玉米線粒體丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)體基因ZmNRGA1在調(diào)控氣孔運(yùn)動(dòng)及植物抗干旱中的應(yīng)用
【專利說明】玉米線粒體丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)體基因ZmNRGAI在調(diào)控氣孔運(yùn)動(dòng)及植物抗干旱中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種玉米線粒體丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)體基因的應(yīng)用，尤其涉及一種玉米線粒體丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)體基因ZmNRGAI (Gene ID: 100273562)在調(diào)控氣孔運(yùn)動(dòng)及植物抗干旱中的應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)、基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]通過生物信息學(xué)對(duì)已公布的玉米線粒體丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)體基因ZmNRGAI基因序列(Gene ID: 100273562)分析，表明其編碼一種線粒體丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(MitochondrialPyruvate Carrier, MPC)。其轉(zhuǎn)運(yùn)胞質(zhì)糖酵解的終產(chǎn)物一丙酮酸，進(jìn)入線粒體內(nèi)進(jìn)行三羧酸循環(huán)。
[0003]根據(jù)玉米研究網(wǎng)站(http://www.maizegdb.0rg)提供的eFP Blowser結(jié)果顯示，ZmNRGAI基因在植物葉片等部位大量表達(dá)。因植物表皮的氣孔是蒸騰作用水分散失的主要通道，故調(diào)控氣孔的張開和閉合，直接影響植物保水性及抗干旱能力?；诖?，對(duì)玉米基因ZmNRGAI在調(diào)控氣孔運(yùn)動(dòng)及植物抗干旱中的應(yīng)用研究，在改良作物，尤其是玉米的抗逆能力方面有重要的價(jià)值。但經(jīng)檢索，有關(guān)玉米線粒體丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)體基因ZmNRGAI在調(diào)控氣孔運(yùn)動(dòng)及植物抗干旱中的應(yīng)用文獻(xiàn)目前還未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對(duì)現(xiàn)有研究的不足，本發(fā)明的目的是提供一種玉米線粒體丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)體基因ZmNRGAI在調(diào)控氣孔運(yùn)動(dòng)及植物抗干旱中的應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明所述玉米線粒體丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)體基因ZmNRGAI在調(diào)控氣孔運(yùn)動(dòng)及植物抗干旱中的應(yīng)用。
[0006]申請(qǐng)人根據(jù)已公布的ZmNRGAI基因核苷酸序列(Gene ID: 100273562)，通過RT-PCR技術(shù)克隆該基因。在玉米中，ZmNRGAI因剪切方式不同有兩種不同的基因序列，分別為ZmNRGAl_T01和ZmNRGAl_T02。本發(fā)明所述玉米丙酮酸線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)體基因ZmNRGAI優(yōu)選是玉米丙酮酸線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)體基因ZmNRGAl_T02。本發(fā)明所述植物優(yōu)選是擬南芥或玉米。
