過夜。挑取克隆，放入含50yg/ml卡那霉素的抗性的LB液體培養(yǎng)基中，220rmp，37°C培養(yǎng)OD 至0. 6左右，加入終濃度為IOmMIPTG，37°C池，收集IPTG誘導(dǎo)后的菌體，按IOmlWashing BufferI每克濕菌的比例重懸后超聲破碎。結(jié)果目的蛋白含于上清中。1000 Og離屯、30min， 收集上清。用IMAC親和色譜柱度io-Rad)進行親和純化（2CV去離子水沖洗，5CV含5mM咪 挫的washingBufferI平衡，6CV含目的蛋白上清上樣，6CV含5mM咪挫的washingBuffer I沖洗，6CV含IOmM咪挫的washingBuffer2 沖洗，IOCV含 500mM咪挫的ElutionBuffer 洗脫），收集過柱純化的目的蛋白（如圖I所示），用20mMTris-肥1，抑8. 0的溶液透 析，IOkDa超濾管對透析后的目的蛋白液進行濃縮，用BCA法測定純化后目的蛋白的濃度， SDS-PAGE電泳分析目的蛋白純度。
[0046] 本實施例的重組蛋白儀柱親和純化后，純度可達90%W上，不僅大大降低了其生 產(chǎn)成本，而且也具有更高的穩(wěn)定性，該重組蛋白在不凍干的情況下4°C可保存1周，-20°C可 保存3個月，-80°C至少保存1年。
[0047] 實施例3重組Rv3457c抗原作為檢測試劑對臨床可疑結(jié)核病人檢測
[0048] 本實施例W重組Rv3457c抗原作為檢測試劑對臨床可疑結(jié)核病人進行檢測，W健 康人做對照組，同時W目前常用結(jié)核病診斷抗原ESAT-6和CFP-IO同步分組進行實驗，具體 抗原的化ISPOT試驗設(shè)計見表1，操作步驟如下：
[0049] 1、樣本采集：無菌采集人外周靜脈血約5ml至肝素抗凝管中，樣本采集后可于室 溫下保存，不要放置在冷藏或冷凍室；并做好標(biāo)記；
[0050] 2、外周血單個核淋己細胞的分離、收集及計數(shù)：
[0051] a、取5ml的全血，加入等體積的RTPMI-1640無血清培養(yǎng)液，并混勻； 陽化引 b、取一支15ml離屯、管加入4ml的淋己細胞分離液，并將混勻的血樣緩緩加入到淋 己細胞分離液的表面，兩者之間的界限要明顯，不要混勻，蓋緊管蓋，輕拿輕放；
[0053] C、將離屯、管放入水平離屯、機，lOOOg，室溫，離屯、22min，小屯、取出后可見血液成分 分層；
[0054] t用一次性吸管將單個核淋己細胞層轉(zhuǎn)移到新的15ml離屯、管中，并加入IOml RTPMI-1640無血清培養(yǎng)液進行混勻，放入離屯、機中600g離屯、洗涂lOmin，在加入無血清培 養(yǎng)液，350g離屯、IOmin;
[0055] e、取出離屯、管棄上清，加入400y1的RPMI-1640含血清培養(yǎng)液，吹打細胞混勻，吹 打時要輕柔，盡量避免細胞受外力的損傷；
[0056]f、取120y1于自動計數(shù)儀（Sysmex，XT-2000i)上進行淋己細胞計數(shù)；
[0057] g、調(diào)整細胞濃度至2. 5Xl〇6/ml，配制500y1 ; 陽化引 3、板的活化：200yl/wellRPMI-1640含血清培養(yǎng)液，5-lOmin，傾倒；
[0059] 4、按照實驗設(shè)計安排：每個檢測樣本需2個孔，加入不同的樣本細胞IOOiil/ well；
[0060] 陰性對照：每孔加入10y1RPMI-1640含血清培養(yǎng)液
[0061] 陽性對照?？准尤?0yIPHA
[0062] 測試孔a:每孔加入10y1結(jié)核分枝桿菌特異性抗原ESAT-6 (根據(jù)下文的常規(guī)方 法制備）5Jig/ml
