET32a-sip轉(zhuǎn)化大腸埃希氏菌BL21。轉(zhuǎn)化子在含有100yg/mL 卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)。加入0. 8mM異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG) 并于37°C再培養(yǎng)5h，以表達(dá)帶六聚組氨酸標(biāo)簽的重組Sip(rSip)。超聲震蕩提取含有rSip 的可溶部分，然后使用IMAC親和層析柱進(jìn)行純化和洗脫，并使用二喹啉甲酸檢測(cè)試劑盒 (Sigma-Aldrich)測(cè)定蛋白濃度。
[0047] 表1用于表達(dá)sip基因的引物增子（~1302bp)
[0048]
[0049] 3)電泳和免疫印跡。對(duì)純化的rSip進(jìn)行SDS-PAGE電泳（凝膠濃度12% )，考馬 斯亮藍(lán)染色或免疫印跡來顯示蛋白質(zhì)條，同時(shí)使用針對(duì)無乳鏈球菌的多抗，以檢測(cè)rSip的 活性。
[0050] 用蛋白rSip作為生產(chǎn)單抗的免疫原和ELISA檢測(cè)中的抗原，rSip的氨基酸序列 (SEQIDNO. 1)如下：

[0052] 1· 2免疫程序
[0053] 用經(jīng)弗式完全佐劑（Sigma-Aldrich)乳化（乳化方法：將抗原和弗氏完全佐劑等 體積混合，吸入一支注射器內(nèi)，取下注射器針頭，用軟管連接另一支注射器，扎帶固定好軟 管，輪流推動(dòng)兩支注射器，使混合液通過軟管在注射器之間來回流動(dòng)，從而達(dá)到乳化目的） 的25μg，50μg，100μg和150μgrSip蛋白分別腹腔注射雌性BALB/c小鼠（8周齡）。4 和8周后，用經(jīng)弗式不完全佐劑（Sigma-Aldrich)乳化的相同抗原再次注射（乳化及注射 劑量同前）小鼠。第10周，最后單獨(dú)腹腔注射rSip蛋白（注射劑量同前）一次。
[0054] 1. 3雜交瘤產(chǎn)生和針對(duì)Sip蛋白的單抗生產(chǎn)
[0055] 最后一次加強(qiáng)注射后三天，獲取免疫小鼠脾細(xì)胞（分離方法：取高免BALB/c小鼠， 拉頸處死后，于75%酒精中浸泡3~5min，無菌操作打開腹腔，并小心取出脾臟至于平皿 中，加入少量DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基漂洗2~3次，并仔細(xì)去除脾臟周圍的結(jié)締組織。然后在另 一培養(yǎng)皿中倒入無血清將銅網(wǎng)蓋于其上，取脾臟于銅網(wǎng)上，用研磨棒輕輕研磨，待細(xì)胞釋放 完全后，收集脾細(xì)胞，lOOOrpm離心lOmin)。根據(jù)Situ和Wu描述的方法：用50% (w/v)聚 乙二醇4000 (Sigma-Aldrich)，將脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞S/P20以5:1的比例進(jìn)行融合（細(xì)胞 融合的步驟：S/P20細(xì)胞由成都中醫(yī)藥大學(xué)饒朝龍教授惠贈(zèng)。融合步驟：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的S/ P20細(xì)胞與脾細(xì)胞按比例充分混勻，lOOOrpm離心lOmin，棄上清液，用手掌輕擊離心瓶底， 打散沉淀的細(xì)胞。將離心瓶置于40°C水浴中，在lmin內(nèi)邊旋轉(zhuǎn)邊加入lmlPEG4000,再加 入15ml無血清RPMI-1640培養(yǎng)基終止融合，在90s內(nèi)加完，由慢到快，前5s加lml。室溫靜 置10min，1000rpm離心10min，棄上清，將含HAT和15%胎牛血清的1^]\〇-1640培養(yǎng)基加到 細(xì)胞融合物中，懸浮細(xì)胞，分配到已有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置于37 °C、5 %C02的溫 箱中培養(yǎng)），得到雜交瘤細(xì)胞。
[0056] 篩選步驟1 :
[0057] 將得到的雜交瘤細(xì)胞在次黃嘌呤-氨蝶呤-胸苷培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以5μg/ml的 rSip作為包被抗原，用ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清中的抗體，以篩選雜交瘤細(xì)胞，得到ELISA鑒定 為陽(yáng)性的雜交瘤細(xì)胞。
[0058] 篩選步驟2 :
[0059] 將ELISA鑒定為陽(yáng)性的雜交瘤細(xì)胞于BALB/c小鼠腹水中增殖。收集腹水，使用 ProteinGSepharose親和層析柱（GEHealthcareLifeSciences)純化（純化方法：用 注射器穿刺吸取小鼠腹水，在4°C，12000g條件下離心15min除去較大的凝塊。將處理好的 腹水用〇. 02MpH7. 0的PBS緩沖液稀釋10倍，0. 45μm濾膜過濾，然后上樣流經(jīng)0. 02MpH 7. 0的PBS緩沖液平衡好的蛋白G親和層析柱。用0. 1MpH2. 7的Gly-HCl為洗脫液進(jìn)行 洗脫，收集洗脫峰，并用1. 〇MpH9. 0的Tris-HCl調(diào)pH至約7. 0,最后透析脫鹽并冷凍干 燥）腹水中的rSip單抗。
[0060] 將純化的單抗（濃度2mg/ml)與膠體金液體結(jié)合，室溫（RT)放置5min。加入5% PEG后，立即8000rpm離心30min。于12ml離心管中收集紅色沉淀，用膠體金保