一種腫瘤靶向的新型多肽的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種具有腫瘤祀向的新型多膚，具體設(shè)及含丙氨酸-丙氨酸-天冬酷 胺（AAN)序列連接于含RGD膚，從而得到一種不僅祀向腫瘤細(xì)胞和血管，而且祀向腫瘤相關(guān) 巨隧細(xì)胞，從而調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境增強(qiáng)抗腫瘤的效果的串聯(lián)型多膚（nRGD)，屬于醫(yī)藥領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 腫瘤部位存在特殊的腫瘤的微環(huán)境，為腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移提供了所必需的條件， 如保持促生長信號(hào)，保持新生血管生成，對(duì)細(xì)胞調(diào)亡和生長抑制信號(hào)的抵抗，腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn) 移能力和無限增值，基因組的不穩(wěn)定和易突變性，能量代謝重整，促腫瘤生長的炎癥及逃避 免疫系統(tǒng)的識(shí)別和殺傷等。（Han址anD,WeinbergRA.Hallmarksofcancer:thenext generation.Cell2011,144,647-674.)
[0003] 隨著生物醫(yī)學(xué)技術(shù)的高速發(fā)展，腫瘤的祀向治療已成為當(dāng)前腫瘤治療的主要發(fā)展 方向。遞藥載體技術(shù)的發(fā)展為抗腫瘤藥物的特異性、祀向性傳遞提供了可能。利用特異性 的腫瘤祀向配體修飾抗腫瘤藥物或遞藥載體，有效提高藥物或遞藥載體在腫瘤部位的分布 和蓄積，降低藥物在非祀器官和組織的分布，從而實(shí)現(xiàn)提高療效、降低毒副作用的目的。
[0004] 整合素（Integrin)是一類存在于細(xì)胞膜上的細(xì)胞黏附受體，屬于腫瘤穿透膚，其 主要功能是介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間的黏附作用。整合素由a和0亞基通 過非共價(jià)鍵結(jié)合而形成異二聚體。脊椎動(dòng)物體內(nèi)，18種a亞基和8種0亞基組成24種不 同的異二聚體結(jié)構(gòu)。其中，aV0 3整合素在卵巢癌、黑色素瘤、乳腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等多種 腫瘤細(xì)胞及腫瘤相關(guān)血管內(nèi)皮細(xì)胞的表面高度表達(dá)，與腫瘤的新生血管生成和轉(zhuǎn)移密切相 關(guān)。
[0005] 已有研究證實(shí)，含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD)的=膚序列能夠特異性 的識(shí)別并結(jié)合整合素。目前常用的腫瘤穿膜膚iRGD(C(CRGDKGPDC))具有同時(shí)祀向腫 瘤新生血管和腫瘤細(xì)胞的特性，與腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上高表達(dá)的整合素受體蛋 白aV03和aV05高度結(jié)合，實(shí)現(xiàn)抗癌藥物的腫瘤祀向傳遞。（Sug址araKN,Teesalu T,KarmaliPP,KotamrajuVR,AgemyL,GreenwaldDR,RuoslahtiE.Coadministration of曰tumor-penetratingpeptideenhancestheefficacyofcancerdrugs.Science 2010May21 ;328巧981):1031-5.)