[0063]測試孔b:每孔加入IOiil結(jié)核分枝桿菌特異性抗原CFP-IO(根據(jù)下文的常規(guī)方 法制備）5Jig/ml W64] 刺激抗原：每孔加入10 y 1結(jié)核分枝桿菌重組抗原Rv3457c 10 y g/ml其中： 陽0化]結(jié)核分枝桿菌特異性抗原ESAT-6和CFP-IO是現(xiàn)有常用的診斷抗原，ESAT-6和CFP-IO重組蛋白的常規(guī)制備方法為：W結(jié)核分枝桿菌基因組DNA為模板，用蛋白的特異性 引物按常規(guī)基因工程方法構(gòu)建祀T21a-esat6或化t32a-c巧10重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入大腸桿菌 化2UDE3)physS表達菌株，ImMIPTG37°C誘導(dǎo)化即可獲得大量的重組蛋白，儀柱親和純 化其純度達90%W上，將重組蛋白用20mMTris-HCl,pH8. 0透析后超濾濃縮，BCA法檢測 蛋白濃度，按Img/管分裝，凍干保存； W66] 5、當(dāng)加完所有的樣品之后，蓋上板蓋，放入37 °C，5 %C〇2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 16-20虹（17h) ;6、
[0067] 在取出培養(yǎng)板之前半個小時，準(zhǔn)備好拍水紙、加樣槽（洗液）、洗瓶、將50X洗液放 置室溫下平衡一會，配制IXWashingbuffer,根據(jù)實驗方案而定； !；00側(cè) 7、洗板：傾倒孔內(nèi)液體，200Ji1/well的1XWashingbuffer,洗涂5次，每次 30sec，拍干，要用力拍，拍干凈；PBS洗液； W例 8、加已經(jīng)稀釋好的酶標(biāo)抗體，50y1/well，4°C溫箱，解育1虹；一步法反應(yīng)；
[0070] 9、洗板：傾倒孔內(nèi)液體，200Ji1/well的1XWashingbuffer,洗涂5次，每次 30sec，拍干，要用力拍，拍干凈；
[0071] 10、顯色：加入配好的顯色液，100y1/well，室溫避光保存7min ; 陽0巧11、待斑點生長到適合的大小后，W去離子水洗涂2遍，終止顯色過程。拍干之后 取下保護層，自然驚干。勿將板放置烤箱內(nèi)，防止膜發(fā)脆破裂；也可直接用自來水直接沖洗， 但不能將孔直接對著水流，而應(yīng)將板子豎著用水沖洗，水流要和緩，并可將板條取下，輕輕 沖洗底面后甩干，放置待自然驚干；
[007引 12、ELISP0T板斑點計數(shù)，并記錄斑點的各種參數(shù)，做統(tǒng)計分析（如圖2所示）。
[0074] 結(jié)果判斷：當(dāng)測試孔A或B達到W下標(biāo)準(zhǔn)則判定為陽性結(jié)果：
[0075] (1)如果陰性對照孔斑點數(shù)為0-5,用測試孔A或B的斑點數(shù)減去陰性對照孔斑點 數(shù)> 6 ;
[0076] 似如果陰性對照孔斑點數(shù)> 6,測試孔A或B的斑點數(shù)必須大于2倍的陰性對照 孔斑點數(shù)。
[0077] 結(jié)果解釋：陽性結(jié)果提示檢測樣本中含有針對結(jié)核分枝桿菌特異的效應(yīng)T淋己細 胞；陰性結(jié)果提示檢測樣本中不含有針對結(jié)核分枝桿菌特異的效應(yīng)T淋己細胞。表2是是 重組蛋白Rv3457c與現(xiàn)有的ESAT-6, CFP-IO分別刺激臨床標(biāo)本產(chǎn)生致敏T淋己細胞實驗結(jié) 果。
[0078] 表IELISPOT試驗設(shè)計
[0079]
[0080] 表2重組蛋白Rv3457c與ESAT-6, CFP-IO分別刺激臨床標(biāo)本T淋己細胞的化ISPOT 實驗結(jié)果
[0082] 表2的結(jié)果表明，Rv3457c重組蛋白抗原在刺激臨床標(biāo)本產(chǎn)生效應(yīng)性T淋己細胞 檢測上，其檢測的敏感度為70. 4% (19/27)，特異性為86. 2% (25/29)。其敏感度和特異性 總體接近于ESAT-6抗原和CFP-IO抗原。