[0007]生物信息學(xué)分析顯示，ZmNRGAl_T02是擬南芥NRGA1的同源基因。利用克隆到的基因片段ZmNRGAl_T02構(gòu)建植物表達(dá)載體體pCM1307-ZmNRGAl_T02，經(jīng)過分子學(xué)和遺傳學(xué)操作轉(zhuǎn)化擬南芥，得到ZmNRGAl_T02過表達(dá)植株(命名為0E1、0E5)。通過氣孔運(yùn)動(dòng)、離體葉片失水率和植株干旱等實(shí)驗(yàn)方法對(duì)上述植株進(jìn)行生理性狀分析，ZmNRGAl_T02過表達(dá)植株(0EU0E5)相對(duì)對(duì)照組(擬南芥野生型Col-Ο)和空載體對(duì)照(EV)，在氣孔運(yùn)動(dòng)中對(duì)ΑΒΑ弱敏感且抗干旱能力減弱，證實(shí)ZmNRGAI在植物抗干旱脅迫應(yīng)答中起到重要的調(diào)節(jié)作用(見圖1、圖2、圖3)。
[0008]本發(fā)明首次闡明了玉米線粒體丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)體基因ZmNRGAI尤其是是玉米丙酮酸線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)體基因ZmNRGAl_T02在調(diào)控氣孔運(yùn)動(dòng)及植物抗干旱中的應(yīng)用，為利用ZmNRGAI基因改良植物體內(nèi)的保水性及抗干旱能力奠定了基礎(chǔ)，預(yù)示本發(fā)明的應(yīng)用將有助于提高植物的抗旱脅迫能力，對(duì)培育抗旱高產(chǎn)的作物新品種有重要的理論指導(dǎo)意義，對(duì)我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有巨大應(yīng)用價(jià)值。
【附圖說明】
[0009]圖1:ZmNRGAl參與植物激素脫落酸(ΑΒΑ)調(diào)控氣孔運(yùn)動(dòng)過程。
[0010]其中:0pen是指ΑΒΑ抑制氣孔開放過程；Closure是指ΑΒΑ促進(jìn)氣孔關(guān)閉過程。[0011 ] 結(jié)果顯示在ΑΒΑ抑制氣孔開放和促進(jìn)氣孔關(guān)閉過程中，ZmNRGAI過表達(dá)株系(0E1、0E5)的氣孔開度比野生型(Col-Ο)大，說明其參與ΑΒΑ調(diào)控氣孔運(yùn)動(dòng)過程，過表達(dá)ZmNRGAI植株對(duì)ΑΒΑ弱敏感。
[0012]圖2:ZmNRGAI改變植物離體葉片失水率。
[0013]同樣條件下，統(tǒng)計(jì)離體葉片失水率。與野生型(Col-Ο)和空載體對(duì)照(EV)對(duì)比，ZmNRGAI過表達(dá)植株(0E1、0E5)失水快，說明ZmNRGAI可能通過參與氣孔運(yùn)動(dòng)調(diào)控植物離體葉片失水，影響植物體內(nèi)水分散失。
[0014]圖3:ZmNRGAI參與植物抗干旱過程。
[0015]干旱處理下，與野生型(Col-Ο)和空載體對(duì)照(EV)對(duì)比，ZmNRGAI過表達(dá)株系(0EU0E5)抗干旱能力減弱，說明ZmNRGAI在植物抗干旱脅迫應(yīng)答中起到重要的調(diào)節(jié)作用。
【具體實(shí)施方式】
[0016]以下實(shí)施例用于闡明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)例中未注明具體的實(shí)驗(yàn)方法，均可按照常規(guī)方法進(jìn)行，或按照產(chǎn)品制造生產(chǎn)廠商的使用說明。
[0017]實(shí)施例1玉米線粒體丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)體基因ZmNRGAI轉(zhuǎn)基因植株獲得
[0018]1，PCR方法克隆ZmNRGAl_T02基因片段
[0019]以玉米自交系B73的cDNA為模板，以下面引物組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增:
[0020]ZmNRGAl-BamHl-F:5’ -CGGGATCCCGATGGCTGCTACAAAGCTTCA-3’
[0021 ] ZmNRGA1-Kpnl-R:5’ -GGGTACCCTTACAACTTAAACTGATTGAGC-3’
[0022]PCR產(chǎn)物跑電泳后，切膠回收，純化得到ZmNRGAl_T02基因片段。
[0023]2，載體連接和轉(zhuǎn)化
[0024]首先用純化后的ZmNRGAl_T02基因片段連接中間克隆載體Blunt (北京全式金公司產(chǎn)品)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，通過抗生素篩選和菌落PCR得到陽性克隆；連接后的Blunt載體進(jìn)行測(cè)序，證明得到的ZmNRGAl_T02核苷酸序列完全正確。