[0006] 現(xiàn)有技術(shù)披露，惡性腫瘤細(xì)胞發(fā)展成為腫瘤的過程中，腫瘤細(xì)胞在與機(jī)體相互 作用的過程中，利用自己的高突變性，一方面下調(diào)與免疫識(shí)別和攻擊相關(guān)蛋白分子的表 達(dá)而產(chǎn)生免疫逃逸；另一方面異?；蜻^表達(dá)免疫抑制相關(guān)蛋白，直接抑制腫瘤免疫反應(yīng)， 或者誘導(dǎo)免疫抑制細(xì)胞分化和浸潤。在運(yùn)個(gè)過程中，腫瘤細(xì)胞不僅克服機(jī)體免疫系統(tǒng) 對(duì)其識(shí)別和殺傷，而且建立起能為其提供充足營養(yǎng)和適合其快速生長的腫瘤免疫微環(huán) 境(DunnGP,BruceAT,IkedaH,OldLJ,SchreiberRD.Cancerimmunoediting:from immunosurveiIlancetotumorescape.NatImmunol. 2002Nov;3 (11):991-8)。
[0007] 由此可見，RGD膚雖然祀向腫瘤血管和腫瘤細(xì)胞，從而增強(qiáng)藥物對(duì)腫瘤的治療作 用，但是腫瘤的生物治療也是不可忽視的重要方面。由于腫瘤細(xì)胞為自己建立起免疫屏障， 機(jī)體無法識(shí)別和殺傷腫瘤細(xì)胞。只要腫瘤環(huán)境中有殘存的腫瘤細(xì)胞，那么腫瘤就有復(fù)發(fā)的 可能。而且，僅僅只是通過單一的腫瘤治療方式不能達(dá)到理想的治療效果。
[0008] 為了解決上述提及的問題，本發(fā)明提供一種更加有效的腫瘤祀向新型多膚。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的之一，提供了一種腫瘤祀向新型多功能多膚，所述多膚將含丙氨 酸-丙氨酸-天冬酷胺（AAN)序列連接于含RGD膚，優(yōu)選通過共價(jià)方式進(jìn)行連接，從而獲得 能夠祀向腫瘤細(xì)胞和血管和腫瘤相關(guān)巨隧細(xì)胞，從而調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境增強(qiáng)抗腫瘤效果的串 聯(lián)型多膚（nRGD)。
[0010] 研究中，本發(fā)明人將對(duì)腫瘤和腫瘤血管祀向作用非常突出的iRGD膚和腫瘤相關(guān) 巨隧細(xì)胞祀向的AAN通過共價(jià)鍵連接起來獲得nRGD,再W阿霉素值OX)為模型藥物，制備了 含藥脂質(zhì)體。
[0011] 在研究中意外地發(fā)現(xiàn)，將多膚nRGD與阿霉素值OX)制備的含藥脂質(zhì)體同iRGD與 阿霉素值OX)制備的含藥脂質(zhì)體相比，取得了出乎意料的抗腫瘤效果。本發(fā)明人將該膚 nRGD和Dox原藥或Dox脂質(zhì)體混合給藥，也取得了顯著的抗腫瘤效果。
[0012] 本發(fā)明的目的之一，提供了一種具有腫瘤祀向的新型多膚（nRGD)，其能直接與藥 物或載體混合使用。
[0013] 本發(fā)明的目的之一，提供了一種具有腫瘤祀向的新型多膚（nRGD)，其能夠修飾抗 腫瘤藥物，得到所述抗腫瘤藥物的前藥；也能夠修飾遞藥載體。
[0014] 本發(fā)明的目的之一，提供了一種具有腫瘤祀向的新型多膚，其通過膚段一丙氨 酸-丙氨酸-天冬酷胺（AAN)，祀向腫瘤相關(guān)巨隧細(xì)胞。
[0015] 本發(fā)明的目的之一，提供了一種具有腫瘤祀向的新型多膚，通過RGD多膚，祀向腫 瘤血管和腫瘤細(xì)胞。
[001引本發(fā)明的目的之一，提供了一種具有腫瘤祀向的新型多膚，其中AAN與含RGD膚是 優(yōu)選共價(jià)連接；或者優(yōu)選通過膚鍵或氨基酸膚鏈連接；或者AAN與含RGD膚通過W下方式 連接：-邸2畑-，-CHzS-,-邸2-邸2-，-CH=CH-, -CH(OH)CH廠和-CHHzS-。
[0017] 本發(fā)明所述的"新型多功能多膚"，含義與"新型多膚"、"多功能多膚"、"nRGD"、 "nRGD多膚"、"多膚nRGD"相同。
[0018] 本發(fā)明所述的"含RGD膚"，含義與"含RGD的膚"、"含RGD膚鏈"、"含RGD的膚鏈" 相同。
[0019] 本發(fā)明所述的AAN，為天冬氨酸蛋白內(nèi)切酶（Iegumain)的底物。本發(fā)明所述的AAN 的祀點(diǎn)為天冬氨酸蛋白內(nèi)切酶化egumain)。Iegumain廣泛存在于腫瘤細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境， 在酸性（pH= 4. 0-6. 5)環(huán)境中激活，在中性環(huán)境中失活。
