檢測乙肝病毒bcp的高敏感性巢式pcr引物及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因檢測領(lǐng)域，具體而言，涉及一種檢測乙肝病毒BCP的高敏感性巢 式PCR引物及方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，乙型肝炎病毒（h印atitisBvirus，HBV)基因組變異的檢測方法是建立在 對HBV基因組全長序列或特定目標(biāo)序列PCR擴增的基礎(chǔ)上。通過PCR擴增可以識別出該病 毒相應(yīng)基因或區(qū)域的缺失等變異。發(fā)明人曾用巢式PCR方法對HBV核心基因包含其基本核 心基因啟動子（Basalcorepromoter,BCP)的區(qū)域（nt1678~1948)進行了擴增。由于 引物設(shè)計以及HBV基因組負(fù)鏈自然缺失區(qū)域的影響，病毒載量較低（<103~105gen〇mes/mL) 的樣本無法檢出。
[0003] 由于HBV基因組的部分雙鏈結(jié)構(gòu)，在其負(fù)鏈5'端存在2nt核苷酸自然缺口。而 BCP則非常靠近HBV基因組負(fù)鏈5'端，PCR擴增要跨過那段不連續(xù)的基因片段，導(dǎo)致傳統(tǒng)的 擴增方法檢出率較低，僅為60 %左右。目前，通過改用病毒的直接重復(fù)序列上的引物P2，使 檢測的敏感性明顯提尚，可達90%左右。然而，該套引物的另一條位于X基因上，該基因包 埋在基因組內(nèi)層、且變異較多，導(dǎo)致PCR擴增結(jié)果仍存在局限性和不確定性。據(jù)統(tǒng)計，按照 目前檢測方法，仍有約10%HBsAg基因陽性標(biāo)本檢測不到其核心基因啟動子目標(biāo)序列。
[0004] HBV的BCP控制前核心基因RNA和前基因組RNA的轉(zhuǎn)錄，它的某些基因位點突變 將能影響這些轉(zhuǎn)錄，有些突變與乙肝病毒的致癌有關(guān)，有些突變可用于預(yù)測肝癌發(fā)生的危 險性。因此，如何擴增BCP成為研究的熱點，其結(jié)果對于評估肝癌發(fā)生的危險性具有重要意 義。
[0005] 有鑒于此，特提出本發(fā)明。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種檢測乙肝病毒BCP的高敏感性巢式PCR方法，采用全 新的設(shè)計理念，設(shè)計特定的引物，使檢出率提高到98%以上，靈敏度明顯增高。
[0007] 為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：
[0008] -種檢測乙肝病毒BCP的高敏感性巢式PCR的引物，由第一對引物和第二對引物 組成；第一對引物：CPFla和CPRlmer ;第二對引物：CPF2與CPR2或CPF2與CPRlmer ;
[0009] 其中，CPFla基因序列如SEQIDNo.1所示，CPRlmer基因序列如SEQIDNo.2所 示，CPF2基因序列如SEQIDNo.3所示，CPR2基因序列如SEQIDNo.4所示。
[0010] 本發(fā)明提供的用于檢測乙肝病毒BCP的巢式PCR的引物，第一對引物中的上游引 物選擇HBV基因組中保守區(qū)域的S基因區(qū)段，引物位置選擇811-834nt位；下游引物主要部 分選擇HBV(-)鏈5'端序列（17-20nt)，并覆蓋GC缺口和3'端4個核苷酸，同時考慮HBV 基因組1811位T/G多態(tài)性，設(shè)計包含此多態(tài)位點的兼并引物作為第一輪PCR反應(yīng)的下游引 物。第二對引物中的上游引物選擇1677 - 1699nt位保守區(qū)域；下游引物選擇1793-1812nt 位保守區(qū)域或使用第一輪PCR的下游引物。這兩對引物具有高特異、高靈敏度和高效的檢 測HBV基本核心基因啟動子相關(guān)序列，其最低檢測HBVDNA模板量可達4拷貝。
[0011] -種檢測乙肝病毒BCP的高敏感性巢式PCR方法，以引物CPFla和CPRlmer對待 檢測DNA進行第一輪PCR，得到第一輪PCR產(chǎn)物；
[0012] 以引物CPF2與CPR2或CPF2與CPRlmer對所述第一輪PCR產(chǎn)物進行第二輪PCR， 得到第二輪PCR產(chǎn)物；
[0013] 對所述第二輪PCR產(chǎn)物進行檢測即可；
[0014] 其中，CPFla基因序列如SEQIDNo. 1所示，CPRlmer基因序列如SEQIDNo. 2所 示，CPF2基因序列如SEQIDNo. 3所示，CPR2基因序列如SEQIDNo. 4所示。
