用于擴(kuò)增襀翅目昆蟲線粒體基因組長片段的通用引物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于擴(kuò)增覆蓋襀翅目昆蟲線粒體全基因組的長片段的通用引物，該通用引物由兩對(duì)引物組成，其序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示。采用本發(fā)明的通用引物，可以有效地?cái)U(kuò)增出多種襀翅目物種線粒體基因組的長片段，有助于縮短獲取分子數(shù)據(jù)的周期，為我國襀翅目昆蟲的系統(tǒng)發(fā)育研究提供了重要工具。
【專利說明】
用于擴(kuò)増櫝翅目昆蟲線粒體基因組長片段的通用引物
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及兩對(duì)用于擴(kuò)增積翅目昆蟲線粒體基因組長片段的通用引物。
【背景技術(shù)】
[0002] 積翅目（Plecoptera)又稱石蠅，該類昆蟲較廣泛地分布在多種類型的水域中，是 重要的水質(zhì)監(jiān)測(cè)指標(biāo)生物，加強(qiáng)該類群的分類研究，可以更好地為水質(zhì)環(huán)境監(jiān)測(cè)提供服務(wù)。
[0003] 從系統(tǒng)學(xué)和進(jìn)化學(xué)的角度來看，積翅目是一個(gè)關(guān)鍵的類群。雖然積翅目系統(tǒng)發(fā)育 被廣泛研究，但仍需要通過其他更多的特征來證明。而通過分子手段獲得的資料將更有助 于推斷積翅目各科間的親緣關(guān)系以及和其他目的親緣關(guān)系。深入了解積翅目昆蟲的起源、 進(jìn)化和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，對(duì)重建積翅目系統(tǒng)發(fā)育乃至研究昆蟲綱的進(jìn)化關(guān)系都具有重要意 義。這就需要借助快速而準(zhǔn)確的分子手段對(duì)積翅目昆蟲進(jìn)行相關(guān)領(lǐng)域的研究。
[0004] 近年來，隨著分子技術(shù)和高通量技術(shù)的快速發(fā)展，線粒體基因組已成為區(qū)分物種 和研究物種進(jìn)化關(guān)系的熱點(diǎn)研究對(duì)象。因此，利用線粒體基因組對(duì)積翅目昆蟲進(jìn)行系統(tǒng)發(fā) 育分析是一種較好的方法。目前，昆蟲遺傳研究過程中，小規(guī)模線粒體基因組研究的主流方 法仍然是傳統(tǒng)的基于PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的引物步移法。該方法使用的引物數(shù)量較多、擴(kuò)增效率 低、對(duì)模版純度要求高、耗時(shí)長，并且缺少足夠的特異性，這將阻礙昆蟲線粒體基因組分子 數(shù)據(jù)的快速積累，并對(duì)某些昆蟲如對(duì)積翅目昆蟲的系統(tǒng)發(fā)育研究造成困難。目前國際上沒 有專門針對(duì)擴(kuò)增積翅目昆蟲線粒體基因組長片段的通用引物的相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的是提供一種積翅目昆蟲線粒體基因組長片段擴(kuò)增的通用引物，它能滿 足現(xiàn)有技術(shù)的上述需求。
[0006] -種用于擴(kuò)增積翅目昆蟲線粒體基因組長片段的通用引物，由兩對(duì)引物組其序列 如SEQIDN0·1~SEQIDN0·4所示。
[0007] 本發(fā)明還公開了一種積翅目昆蟲線粒體基因組長片段的擴(kuò)增方法，是采用上述的 引物，用25μ1 PCR體系在特定PCR擴(kuò)增條件下進(jìn)行目標(biāo)片段擴(kuò)增。
[0008] 所述的25μ1 PCR體系是：5μ1 10Xbuffer(+Mg2+)，2.5yl dNTP(2.5mM)，3yl上游引 物（20μΜ)，3μ1下游引物（20μΜ)，0·2μ1 TaKaRa LA Taq酶（5υ/μ1)，1μ1 DNA模板（30ng/yl)， 10.3μ1雙蒸水。
