鞍帶石斑魚神經(jīng)肽b基因、蛋白及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及水產(chǎn)養(yǎng)殖技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及鞍帶石斑魚神經(jīng)肽B基因、蛋白及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]神經(jīng)肽B (Neuropeptide B，NPB)是孤兒G蛋白偶聯(lián)受體GPR 7 (NPBWR1)的內(nèi)源性配體，最初是從牛的下丘腦中分離純化得到。NPB的前體蛋白prepro-NPB包含一個(gè)含有29個(gè)氨基酸的成熟肽，該肽最典型的特征是在N-端的色氨酸殘基通過(guò)翻譯后加工被溴化。除了哺乳動(dòng)物，NPB已經(jīng)在硬骨魚和蟾蜍中被克隆出來(lái)。NPB主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在外周組織中，NPB也分布于哺乳動(dòng)物的腎、性腺、肝和胃等組織。如此廣泛的組織分布模式預(yù)示著NPB在脊椎動(dòng)物中具有多種生物學(xué)功能。然而NPB的生理功能僅在人、大鼠、小鼠等少數(shù)哺乳動(dòng)物及羅非魚等極個(gè)別硬骨魚中有相關(guān)報(bào)道。研究發(fā)現(xiàn)NPB可能參與攝食調(diào)節(jié)，能量代謝平衡，內(nèi)分泌調(diào)節(jié)及痛覺感受等生理活動(dòng)，但有關(guān)NPB在其他脊椎動(dòng)物尤其是在硬骨魚中的研究目前還幾乎處于空白。
[0003]鞍帶石斑魚(Epinephelus lanceolatus)俗稱龍是、龍膽石斑魚、紫石斑魚，在分類學(xué)上隸屬于f盧形目(Perciformes)，飽科(Serranidae )，石斑魚屬(Epinephelus)。鞍帶石斑魚屬暖水性島礁性魚類，是石斑魚屬中體型最大的種類，有“石斑魚之王”之稱，其具有適應(yīng)性強(qiáng)、抗病力強(qiáng)、肉質(zhì)鮮美、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高等優(yōu)點(diǎn)，市場(chǎng)價(jià)格高，銷路好。2004年聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織把石斑魚與金槍魚和黃尾螄列為未來(lái)20年最有發(fā)展前途的三種養(yǎng)殖魚類。近年來(lái)，我國(guó)南方沿海地區(qū)興起了鞍帶石斑魚的養(yǎng)殖熱潮，鞍帶石斑魚也成為日后深水網(wǎng)箱和工廠化養(yǎng)殖的理想品種選擇之一。探討新型神經(jīng)肽NPB在鞍帶石斑魚中的生理功能為鞍帶石斑魚養(yǎng)殖提供理論指導(dǎo)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是為了充分研究鞍帶石斑魚的生殖生長(zhǎng)，提供了鞍帶石斑魚神經(jīng)肽B基因、蛋白及其應(yīng)用。
[0005]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)的:
鞍帶石斑魚神經(jīng)肽B基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。
[0006]鞍帶石斑魚神經(jīng)肽B蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0007]鞍帶石斑魚神經(jīng)肽B的成熟肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0008]本發(fā)明通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)鞍帶石斑魚神經(jīng)肽B基因主要在鞍帶石斑魚中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)，其中在下丘、延髓和脊髓中的表達(dá)量較高；NPB在所檢測(cè)的外周組織中均有表達(dá)，但表達(dá)量都較低。另外，發(fā)現(xiàn)在注射12小時(shí)后，10ng/gBff和100ng/gBW的NPB29能夠顯著促進(jìn)石斑魚orexin mRNA的表達(dá)，當(dāng)分別注射100ng/gBW和1000ng/gBW的NPB29 3小時(shí)后，以及注射1000ng/gBW的NPB29 6小時(shí)候，石斑魚腦區(qū)Leptin B mRNA的表達(dá)均有顯著提高，說(shuō)明Leptin B在石斑魚腦區(qū)參與了攝食和/或脂肪代謝的調(diào)控。
[0009]因此，本發(fā)明要求保護(hù)鞍帶石斑魚神經(jīng)肽B成熟肽在促進(jìn)石斑魚Orexin基因表達(dá)中的應(yīng)用。
[0010]鞍帶石斑魚神經(jīng)肽B成熟肽在提高石斑魚瘦素B基因表達(dá)中的應(yīng)用。
[0011]鞍帶石斑魚神經(jīng)肽B基因在調(diào)控石斑魚攝食和/或脂肪代謝的應(yīng)用。
[0012]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果:
本發(fā)明首次克隆出鞍帶石斑魚神經(jīng)肽B基因，并研究了其在鞍帶石斑魚各組織中的表達(dá)情況，并對(duì)其生理代謝功能進(jìn)行了充分的研究，為開發(fā)以新型神經(jīng)肽B為主要成分的添加劑產(chǎn)品奠定了基礎(chǔ)。
【附圖說(shuō)明】
[0013]圖1-1是NPB中間片段克隆第一輪電泳結(jié)果，Μ為Marker，在1對(duì)應(yīng)的模板中出現(xiàn)預(yù)期片段。
[0014]圖1-2是NPB中間片段克隆第二輪電泳結(jié)果，NC為陰性對(duì)照，Μ為Marker，在1對(duì)應(yīng)的模板中出現(xiàn)預(yù)期片段。
[0015]圖2-1是NPB 3’RACE克隆第一輪電泳結(jié)果，NC為陰性對(duì)照，其中1為所取的腦組織，Μ 為 marker。
