一種制備人源化抗體的核酸分子及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，主要涉及一種核酸分子及其在人源化抗體制備中的應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 抗體是一類重要的生物醫(yī)藥制品，在人類疾病的預(yù)防和治療過程中發(fā)揮了重要的 作用。治療性抗體的發(fā)展經(jīng)歷了鼠源抗體、嵌合抗體、改型抗體、表面重塑抗體和全人源化 抗體等不同的發(fā)展階段。全人源化抗體（FullHumanizedAntibody)，是指經(jīng)過基因改造或 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物免疫而獲得的與人源抗體蛋白質(zhì)序列完全一致的抗體。全人源化抗體由于不含 動(dòng)物蛋白，因此副作用較低，作用效果更好，已成為當(dāng)前和未來抗體工程的主要研究和發(fā)展 方向。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物全人源化抗體（TransgenicHumanizedAntibody)是指將人類免疫球蛋 白基因全部或部分通過轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)人工染色體技術(shù)，轉(zhuǎn)移至動(dòng)物基因組中[動(dòng)物內(nèi)源的抗 體基因缺失（或失活）]，使動(dòng)物表達(dá)人類抗體，從而獲得全人源化抗體。
[0003] 通過體外對(duì)人的免疫球蛋白基因進(jìn)行改造，轉(zhuǎn)入動(dòng)物體內(nèi)，再用抗原免疫改造后 的動(dòng)物獲得高親和力的抗體是目前人源化抗體研發(fā)的一項(xiàng)重要技術(shù)，截止目前，美國(guó)FDA 已批準(zhǔn)7個(gè)利用該方法制備的人源化抗體。當(dāng)前主流的方法是將人類的免疫球蛋白重鏈 和輕鏈基因替代動(dòng)物自身的免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因，使其在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行重排生成人 類的抗體蛋白。但隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)入的人類免疫球蛋白基因片段雖然能在動(dòng)物體 內(nèi)重排和表達(dá)，但其產(chǎn)生人抗體蛋白的性能要低于未經(jīng)基因改造前的動(dòng)物自身抗體生產(chǎn)效 果。以小鼠為例，其原因主要是當(dāng)抗體在B細(xì)胞發(fā)育的初級(jí)階段作為B細(xì)胞表面受體（BCR) 時(shí)，其與鼠源的信號(hào)蛋白Iga和Igi3的相互作用并不是最優(yōu)的（即鼠源BCR與鼠源的Iga 和IgP或人BCR與人的Iga和IgP相互作用效果是最好的），因此影響了抗體的類型轉(zhuǎn) 換、親和力成熟和B細(xì)胞發(fā)育為成熟的生產(chǎn)抗體的漿細(xì)胞。為克服這一難題，Lee等（Nature biotechnology，2014 ;32 (4) :356-363)將三個(gè)人免疫球蛋白基因（IgH，IgK和IgA)的可 變區(qū)替代小鼠的免疫球蛋白可變區(qū)，而恒定區(qū)使用小鼠免疫球蛋白的相應(yīng)片段，利用這種 策略可克服上述提到的問題，獲得可變區(qū)為人源，恒定區(qū)為鼠源的嵌合抗體，再通過下游的 改造將鼠源的恒定區(qū)改造為人源的恒定區(qū)，得到全人源化抗體。這種方法存在的缺點(diǎn)是需 要進(jìn)行二次改造才能獲得全人源化抗體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種可在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行重排表達(dá)人源化抗體的核酸分子， 該核酸分子克服了人類免疫球蛋白基因在不同物種中由于BCR與Iga和Igi3相互作用不 兼容性的問題，同時(shí)相對(duì)【背景技術(shù)】中提到的Lee采用的方法，其表達(dá)的人源化抗體無需進(jìn) 行二次改造。
[0005] 本發(fā)明提供了一種核酸分子，包括了人免疫球蛋白基因或其片段，以及人CD79基 因序列。
[0006] 上述⑶79基因序列包括⑶19α蛋白肽和⑶79β蛋白肽的編碼序列。⑶19α蛋 白肽和CD79β蛋白肽的氨基酸序列分別如SEDIDΝ0. 3和SEDIDΝ0. 2所示。
[0007] 上述人CD79基因序列如SEDIDNO. 1所示。
[0008] 上述轉(zhuǎn)入的人⑶79序列可位于人免疫球蛋白基因載體上或轉(zhuǎn)入小鼠或豬的基因 組中。優(yōu)選的，上述人⑶79序列位于人Ig核酸分子兩端中的任意一端。所述人⑶79序列 位于人免疫球蛋白V區(qū)的前端或C區(qū)后端。