[0020] 研究發(fā)現(xiàn)，天冬氨酸蛋白內(nèi)切酶和大多數(shù)的整合素受體如aV03共定位形成復(fù) 合物，在腫瘤細(xì)胞和腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上均存在高表達(dá)。多種類型的腫瘤如乳腺癌、 結(jié)腸癌、肺癌、肝癌等均過度表達(dá)天冬氨酸蛋白內(nèi)切酶。
[0021] 進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，含有丙氨酸-丙氨酸-天冬酷胺（AAN)序列的S膚底物 能被天冬氨酸蛋白內(nèi)切酶特異性地識(shí)別并進(jìn)行酶切。作為酶切位點(diǎn)，AAN序列被用于 修飾抗腫瘤藥物或藥物載體通過其特有的腫瘤部位酶敏感性實(shí)現(xiàn)腫瘤祀向，并在祀 部位釋放出抗腫瘤藥物W提高抗腫瘤藥物的腫瘤部位蓄積和藥效?；痠uY，Baj化ri KM,LiuC，Sinh過SC.Targetingcellsurface過Iph過(v)bet過(3)integrinincreases therapeuticefficaciesofaIegumainprotease-activatedauristatinprodrug.Mol Pharm. 2012JanI；9 (I) : 168-175.)
[0022] 更重要的是，本發(fā)明所述的AAN的靴點(diǎn)為天冬氨酸蛋白內(nèi)切酶化egumain)。在腫 瘤環(huán)境中，Iegumain的表達(dá)位點(diǎn)可W從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞表面。（Liao,D.etal.Syndetic enzymeinhibitorianoveltargetingligandfornanotherapeuticdrugdelivery inhibitingtumorgrowthwithoutsystemictoxicity.Nanomedicine. 7, 665 -673(2011).).Legumain不僅在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，與腫瘤微環(huán)境相關(guān)的腫瘤相關(guān) 巨日籃細(xì)胞也高表達(dá)D巧eisfeld,R-A-Hietumormicroenvironment:atargetfor combinationtherapyofbreastcancer.Crit.民ev.Oncog. 18, 115 - 133 (2013).Lin,Y.et al.Selectiveablationoftumor-associatedmacrophagessuppressesmetastasisand angiogenesis.CancerSci. 104, 1217 - 1225 (2013)?)
[0023] 專利CN201310048238中指出，AAN蘭版修飾多柔比星前藥與原藥具有相同的抗 腫瘤藥效。文獻(xiàn)也表明，AAN直接修飾脂質(zhì)體沒有提高藥物的抗腫瘤藥效。（ZeLiu,Min Xiong,JunboGong,YanZhang,NanBai,YunpingLuo,LuyuanLi,YuquanWei,Yanhua Liu,XiaoyueTan&RongXiang.Legumainprotease-activatedTAT-liposomecargofor targetingtumoursandtheirmicroenvironment.NatCommun. 2014 ;54280.)由ltb可見， 作為祀點(diǎn)，僅AAN=膚修飾抗癌藥物或者載體不能成功地提高抗癌藥物或載體的抗腫瘤效 果。
[0024] 本發(fā)明所述的新型多膚也能夠祀向腫瘤相關(guān)巨隧細(xì)胞（TAM)。TAM是存在于腫 瘤部位血管周圍，腫瘤無血管的壞死區(qū)域的重要的炎癥細(xì)胞。TAM是腫瘤部位關(guān)鍵組成 部分，其分泌大量的腫瘤生長促進(jìn)因子。在小鼠模型中也發(fā)現(xiàn)，其調(diào)節(jié)血管生成，淋己 管生成，免疫抑制和腫瘤轉(zhuǎn)移。（SethB.Coffelt,RussellHu曲es,ClaireE.Lewis. Tumor-曰ssoci曰tedm曰cro