[0015] 本發(fā)明提供的一種檢測乙肝病毒BCP的高敏感性巢式PCR方法，第一輪PCR的 上游引物選擇HBV基因組中保守區(qū)域的S基因區(qū)段，引物位置選擇811-834nt位；下游引 物主要部分選擇HBV(-)鏈5'端序列（17-20nt)，并覆蓋GC缺口和3'端4個核苷酸，同 時考慮HBV基因組1811位T/G多態(tài)性，設(shè)計包含此多態(tài)位點的兼并引物作為第一輪PCR 反應(yīng)的下游引物。第二輪PCR的上游引物選擇1677 - 1699nt位保守區(qū)域；下游引物選擇 1793-1812nt位保守區(qū)域或使用第一輪PCR的下游引物。本發(fā)明是在長期實踐的基礎(chǔ)上， 在HBV基本核心基因啟動子相關(guān)序列的檢測方法的基礎(chǔ)上進行重新設(shè)計引物，逐漸探索出 本發(fā)明的高特異、高靈敏度和高效的檢測方法，其最低檢測HBVDNA模板量可達4拷貝。
[0016] 優(yōu)選地，CPRlmer基因序列中的K為G或者T，所述G與T按個數(shù)比為1:0. 8-1.2 添加到CPRlmer基因序列中。
[0017] 進一步地，所述待檢測DNA是從待檢血清或血衆(zhòng)中提取DNA而得。米用常規(guī)的提 取方法提取DNA即可。如取適量（50~200μ1)待檢血清或血漿，用"消化、酚-氯仿抽提、 乙醇沉淀法"或市售病毒DNA提取試劑盒等方法提取病毒DNA。
[0018] 本發(fā)明提供的一種檢測乙肝病毒BCP的高敏感性巢式PCR方法，最低檢測HBVDNA 模板量可達4拷貝，優(yōu)選地，所述待檢測DNA的數(shù)量級為4拷貝以上。如待檢測DNA的數(shù)量 級可以為4拷貝、7拷貝、15拷貝、25拷貝、55拷貝、100拷貝等等。
[0019] 第一輪PCR的反應(yīng)體系根據(jù)需求進行設(shè)置，其中的成分按常規(guī)的添加量添加即 可。
[0020] 優(yōu)選地，所述第一輪PCR的反應(yīng)體系的體積為10-50μ1，優(yōu)選為20-25μ1。
[0021 ] 進一步地，所述第一輪PCR的反應(yīng)體系的體積為25μ1，所述第一輪PCR的反應(yīng)體 系中含有ExTaq0·625±0·01U、dNTPs各0·4±0·02mM、含20mMMg2+的10XExTaqBuf?er2· 5±0· 1μ1、20ymol/L的引物各0· 5±0· 1μ1和待檢測DNA，雙蒸水補齊至25μ1。
[0022] 經(jīng)多次試驗，采用25μ1的第一輪PCR的反應(yīng)體系，并限定其中各成分的含量，為 第二輪PCR提供穩(wěn)定的模板，使得最終結(jié)果穩(wěn)定。
[0023] 優(yōu)選地，所述第一輪PCR的程序為：94-95°C3-5min;94-95°C30±2s， 68°C90±5s，40-45 個循環(huán)；72°C4-5min。
[0024] 經(jīng)多次試驗，第一輪PCR的程序采用"兩步法"，并優(yōu)化擴增條件，擴增特異性強， 為第二輪PCR提供穩(wěn)定的模板。
[0025] 同樣地，第二輪PCR的反應(yīng)體系根據(jù)需求進行設(shè)置，其中的成分按常規(guī)的添加量 添加即可。
[0026] 優(yōu)選地，所述第二輪PCR的反應(yīng)體系的體積為10-30μ1，優(yōu)選為20-25μ1。
[0027]優(yōu)選地，所述第二輪PCR的反應(yīng)體系的體積為25μ1，所述第二輪PCR的反應(yīng)體系 中含有Ex Taq0· 625±0· 01U、dNTPs各 0· 4±0· 02mM、含 20mMMg2+的lOXEx Taq Buffer 2. 5±0. 1μ1、20ymol/L的引物各 0. 5±0. 1μ1 和第一輪PCR產(chǎn)物 0. 5-1. 5μ1，雙蒸水補 齊至25μ1。
[0028] 經(jīng)多次試驗，采用25 μ 1的第二輪PCR的反應(yīng)體系，并限定其中各成分的含量，最 終得到的條帶清晰，結(jié)果穩(wěn)定。
[0029]優(yōu)選地，所述第二輪PCR的程序為：94-95°C3-5min;94-95°C30±2s， 68°C30±2s，40-45 個循環(huán)；72°C3-5min。
[0030] 經(jīng)多次試驗，第二輪PCR的程序也采用"兩步法"，并優(yōu)化擴增條件，擴增特異性 強，最終擴增產(chǎn)物穩(wěn)定。
[0031] 進一步地，對所述第二輪PCR產(chǎn)物采用毛細(xì)管電泳或瓊脂糖凝膠水平電泳進行檢 測。