[0009] 上述核酸分子中⑶79基因序列的結(jié)構(gòu)如圖1-1所示。⑶79在上述核酸分子中位 置如圖1-2所示。所述核酸分子的結(jié)構(gòu)如圖1-3所示。
[0010] 優(yōu)選地，上述人免疫球蛋白抗體基因或其片段為人免疫球蛋白抗體重鏈基因。本 發(fā)明不需對(duì)人免疫球蛋白基因進(jìn)行內(nèi)部改造。
[0011] 上述人免疫球蛋白基因包括了人免疫球蛋白重鏈基因的V區(qū)基因、D區(qū)基因、J區(qū) 基因。上述人免疫球蛋白重鏈基因還可以包括1^以、1^丫、1^€[、1^5和/或1^|重鏈基 因和/或人的3' -調(diào)控區(qū)（hLCR)等。
[0012] 例如，上述核酸分子的基因簇如圖2所示（黑框位置為導(dǎo)入的人⑶79序列）。
[0013] 通過以上的改造，上述核酸分子能夠形成B細(xì)胞發(fā)育的信號(hào)傳遞體，并有利于IgM 細(xì)胞直接轉(zhuǎn)化為IgG細(xì)胞，以及親和力成熟。
[0014] -種表達(dá)載體，包含上述核酸分子。一種細(xì)胞，包含上述核酸分子或上述載體。一 種動(dòng)物，如鼠、豬等，包含上述核酸分子。一種人源化抗體，由上述核酸分子重排、編碼制得。 上述核酸分子或載體或細(xì)胞在制備人源化抗體中的應(yīng)用。上述核酸分子或載體或細(xì)胞在制 備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的應(yīng)用。
[0015] 將經(jīng)過上述改造的人免疫球蛋白基因轉(zhuǎn)入動(dòng)物體內(nèi)獲得轉(zhuǎn)人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因 動(dòng)物，或進(jìn)一步與自身免疫球蛋白基因不表達(dá)的動(dòng)物進(jìn)行雜交獲得只表達(dá)人抗體蛋白的基 因工程動(dòng)物。利用抗原免疫轉(zhuǎn)入人免疫球蛋白基因（重鏈、輕鏈）的動(dòng)物，獲得全人源化抗 體。例如：
[0016] 采用上述核酸分子或載體或細(xì)胞制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法，包括以下步驟：
[0017] (1)所述核酸分子的獲得；
[0018] (2)將所述核酸分子構(gòu)建入載體；
[0019] (3)向宿主細(xì)胞（包括干細(xì)胞，誘導(dǎo)干細(xì)胞和體細(xì)胞）或胚胎導(dǎo)入含有所述核酸分 子的載體；
[0020] (4)將含有人Ig的細(xì)胞植入宿主動(dòng)物的胚胎內(nèi)（嵌合體制備）或體細(xì)胞克隆；
[0021] (5)繁育雜合、純合的轉(zhuǎn)人Ig基因的動(dòng)物（包括與宿主內(nèi)源免疫球蛋白基因失活 的動(dòng)物雜交）。
[0022] 上述宿主動(dòng)物為哺乳動(dòng)物，如鼠、兔、豬、牛、羊、雞、馬等。上述載體為人工染色體 (如酵母，細(xì)菌）、噬菌體、質(zhì)粒等。上述載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方法，包括電穿孔、病毒感染、 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和顯微注射等。
[0023] 有益效果
[0024] L本發(fā)明生產(chǎn)的全人源化抗體具有高親和力。
[0025] 2.本發(fā)明可利用一種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物品系產(chǎn)生不同類型的各種抗體，且本發(fā)明適用于 多種動(dòng)物。
[0026] 3.本發(fā)明的宿主自身免疫球蛋白不表達(dá)或在檢測(cè)限度以下。
[0027] 4.本發(fā)明基因重排效率高，VDJC重排、突變和利用率與人體一致。
[0028] 5.本發(fā)明直接生產(chǎn)全人源化抗體，不需進(jìn)行二次改造，體內(nèi)表達(dá)量可達(dá)到健康成 人水平。
[0029] 6.本發(fā)明不需對(duì)人免疫球蛋白基因進(jìn)行內(nèi)部改造。
【附圖說明】
[0030] 圖1-1轉(zhuǎn)人⑶79基因結(jié)構(gòu)圖
[0031] 圖1-2轉(zhuǎn)人⑶79基因結(jié)構(gòu)和篩選基因
[0032] 圖1-3轉(zhuǎn)人⑶79基因和hlg位置結(jié)果圖。
[0033] 圖2實(shí)施例1的改造后人免疫球蛋白重鏈基因簇結(jié)構(gòu)圖
[0034] 圖3實(shí)施例1人免疫球蛋白Kappa輕鏈基因簇結(jié)構(gòu)圖
