傳染性造血器官壞死病毒（ihnv）的rt-lamp檢測引物組、試劑盒及檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的檢測方法，具體涉及一 種傳染性造血器官壞死病毒（IHNV)的RT-LAMP檢測引物組、檢測試劑盒及檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 傳染性造血器官壞死?。↖nfectioushaematopoieticnecrosis，IHN)是0ΙΕ規(guī)定 需要通告的3種彈狀病毒（rhabdovirus)性疾病之一。IHN最初流行于北美西部地區(qū)，主要 存在于溯河產(chǎn)卵的鮭魚群中。上世紀(jì)70年代，傳染性造血器官壞死病毒（IHNV)感染成為了 美國人工養(yǎng)殖的虹鱒魚（Oncorhynchusmykiss)的重要病原。接著IHN隨著污染了病毒的 魚卵傳到了西歐以及東亞的不少國家。虹鱒在這些國家是一種引進品種，IHN對虹鱒養(yǎng)殖造 成了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。同彈狀病毒（Rhabdoviridae)科粒彈狀病毒（Novirhabdovirus)屬 的其他成員相似的是，IHNV為單負(fù)股RNA病毒，病毒基因組由11 000個核苷酸組成，編碼6 個蛋白，病毒粒子呈子彈狀。遺傳進化分析顯示，北美地區(qū)分離到的IHNV毒株的基因變異 程度較低。而在歐洲、日本以及韓國的虹鱒中分離到的IHNV毒株的差異卻較大，這顯示出 病毒在引入上述幾個地區(qū)之后是各自獨立遺傳進化的。IHNV出現(xiàn)的基因變化被認(rèn)為同宿 主特異性和毒力的改變有關(guān)。傳染性造血器官壞死?。↖HNV)最初在造血組織內(nèi)增殖，其后 侵襲到其他內(nèi)臟器官。經(jīng)解剖可觀察到，魚的鰓絲褪色呈蒼白色，顯著貧血，肝、脾、腎也褪 色，貧血。病魚初期呈昏睡狀，游動遲緩，有時沉底；隨水流漂浮在水面上的病魚體色發(fā)黑， 眼球突出，腹部膨大，鰭基充血，不透明，粘液狀管型糞便懸掛于肛門，體側(cè)肌肉組織如背鰭 區(qū)和一些鰭基部的骨胳肌中有"V"形出血斑塊的癥狀。
[0003]培養(yǎng)分離傳染性造血器官壞死病毒一般需要15天以上才能得出結(jié)果，檢測周期 太長，不適應(yīng)口岸快速檢測和大通關(guān)的時代要求。
[0004] 因此，建立一種快速、準(zhǔn)確、高通量且對儀器要求不高的的檢測試劑盒及檢測方法 成為目前急需解決的問題。
[0005]利用恒溫擴增技術(shù)原理研究開發(fā)的IHNV檢測方法與檢測試劑盒能快速、準(zhǔn)確地 檢測傳染性造血器官壞死病（IHNV)，便于在基層水產(chǎn)養(yǎng)殖站受實驗條件限制，無法承受昂 貴的儀器費用環(huán)境下，為魚類的傳染性造血器官壞死病進行診斷、確診提供依據(jù)，以便及時 采取相應(yīng)措施，防止大面積傳播。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的一個目的在于提供一種傳染性造血器官壞死病毒的RT-LAMP檢測引物 組。
[0007]本發(fā)明的另一個目的在于提供一種傳染性造血器官壞死病毒的RT-LAMP檢測試 劑盒。
[0008]本發(fā)明的另一個目的在于提供傳染性造血器官壞死病毒的RT-LAMP檢測方法。
[0009] 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下： 一種傳染性造血器官壞死病毒（IHNV)的RT-LAMP檢測引物組，包括一對外引物、一對 內(nèi)引物和一對環(huán)引物，其核苷酸序列分別如下所示：
[0010] 一種傳染性造血器官壞死病毒（IHNV)的RT-LAMP檢測試劑盒，其包括權(quán)利要求1 所述的檢測引物組。
[0011]一種傳染性造血器官壞死病毒（IHNV)的RT-LAMP檢測試劑盒，包括以下成分：（1) 權(quán)利要求1所述的引物組；（2)逆轉(zhuǎn)錄酶；（3)DNA聚合酶；（4)RT-LAMP反應(yīng)液；（5)陽性 對照和陰性對照。
[0012] 上述檢測試劑盒，其引物組中外引物、內(nèi)引物、環(huán)引物的摩爾比為：1 :8 :4。
[0013] 上述檢測試劑盒，所述DNA聚合酶為DNA聚合酶；所述逆轉(zhuǎn)錄酶為峨轉(zhuǎn)錄 酶。
[0014] 上述檢測試劑盒，所述RT-LAMP反應(yīng)液含有：10mMdNTP、10XThermoPol反應(yīng)緩沖 液、150mMMgS04水溶液，三者的體積比是8 :5 :2。
[0015] 上述檢測試劑盒，所述陽性對照為含有傳染性造血器官壞死病毒（IHNV)囊膜糖蛋 白基因片段的T載體克隆，陰性對照為DEPC水。
[0016] 本發(fā)明的檢測試劑盒中還可以含有顯色劑，所述顯色劑為熒光染料SYBRGreen 1〇