[0025]通過酶切組合BamHl/Kpnl將ZmNRGAl_T02核苷酸序列從Blunt載體中切下，再次膠回收連接植物表達(dá)載體PCM1307。
[0026]3，轉(zhuǎn)基因植株的篩選和獲得
[0027]連接正確的植物表達(dá)載體pCM1307-ZmNRGAl_T02轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，通過農(nóng)桿菌浸染的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作，轉(zhuǎn)入野生型植株，獲得過表達(dá)株系。具體實(shí)施方法如下:
[0028]農(nóng)桿菌感受態(tài)轉(zhuǎn)化步驟:
[0029]1) _80°C冰箱中取出農(nóng)桿菌感受態(tài)，冰浴融化，加入目的DNA，輕彈均勻，冰浴30分鐘；
[0030]2)冰浴結(jié)束后，液氮速凍1分鐘，緊接著37 °C水浴3-5分鐘；
[0031]3)加入500 μ 1無抗生素LB液體培養(yǎng)基，28°C、振蕩培養(yǎng)2_4小時(shí)；
[0032]4)培養(yǎng)結(jié)束后收集菌體，100 μ 1 LB液體培養(yǎng)基重懸，菌液涂布在YEP固體培養(yǎng)基(加相對(duì)應(yīng)的抗生素)，28°C倒置培養(yǎng)2-3天；
[0033]5)挑取單克隆菌斑做菌落PCR鑒定。
[0034]農(nóng)桿菌浸染擬南芥:培養(yǎng)約4周的擬南芥，待抽薹后，將主花序頂端減去，促進(jìn)側(cè)生花序生長(zhǎng)。將已轉(zhuǎn)化好的農(nóng)桿菌菌液在轉(zhuǎn)化前一天放大培養(yǎng)(按照2%接種)，28°C振蕩培養(yǎng)過夜，至0D6M= 1.0-1.2,6000rpm離心15分鐘收集菌體，用轉(zhuǎn)化介質(zhì)將菌液稀釋至0D6M= 0.8-0.9，加入Sillwet至終濃度為0.02%。將花盆倒置，花序浸入轉(zhuǎn)染液中20秒，花序上覆蓋薄薄一層轉(zhuǎn)染液，將花盆水平放置，在黑暗中培養(yǎng)24小時(shí)，隨后22°C，長(zhǎng)日照(16小時(shí)光照，8小時(shí)黑暗)培養(yǎng)，收取種子。
[0035]通過抗性篩選標(biāo)記和PCR鑒定得到陽性轉(zhuǎn)基因植株(0E1、0E5)。
[0036]實(shí)施例2玉米線粒體丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)體基因ZmNRGAl_T02的轉(zhuǎn)基因應(yīng)用
[0037]利用ZmNRGAl_T02過表達(dá)植株(0E1、0E5)、進(jìn)行下面生理性狀實(shí)驗(yàn)，分析ZmNRGAl_T02在擬南芥或其他經(jīng)濟(jì)作物中對(duì)氣孔運(yùn)動(dòng)調(diào)控及植物抗干旱方面的應(yīng)用。
[0038]1，擬南芥氣孔運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)
[0039]外源ΑΒΑ抑制氣孔開放(Opening)和促進(jìn)氣孔關(guān)閉(Closure)的實(shí)驗(yàn)。
[0040]Opening:
[0041]1)剪取生長(zhǎng)四周的擬南芥蓮座葉，放在Opening Buffer (10mM KCl，7.5mMiminodiacetic acid, lOmM Mes-KOH，pH 6.15)中，下表皮接觸 Buffer，溫室條件下避光處理；
[0042]2)2.5小時(shí)后，加ΑΒΑ到Opening Buffer中，終濃度為0_50 μ M，繼續(xù)黑暗處理10分鐘后，室溫光照培養(yǎng)(450mol.mis1)；
[0043]3) 2.5小時(shí)后，撕取葉片下表皮，制作水壓片，顯微鏡400放大倍數(shù)下拍照；
[0044]4)用統(tǒng)計(jì)軟件ImageJ統(tǒng)計(jì)氣孔開度。
[0045]Closure:
[0046]1)剪取生長(zhǎng)四周的擬南芥蓮座葉，放在Closure Buffer (20mM KCl，lmM CaCl2，5mMMes-KOH, pH 6.15)中，下表皮接觸 Buffer，室溫光照培養(yǎng)(450mol.mis1)；
[0047]2) 2.5小時(shí)后，加ΑΒΑ (脫落酸)到Closure Buffer中，終濃度為0-50 μ Μ，繼續(xù)光照處理；
[0048]3) 2.5小時(shí)后，撕取葉片下表皮，制作水壓片，顯微鏡400放大倍數(shù)下拍照；
[0049]4)用統(tǒng)計(jì)軟件ImageJ統(tǒng)計(jì)氣孔開度。