[0035] 圖4實(shí)施例1人免疫球蛋白lambda輕鏈基因簇結(jié)構(gòu)圖
[0036] 圖5實(shí)施例1小鼠免疫球蛋白重鏈基因簇
[0037] 圖6實(shí)施例1敲除小鼠免疫球蛋白重鏈基因的基因打靶
[0038] 圖7實(shí)施例1小鼠免疫球蛋白輕鏈基因簇
[0039] 圖8實(shí)施例1敲除小鼠免疫球蛋白輕鏈基因的基因打靶
【具體實(shí)施方式】
[0040] 下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述，在此指出以下實(shí)施例只用于對(duì)本發(fā) 明進(jìn)行進(jìn)一步說明，不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，本領(lǐng)域的技術(shù)熟練人員可以根 據(jù)上述
【發(fā)明內(nèi)容】
對(duì)本發(fā)明作出一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整。
[0041] 實(shí)施例1
[0042] 將改造的人免疫球蛋白基因轉(zhuǎn)入小鼠體內(nèi)，再免疫含有人免疫球蛋白基因的小鼠 獲得全人源化抗體，具體步驟如下：
[0043] 1.人免疫球蛋白基因的優(yōu)化改造
[0044] 1)人免疫球蛋白重鏈基因的改造
[0045] 將人⑶79基因通過同源重組轉(zhuǎn)入含人Ig的YAC或BAC載體上，構(gòu)建人免疫球蛋 白重鏈基因的基因簇如圖2所示（黑框位置為導(dǎo)入的人CD79基因序列）。包括了依次為人 免疫球蛋白重鏈基因的V區(qū)、D區(qū)、J區(qū)，hlgHCy、hIgHCS、hIgHCy3、hIgHCyUhlgHCa1、 hLCR、h⑶79。h⑶79的內(nèi)部結(jié)構(gòu)如圖1-1所示，其基因序列如SEDIDNO. 1所示；包括了 CD79a蛋白肽和CD79 0蛋白肽的編碼序列；CD79a蛋白肽和CD79 0蛋白肽的氨基酸序列 分別如SEDIDN0. 3 和SEDIDN0. 2 所示。
[0046] 2)人免疫球蛋白Kappa輕鏈基因的改造
[0047] 人免疫球蛋白kappa輕鏈基因包括了人免疫球蛋白kappa輕鏈基因全部或部分V 區(qū)、J區(qū)、C區(qū)，以及KDE區(qū)?；虼厝鐖D3所示。
[0048] 3)人免疫球蛋白lambda輕鏈基因的改造
[0049] 人免疫球蛋白lambda輕鏈基因包括了人免疫球蛋白lambda輕鏈基因全部或部分 V區(qū)、J區(qū)和C區(qū)，同時(shí)在末端加入了增強(qiáng)子結(jié)構(gòu)?；虼厝鐖D4所示。
[0050] 2.人源化抗體轉(zhuǎn)基因小鼠的培育
[0051] 1)轉(zhuǎn)人免疫球蛋白重鏈基因小鼠的培育
[0052] 利用已有的常規(guī)轉(zhuǎn)基因技術(shù)將步驟1的1)中構(gòu)建的人免疫球蛋白重鏈基因轉(zhuǎn)入 小鼠體內(nèi)。通過PCR檢測(cè)和ELISA檢測(cè)雙標(biāo)準(zhǔn)篩選獲得的轉(zhuǎn)人免疫球蛋白重鏈轉(zhuǎn)基因小鼠。
[0053] 使用的PCR鑒定引物為：
[0054] PCR1
[0055] For：TGCTTGGAACTGGATCAGGCAGTC
[0056] Rev：TTGCTTAACTCCACACCTGCTCCTG
[0057] PCRproductsize：329bp
[0058] PCR2
[0059] For：TTGAGGAGACTGTCCATCCTTCAC
[0060] Rev：GAGAGGGCATCTTGGTCTTCTTTC
[0061] PCRproductsize：471bp
[0062]使用的ELISA鑒定的抗體為：sigma(I1886)和sigma(A8792)，以健康成年人和健 康小鼠血清作為對(duì)照。
[0063] 2)轉(zhuǎn)人免疫球蛋白kappa輕鏈基因小鼠的培育
[0064] 利用已有的常規(guī)轉(zhuǎn)基因技術(shù)將步驟1的2)中構(gòu)建的人免疫球蛋白kappa輕鏈基 因轉(zhuǎn)入小鼠體內(nèi)。通過PCR檢測(cè)和ELISA檢測(cè)雙標(biāo)準(zhǔn)篩選獲得的轉(zhuǎn)人免疫球蛋白kappa輕 鏈轉(zhuǎn)基因小鼠。
[0065] 使用的PCR鑒定引物為：
[0066] PCR1 ：
[0067] FOR：TGCTCTGACCTCTGAGGACCTGTCTGTA
[0068] Rev：TTCAGGCAGGCTCTTACCAGGACTCA
[0069] PCRproductsize：616bp
[0070] PCR2 :
[0071] For：CACCCAAGGGCAGAACTTTGTTACT
[0072] Rev：GAGGAAAGAGAGAAACCACAGGTGC
[0073] PCRproductsize：596bp
[0074] 使用的ELISA