[0016]圖2-2是NPB 3’ RACE克隆第二輪電泳結(jié)果，其中1為所取腦組織，Μ為marker。
[0017]圖3-1是NPB 5’ RACE克隆第一輪電泳結(jié)果，其中1為所取腦組織，Μ為Marker。
[0018]圖3-2是NPB 5’RACE克隆第二輪電泳結(jié)果，NC為陰性對(duì)照，其中1為所選取腦組織，Μ 為 Marker。
[0019]圖4-1是NPB 0RF克隆第一輪電泳結(jié)果，其中1為所選取腦組織，Μ為Marker。
[0020]圖4-2是NPB 0RF克隆第二輪電泳結(jié)果，其中1為所選取的腦組織，Μ為Marker。[0021 ] 圖5是NPB mRNA在鞍帶石斑魚不同組織中的表達(dá)狀況。
[0022]圖6是腹腔注射NPB成熟肽(NPB29)對(duì)下丘腦中Orexin基因的表達(dá)調(diào)控作用。
[0023]圖7是腹腔注射NPB成熟肽(NPB29)對(duì)全腦中l(wèi)eptin B基因的表達(dá)調(diào)控作用。
【具體實(shí)施方式】
[0024]下面結(jié)合說(shuō)明書附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作出進(jìn)一步地詳細(xì)闡述，所述實(shí)施例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中所使用的試驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法；所使用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，為可從商業(yè)途徑得到的試劑和材料。
[0025]實(shí)施例1鞍帶石斑魚NPB全長(zhǎng)cDNA的克隆
基因克隆的整體思路:利用NCBI的Blast檢索功能，從本實(shí)驗(yàn)室已完成的鞍帶石斑魚腦組織的轉(zhuǎn)錄組中檢索到NPB的部分cDNA序列，根據(jù)此序列設(shè)計(jì)基因特異引物，進(jìn)行NPBcDNA中間片段克隆；根據(jù)此中間片段，設(shè)計(jì)5’ /3’ -RACE的特異性引物，并結(jié)合5’ /3’ RACE的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而獲得NPB前體的全長(zhǎng)cDNA序列；最后在3'和5'非編碼區(qū)設(shè)計(jì)特異引物，進(jìn)行開放讀碼框0RF的克隆。具體步驟如下:
1、鞍帶石斑魚NPB中間片段克隆:利用Invitrogen公司的M-MLV，把總RNA合成第一鏈cDNA。中間片段PCR擴(kuò)增按照Toyobo公司產(chǎn)品聚合酶blend tap plus所要求的反應(yīng)條件進(jìn)行。第一輪 PCR 反應(yīng)條件:94°C 3min;94 °C 15s，溫度梯度(50 °C，54°C，58°C，62°C)15s，72 °C lmin，30個(gè)循環(huán)；72 °C 5min;4°C，保存。把第一輪的PCR產(chǎn)物按照1:100的比例稀釋后作為模板進(jìn)行第二輪PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為94°C 3min;94 °C 15s，溫度梯度(50。(:，54。(:，58。(:，62。(:)15s，72 °C lmin，35 個(gè)循環(huán)；72 °C 5min;4°C，保存。
[0026]神經(jīng)肽NPB中間片段克隆電泳結(jié)果如圖1-1所示，經(jīng)過(guò)第一輪PCR，在300bp之間出現(xiàn)了預(yù)期條帶，第二輪如圖1-2所示，在200bp到300bp之間出現(xiàn)了預(yù)期條帶，將預(yù)期條帶進(jìn)行回收測(cè)序得到269bp的片段，經(jīng)blast比對(duì)證明為NPB序列。
[0027]2、鞍帶石斑魚NPB 3'RACE和5'RACE:利用設(shè)計(jì)的3'RACE特異引物與通用引物AUAP擴(kuò)增獲得了 NPB 3’末端序列，3'RACE PCR反應(yīng)條件如下:第一輪:94°C 3min;94 °C158，溫度梯度(58°(:，60°(:，62°(:，64°〇158,72°(:11^11，30個(gè)循環(huán)；721€51^11;4°(:保存；把第一輪的PCR產(chǎn)物按照1:100的比例稀釋后作為模板進(jìn)行第二輪PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為:94°C 3min ;94 °C 15s，溫度梯度(58°C，60°C，62°C，64°C ) 15s，72 °C lmin，35 個(gè)循環(huán)；72 °C 5min ;4°C 保存；
利用已設(shè)計(jì)的5’ RACE特異引物與通用引物AUAP和AAP擴(kuò)增獲得NPB 5'末端序列，5'RACE PCR 反應(yīng)條件:第一輪:94°C 3min ;94 °C 15s，溫度梯度(58°C，60°C，62°C，64°C )15s，72 °C lmin，30個(gè)循環(huán)；72 °C 5min;4°C保存；同樣把第一輪的PCR產(chǎn)物按照1:100的比例稀釋后作為模板進(jìn)行第二輪PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為:94°C 3min;94 °C 15s，溫度梯度(58°(:，60°(:，62°(:，64°〇158,72°(:11^11，35個(gè)循環(huán)；721€51^11;4°(:保存；
NPB 3'RACE和5'RACE克隆的第一輪電泳結(jié)果分別如圖2-1和3-1所示，第二輪的電泳結(jié)果分別如圖2-2和3-2所示，獲得長(zhǎng)度分別為349bp和216bp的片段，與NPB中間片段重合部完全相同，經(jīng)blast也確定為NPB的部分序列。
[0028]3、鞍帶石斑魚NPB開放讀碼框(Opening Reading Frame, 0RF )的克隆在5'