[0009] 所述的PCR擴(kuò)增條件是：93°C預(yù)變性2min;92°C變性10s，54°C退火30s，68°C延伸 8min，擴(kuò)增20個(gè)循環(huán);之后92°C變性10s，54°C退火30s，68°C延伸8min，且每一循環(huán)增加20s， 擴(kuò)增20個(gè)循環(huán);最后68°C延伸7min。
[0010] 本發(fā)明根據(jù)昆蟲綱昆蟲的線粒體基因組存在保守區(qū)域的特性，通過比對(duì)Genbank 中不同目昆蟲的線粒體基因組序列設(shè)計(jì)出擴(kuò)增引物。采用本發(fā)明的積翅目線粒體基因組長 片段擴(kuò)增引物，可以有效地?cái)U(kuò)增出積翅目不同科物種的長片段序列，填補(bǔ)了積翅目長片段 沒有通用的擴(kuò)增引物的空白，對(duì)積翅目不同科和屬的昆蟲進(jìn)行大規(guī)模的長片段測(cè)序，將產(chǎn) 物直接進(jìn)行高通量測(cè)序，有效縮短分子數(shù)據(jù)的獲取周期，為我國積翅目昆蟲的系統(tǒng)發(fā)育和 種群遺傳結(jié)構(gòu)研究提供了重要工具。本發(fā)明涉及的擴(kuò)增引物較過去傳統(tǒng)方法有較大的優(yōu) 勢(shì)，具體表現(xiàn)為:本引物能有效擴(kuò)增出總長近16000bp的長片段，完全覆蓋線粒體基因組全 長，而過去的傳統(tǒng)方法有效擴(kuò)增長度一般為lOOObp左右，且擴(kuò)增效率低，不利于上述研究的 數(shù)據(jù)分析。利用本引物對(duì)積翅目昆蟲進(jìn)行大規(guī)模的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析，能顯著降低實(shí)驗(yàn)成 本，縮短實(shí)驗(yàn)周期，提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。
【附圖說明】
[0011] 圖1是本發(fā)明引物對(duì)積翅目4科昆蟲線粒體長片段的擴(kuò)增效果圖。1-2為鉤積;3-4 為扁積;5-6為綠積;7-8為刺積;Μ為Marker。
[0012] 圖2是實(shí)驗(yàn)過程中其它引物對(duì)積翅目4科昆蟲線粒體長片段的擴(kuò)增效果圖。1-2為 鉤積;3-4為扁積;5-6為綠積;7-8為刺積;Μ為Marker。
【具體實(shí)施方式】
[0013] 本發(fā)明的積翅目線粒體基因組長片段的擴(kuò)增引物篩選方法共分兩個(gè)步驟：1.以 Genbank中測(cè)得的不同目昆蟲的線粒體基因組序列為基礎(chǔ)，通過比對(duì)找出相對(duì)保守的序列 片段進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，同時(shí)引入簡(jiǎn)并位點(diǎn)增加引物通用性;2.將合成的引物對(duì)積翅目昆蟲線 粒體基因組進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)其在積翅目中的通用性和擴(kuò)增效率;3.在過程中曾設(shè)計(jì)出多對(duì) 引物，經(jīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證表明本發(fā)明的引物最優(yōu)。
[0014] 下面結(jié)合實(shí)例對(duì)發(fā)明做進(jìn)一步說明：
[0015] 1.樣品準(zhǔn)備:樣品均使用存放于揚(yáng)州大學(xué)應(yīng)用昆蟲研究所標(biāo)本室內(nèi)存放于100% 酒精的積翅目不同科的昆蟲，包括鉤積科、扁積科、綠積科、刺積科等科的積翅目昆蟲。
[0016] 2. DNA提取:Axygen試劑盒提取DNA，具體步驟參照說明書。
[0017] 3 .數(shù)據(jù)來源：數(shù)據(jù)來源于美國國立生物技術(shù)信息中心（NCB I，h 11 p : / www.ncbi.nlm.gov/)。
[0018] 4.序列比對(duì):利用ClustalX軟件將不同目昆蟲的線粒體基因組全序列進(jìn)行比對(duì)， 找出比較保守、堿基變異度最小的序列區(qū)域。