[0032]PCR反應(yīng)結(jié)束后，通過毛細(xì)管電泳或瓊脂糖凝膠電泳配合凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。 毛細(xì)管電泳使用QIAxcelAdvanced毛細(xì)管電泳系統(tǒng)（QIAGEN)，其過程按照儀器標(biāo)準(zhǔn)操作 程序進行，選擇100-2. 5kbsizemarker;電泳結(jié)束后使用QIAxcelScreenGel軟件獲取和 分析電泳圖像。
[0033] 第一輪PCR擴增使用CPFla/CPRlmer引物組合，其產(chǎn)物片段大小為988bp;第二輪 PCR擴增分別使用CPF2/CPR2和CPF2/CPRlmer引物組合，其產(chǎn)物片段大小分別為136bp和 155bp〇
[0034] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：
[0035](1)本發(fā)明提供的一種檢測乙肝病毒BCP的高敏感性巢式PCR方法，是在長期實踐 的基礎(chǔ)上，在HBV基本核心基因啟動子相關(guān)序列的檢測方法的基礎(chǔ)上進彳丁重新設(shè)計引物， 逐漸探索出本發(fā)明的高特異、高靈敏度和高效的檢測方法，其最低檢測HBV DNA模板量可達 4拷貝。
[0036](2)本發(fā)明還限定了第一輪PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，同時還限定了第二輪PCR 的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，最終得到的條帶清晰，結(jié)果穩(wěn)定。
[0037] (3)本發(fā)明選用特定的引物，采用巢式PCR，優(yōu)化PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，擴增 HBV核心基因具有高敏感性，其最低檢測HBVDNA模板量可達4拷貝，與其它方法比較無非 特異性擴增出現(xiàn)，顯示高度擴增特異性。
【附圖說明】
[0038] 為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，以下將對實施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。
[0039] 圖1為本發(fā)明實施例中巢式PCR引物組合在HBV基因組中的位置示意圖；
[0040] 圖2為本發(fā)明實施例1中試驗組中的電泳圖像；
[0041] 圖3為本發(fā)明實施例1中對照組中的電泳圖像；
[0042] 圖4為本發(fā)明實施例2中試驗組中的電泳圖像；
[0043] 圖5為本發(fā)明實施例2中對照組中的電泳圖像。
【具體實施方式】
[0044] 下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會 理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體 條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為 可以通過市售獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0045] 本發(fā)明中的巢式PCR引物組合在HBV基因組中的位置示意圖如圖1所示。
[0046] 實施例1和2中涉及的引物序列如下所不：
[0052] 實施例1
[0053] 取100μ1待檢血清或血漿，采用常用的消化、酚-氯仿抽提、乙醇沉淀法等步驟提 取病毒DNA;病毒DNA干燥后溶解在10μ1TE(pH8. 0)中，得到待檢測樣品；共對6個樣本 提取了病毒NDA。
[0054] 各取2μ1待檢測樣品，用MULTISKANGO(Thermo)微量核酸檢測儀測定模板DNA 0D26。值和0D2M/0D2S。比值分別確定模板DNA濃度（yg/ml)和純度。將待檢測樣品適當(dāng)稀 釋后作為模板DNA進行巢式PCR擴增反應(yīng)。
[0055] 按照HBV基因組3. 2KB計算出模板DNA的摩爾數(shù)，并換算成拷貝數(shù)：HBV拷貝數(shù)= DNA濃度（ng/μ1)X50X107(660X6400X6. 02X1023)。
[0056] 6個不同濃度的模板DNA的信息如表1所示。
[0057] 表1測試HBV DNA樣品的濃度
[0058]
[0059] 試驗組：每個模板DNA均采用以下PCR反應(yīng)體系和PCR反應(yīng)程序進行：