[0017] 利用上述的試劑盒檢測傳染性造血器官壞死病毒（IHNV)的方法，包括如下步驟 (1) 待檢樣品RNA的提取：采用病毒RNA提取試劑盒提取樣品RNA; (2) 恒溫基因擴增反應(yīng)：25μ1反應(yīng)體系含有：IHNV-F3 0. 2μΜ，ΙΗΝν-Β3 0. 2μΜ， IHNV-FIP1·6μΜ，IHNV-BIP1·6μΜ，IHNV-LF0·8μΜ，IHNV-LB0·8μΜ，RT-LAMP反應(yīng)液 12. 5μ1，逆轉(zhuǎn)錄酶1U，DNA聚合酶8U，待檢RNAl~100ng，用DEPC水補齊到25μ1 ;設(shè)置陽 性對照和陰性對照；將配制好的PCR管混勾后離心，并于63~65°C反應(yīng)60~90min，并在 8〇°C持續(xù) 2min; (3) 結(jié)果判斷：通過觀察反應(yīng)管內(nèi)沉淀的濁度變化來判斷擴增結(jié)果。
[0018] 在試劑盒中含有顯色劑的情況下，往反應(yīng)管中加入10XSYBRGreenI0.5μ1，然 后將反應(yīng)管中置于ESE-QuantTubeScanner中，根據(jù)儀器所實時讀取的熒光信號來判斷擴 增結(jié)果。
[0019] 本發(fā)明具有快速高效、操作簡便、高特異性、高靈敏度、鑒定簡便、適合現(xiàn)場檢測等 有益效果： (1) 快速高效：整個擴增只用60~90min即可完成，擴增產(chǎn)量可達(dá)109~10w個拷貝； (2) 操作簡便：不需要復(fù)雜的儀器，不需要特殊試劑，不需要預(yù)先進行雙鏈DNA的變性 等繁瑣步驟，只需要一部恒定溫度儀就能反應(yīng)和檢測，條件比較溫和； (3) 高特異性： 本發(fā)明根據(jù)傳染性造血器官壞死病毒（IHNV)的囊膜糖蛋白基因（g# 6基因，GenBank登錄號為DQ164100. 1)設(shè)計了六條特異性引物，應(yīng)用上述六條引物，擴增靶序列的6個區(qū) 域，6個區(qū)域中任何區(qū)域與引物不匹配均不能進行核酸擴增，故其特異性極高，且非常穩(wěn)定， 形成引物二聚體概率低，保證了反應(yīng)的順利進行； (4) 高靈敏度：最低檢測極限可達(dá)到3. 6ng/反應(yīng)； (5) 鑒定簡便：可通過觀察加入SYBRGreenI顏色變化或者是否存在焦磷酸鎂沉淀來 判斷擴增與否，無需電泳等其他任何分析步驟，適合現(xiàn)場檢測。
【附圖說明】
[0020] 圖1-3是實施例4的檢測結(jié)果，圖1:(1、2:無RNase水對照；3、4:IHNVRNA;5、 6:SVCVRNA;7、8:VHSVRNA);圖 2:(1、2:IHNVRNA;3、4:HRVRNA;5、6:PFRVRNA;7、8: 無RNase水對照）；圖 3 : (1、2 :無RNase水對照；3、4:IHNVRNA;5、6:IPNVRNA) 圖4是實施例5的檢測結(jié)果圖（IHNVRNA，1 :10°倍稀釋；2 :10 1倍稀釋；3 :10 2倍稀釋； 4 :103倍稀釋；5 :10 4倍稀釋；6 :10 5倍稀釋；7 :10 6倍稀釋；8 :DEPC水對照)。
【具體實施方式】
[0021] 以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但并不局限于此。
[0022] 上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
[0023] 實施例1傳染性造血器官壞死病毒RT-LAMP檢測試劑盒的建立 傳染性造血器官壞死病毒的RT-LAMP檢測試劑盒，包括RT-LAMP引物組、RT-LAMP反應(yīng) 液、feiDNA聚合酶、轉(zhuǎn)錄酶、陽性對照和陰性對照。
[0024] (l)RT-LAMP引物設(shè)計：以傳染性造血器官壞死病毒（IHNV)的囊膜糖蛋白基因 (貧#GS因，GenBank登錄號為DQ164100. 1)為革巴基因，利用在線設(shè)計軟件PrimerExplorer version4(http://primerexplore;r·jp/e)進行LAMP引物的設(shè)計。引物序列見表 1。
[0025] 表1引物序列表
(2) RT-LAMP反應(yīng)液：含有l(wèi)OmM dNTP、10XThermoPol反應(yīng)緩沖液、150mM MgS04水溶 液，三者的體積比是8 :5 :2。
[0026] (3)陽性對照為含有傳染性造血器官壞死病毒（IHNV)囊膜糖蛋白基因片段的T載 體克隆，其制備方法為：以分離鑒定的傳染性造血器官壞死病毒為模板，利用表1中的外引 物（SEQIDN0:1和SEQIDN0:2)對IHNVRNA進行反轉(zhuǎn)錄，得到含靶基因序列的cDNA，后 再用外引物SEQIDN0:l和SEQIDN0:2)擴增，所得基因片段長度為297bp，序列如SEQID N0:7所示，回收該擴增片段，利用常規(guī)方法連接到T載體中，即為陽性對照。
[0027] (4)陰性對照為DEPC水。
[0028] 實施例2使用濁度儀建立傳染性造血器