[0019] 5.引物合成：根據(jù)上述的比對(duì)結(jié)果，利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5在堿基 變異度最小的序列區(qū)域設(shè)計(jì)出2對(duì)引物。引物序列為
[0020] Au:5'CGAGCWTACTTTACTTCAGCMACWATAATTA3'（SEQ ID N0.1);
[0021] Ad:5'GCAAATARRAARTATCATTCATTCTGGTTGGAT 3'（SEQ ID N0.2);
[0022] Bu:5'TACACCAAACAGGATCAAATAAYCCMWTAGG 3'（SEQ ID N0.3);
[0023] Bd:5'GCTCCACARATTTCTRCATTGACCAAARAA3'（SEQ ID N0.4)。
[0024] 6.引物擴(kuò)增:將上述擴(kuò)增引物分別應(yīng)用于PCR擴(kuò)增所采集的樣本。
[0025] 7.擴(kuò)增結(jié)果檢測(cè)：擴(kuò)增引物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，該引物 可以有效地?cái)U(kuò)增積翅目昆蟲的線粒體長片段。利用這2對(duì)引物擴(kuò)增出的DNA片段總長度約為 leooobp，覆蓋積翅目昆蟲線粒體基因組(全長為leooobp左右），且瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)條 帶較為單一（圖1);而當(dāng)使用其它引物時(shí)，電泳檢測(cè)條帶則大量彌散，效果較差（圖2)。因此， 本發(fā)明引物可以有效地?cái)U(kuò)增出積翅目不同科物種的線粒體基因組長片段，且測(cè)序結(jié)果較準(zhǔn) 確。
[0026] 8.引物擴(kuò)增條件：上述引物25μ1 PCR體系為：5μ1 10 Xbuffer(+Mg2+)，2.5yl dNTP (2 · 5mM)，3μ1 上游引物（20μΜ)，3μ1 下游引物（20μΜ)，0 · 2μ1 TaKaRa LATaq酶（5UAU)，ΙμL DNA模板（30ng/yl)，10·3μ1 雙蒸水。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 用于擴(kuò)增積翅目昆蟲線粒體全基因組長片段的通用引物，其特征在于，由兩對(duì)引物 組成，其序列如SEQIDN0.1~SEQIDN0.4所示。2. -種積翅目昆蟲線粒體全基因組序列的擴(kuò)增方法，其特征是采用權(quán)利要求1所述的 通用引物，用25μ1 PCR體系在PCR擴(kuò)增條件下進(jìn)行目標(biāo)片段擴(kuò)增。3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的25μ1 PCR體系是：5μ1添加 Mg2+的10 X buffer，2.5yl dNTP，3yl上游引物，3μ1 下游引物，0·2μ1 TaKaRa LA Taq酶，ΙμL DNA模板， 10.3μ1雙蒸水。4. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的PCR擴(kuò)增條件是:93 °C預(yù)變性2min; 92 °C 變性1〇8,54°(：退火3〇8,68°(：延伸81^11，擴(kuò)增20個(gè)循環(huán)；之后92°(：變性1〇8,54°(：退火3〇8,68 °C延伸8min，且每一循環(huán)增加20s，擴(kuò)增20個(gè)循環(huán);最后68 °C延伸7min。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK106086014SQ201610539758
【公開日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年7月8日
【發(fā)明人】杜予州, 陳志騰
【申請(qǐng)人】揚(yáng)州大學(xué)