[0083] 本發(fā)明的結(jié)核分枝桿菌Rv3457c重組蛋白可W單獨作為診斷試劑，也可W與現(xiàn)有 已知的診斷抗原組合使用，從而提高對潛伏性結(jié)核病患者的檢測敏感性。
[0084] 除上述實施例外，本發(fā)明還可W有其它實施方式。凡采用修飾、更換、等同替換或 等效變換形成的技術(shù)方案，均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種結(jié)核分枝桿菌Rv3457c重組蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDN0:1所 不。2. -種編碼結(jié)核分枝桿菌Rv3457c重組蛋白的基因。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列選自以下序列的任意一種： ①SEQIDNO:2所示的核苷酸序列； ② 不同于SEQIDNO: 2但編碼的氨基酸序列與SEQIDNO: 2所編碼的氨基酸序列相同 的核苷酸序列； ③ 在嚴格雜交條件下與上述①或②中的序列雜交，并且編碼具有所述結(jié)核分歧桿菌 Rv3457c重組蛋白活性的核苷酸序列。4. 一種包含權(quán)利要求2所述基因的重組質(zhì)粒。5. -種結(jié)核分枝桿菌Rv3457c重組蛋白的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 制備結(jié)核分枝桿菌菌株基因組DNA; (2) 擴增結(jié)核分枝桿菌Rv3457c基因； (3) 結(jié)核分枝桿菌Rv3457c基因插入表達質(zhì)粒； (4) 將構(gòu)建的表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入宿主細胞； (5) 誘導(dǎo)表達結(jié)核分枝桿菌Rv3457c蛋白； (6) 分離純化誘導(dǎo)表達產(chǎn)物，得到結(jié)核分枝桿菌Rv3457c重組蛋白； 其中，在制備結(jié)核分枝桿菌Rv3457c基因中采用的引物為引物Rv3457c-F和引物Rv3457c-R，所述引物Rv3457c-F的核苷酸序列如SEQIDNo:3所示，所述引物Rv3457c-R 的核苷酸序列如SEQIDNo:4所示。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)核分枝桿菌Rv3457c重組蛋白在制備檢測或診斷結(jié)核病的 試劑中的應(yīng)用。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)核分枝桿菌Rv3457c重組蛋白在制備結(jié)核病檢測試劑盒中 的應(yīng)用。8. -種結(jié)核病檢測試劑盒，其特征在于，其組分中的檢測抗原是結(jié)核分枝桿菌 Rv3457c重組蛋白。
【專利摘要】本發(fā)明公開了結(jié)核分枝桿菌Rv3457c重組蛋白、制備方法及其應(yīng)用。本發(fā)明的結(jié)核分枝桿菌Rv3457c重組蛋白的氨基酸序列如SEQ？ID？NO:1所示。本發(fā)明還提供結(jié)核分枝桿菌RvRv3457c重組蛋白的編碼核苷酸序列、重組蛋白的制備方法。本發(fā)明基于免疫組學(xué)的研究成果，首次報道了一種結(jié)核分枝桿菌免疫優(yōu)勢抗原Rv3457c。用于結(jié)核病細胞免疫學(xué)診斷，具有較高的敏感性，而且與傳統(tǒng)皮試試驗相比，具有更為快速和安全可靠的優(yōu)點。
【IPC分類】G01N33/569, C12N15/31, G01N33/68, C12N15/70, C07K14/35
【公開號】CN105294844
【申請?zhí)枴緾N201510626660
【發(fā)明人】張舒林, 李榮秀, 馬國榮, 余曉麗, 郭曉奎, 王洪海
【申請人】上海交通大學(xué)
【公開日】2016年2月3日
【申請日】2015年9月28日