[0050]結(jié)果顯示在ΑΒΑ抑制氣孔開放和促進(jìn)氣孔關(guān)閉過程中ZmNRGAI過表達(dá)株系(0E1、0E5)的氣孔開度比對(duì)照組Col-Ο大，說明過表達(dá)ZmNRGAI基因后植株對(duì)ΑΒΑ弱敏感(結(jié)果如圖1所示)。
[0051 ] 2，擬南芥離體葉片失水率實(shí)驗(yàn)
[0052]生長(zhǎng)四周左右的植株，選取生長(zhǎng)健壯的蓮座葉，剪取，放在溫室條件下進(jìn)行失水實(shí)驗(yàn)，分別在0、1、2、3、4、5、6、7、8小時(shí)稱量葉片重量，按照下面公式計(jì)算葉片失水率:
[0053]葉片失水率％ = (0小時(shí)重量-X小時(shí)重量)/0小時(shí)重量X 100
[0054]離體葉片失水結(jié)果如圖2所示，同樣條件下，統(tǒng)計(jì)各轉(zhuǎn)基因植株的離體葉片失水率。與野生型(Col-Ο)和空載體對(duì)照(EV)相比，ZmNRGAl_T02過表達(dá)植株(0E1、0E5)失水快(結(jié)果如圖2所示)。
[0055]3，擬南芥植株干旱實(shí)驗(yàn)
[0056]生長(zhǎng)3-4周的植株，充分澆水后，停止?jié)菜Ｔ跍厥腋珊堤幚?，植株開始萎蔫至死亡時(shí)進(jìn)行復(fù)水，3天后觀察植株存活狀態(tài)。在干旱處理后和復(fù)水3天后分別拍照(見圖3)。
[0057]植株干旱實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，干旱處理下，與野生型(Col-Ο)和空載體對(duì)照(EV)對(duì)比，ZmNRGAl_T02過表達(dá)(0E1、0E5)抗干旱能力減弱，說明ZmNRGAl在植物抗干旱脅迫應(yīng)答中起到重要的調(diào)節(jié)作用，在培育抗旱作物新品種方面有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.玉米丙酮酸線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)體基因ZmNRGAl在調(diào)控氣孔運(yùn)動(dòng)及植物抗干旱中的應(yīng)用。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:所述玉米丙酮酸線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)體基因ZmNRGAl是玉米丙酮酸線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)體基因ZmNRGAl_T02。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:所述植物是擬南芥或玉米。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種玉米丙酮酸線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)體基因ZmNRGA1在調(diào)控氣孔運(yùn)動(dòng)及植物抗干旱中的應(yīng)用，其中所述玉米丙酮酸線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)體基因ZmNRGA1是玉米丙酮酸線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)體基因ZmNRGA1_T02。經(jīng)綜合實(shí)驗(yàn)證實(shí)：ZmNRGA1_T02在植物激素脫落酸(ABA)調(diào)控氣孔運(yùn)動(dòng)中起到負(fù)調(diào)控因子的作用，同時(shí)在植物應(yīng)對(duì)干旱脅迫中有調(diào)控作用。預(yù)示本發(fā)明所述的應(yīng)用將有助于改良植物的抗旱脅迫能力，對(duì)培育抗旱高產(chǎn)的作物新品種有重要的理論指導(dǎo)意義，對(duì)我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有巨大應(yīng)用價(jià)值。
【IPC分類】C12N15/82, C12N15/29, A01H5/00
【公開號(hào)】CN105296504
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510868129
【發(fā)明人】張偉, 吳琪琪, 李春龍, 王美, 吳曉萌, 喬柱, 張尚立
【申請(qǐng)人】山東大學(xué)
【公開日】2016年2月3日
【申請(qǐng)日】2015年12月1日