一種快速鑒定腌漬綿蜇種屬的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種鑒定市售騰潰海蜜種屬的方法，更具體地說，設(shè)及一種騰潰綿蜜 種屬的快速鑒定方法。
【背景技術(shù)】 陽00引綿蜜（MiopilemaesculentumKishinouye)是我國北方重要的養(yǎng)殖海蜜品種，在 迂東半島附近的海蜜主要分為綿蜜、沙蜜（Stomolo地USmeleagris)。沙蜜屬低檔產(chǎn)品， 而綿蜜是海蜜的精品。通常，兩種海蜜的市售價為：沙蜜3~5角/斤，綿蜜8~10元/ 斤。關(guān)于綿蜜和沙海蜜的鑒別目前主要集中在形態(tài)學(xué)方面，但經(jīng)過加工后，從形態(tài)學(xué)來說已 不適宜于產(chǎn)品的鑒別，所W對消費者而言，也很難辨別品種，市場上W次充好的現(xiàn)象也很普 遍，尋找一種有效的方法解決騰潰海蜜產(chǎn)品種屬的鑒別問題，極為必要。
[0003] 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFL巧是在PCR的基礎(chǔ)上，經(jīng)過酶 切和瓊脂糖凝膠電泳，得到特異性的酶切條帶，從而達(dá)到鑒別基因型的目的。據(jù)查閱文獻(xiàn)， 采用PCR-RFLP的方法可成功對長嘴魚肉、海參、經(jīng)魚、鳳尾魚及金槍魚進(jìn)行鑒別，證實了此 方法的靈敏、快速、有效性。但至今為止尚未有人將此法應(yīng)用于騰潰海蜜種屬的鑒定研究 中。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于為騰潰綿蜜產(chǎn)品提供一個快速有效的鑒定種屬的方法，為消費 者提供權(quán)利保障，其中鑒定的方法基于PCR-RFLP技術(shù)，即限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈 反應(yīng)技術(shù)，本發(fā)明方法簡單快速有效，可W直接用于市售騰潰海蜜產(chǎn)品的鑒定。 陽0化]本發(fā)明所述一種快速鑒定騰潰綿蜜的方法，其特征在于，包括如下步驟：
[0006] S1、將騰潰海蜜脫鹽處理，備存；
[0007] S2、采用DNA提取試劑盒提取步驟S1備存的海蜜組織的基因組DNA;
[0008] S3、將步驟S2得到的基因組DNA，采用通用引物進(jìn)行PCR擴增，得到的擴增產(chǎn) 物-20°C儲存；
[0009] S4、將步驟S3得到的擴增產(chǎn)物采用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切處理，得到的酶切產(chǎn)物 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分離，成像檢測，并將成像結(jié)果與已知綿蜜酶切產(chǎn)物的成像進(jìn)行比對， 進(jìn)而實現(xiàn)快速鑒定騰潰綿蜜種屬。
[0010] 優(yōu)選方式下，本發(fā)明方法的具體步驟為： 1] S1、將騰潰海蜜進(jìn)行脫鹽處理，6~1化換一次水，共換水3~8次，脫水后，將得到 的海蜜膽存于終濃度為60~80v/v%乙醇溶液中，備存；
[0012] S2、取步驟S1備存的海蜜組織100~200mg，剪碎，5000~10000巧m離屯、5~ 20min，取離屯、沉淀用無塵紙吸盡水分后，采用DNA提取試劑盒提取海蜜基因組DNA;
[0013] S3、將步驟S2得到的基因組DNA采用16SrRNA基因通用引物進(jìn)行PCR擴增，產(chǎn)物 于-20°C儲存；
[0014]S4、步驟S3得到的PCR擴增產(chǎn)物分別采用化ndIII、化aI、DraI和化οI內(nèi)切 酶進(jìn)行酶切處理，將得到的酶切產(chǎn)物用3w/v%瓊脂糖凝膠電泳分離，成像檢測，并將成像結(jié) 果與已知綿蜜酶切產(chǎn)物的成像進(jìn)行比對，進(jìn)而實現(xiàn)快速鑒定騰潰綿蜜種屬。
[0015] 步驟S1所述騰潰海蜜脫鹽處理方式優(yōu)選為1化換一次水，換4次；所述乙醇溶液 終濃度優(yōu)選為70v/v%。
[0016] 步驟S2所述海蜜組織提取量優(yōu)選為150mg。
[0017] 步驟S2所述DM提取試劑盒優(yōu)選為深加工食品DM提取試劑盒；例如：天根生化 科技（北京）有限公司"深加工食品DNA提取試劑盒（非離屯、柱型）"。該類試劑盒采用獨 特的緩沖液系統(tǒng)，使用安全快捷方便，可最大限度去除食品中的蛋白、脂肪及其他有機化合 物等，獲得的DNA純度高。 陽01引步驟S3所述16SrRNA基因通用引物優(yōu)選為16SF和16SR引物。
[0019] 16SF和16SR引物序列為：
[0020] 16SF :5' -TCGACTGTTTACCAAAAACATAGC-3'
[0021] 16SR: 5' -ACGGAATGAACTCAAATCATGTAAG-3'
[0022] 上述通用引物序列來源于王建艷等在2013年3月發(fā)表在《應(yīng)用生態(tài)學(xué)報》第24 卷第3期的《基于mt-16SrDNA和mt-COI基因的海月水母分子生物學(xué)鑒定方法和檢測技 術(shù)》文獻(xiàn)。 陽02引步驟S3所述PCR擴增反應(yīng)體系中每25 μ 1反應(yīng)體系包括：
[0024] lOXExTaq Buffer 2. 5 μ 1，dNTP 2 μ 1，ExTaq 0. 125 μ 1，16SF 0. 25 μ 1，16SR 0. 25μ1，模板DNA 0. 5μ1，滅菌水19. 375 μ1 ; 陽0巧]反應(yīng)條件為：
[0026] 94°C3min起始變性，94°C80s變性，60°C80s退火，72°C80s延伸，循環(huán) 30 次； 72°ClOmin進(jìn)行最終延伸。
[0027] 步驟S4所述酶切處理，每30 μ 1反應(yīng)體系中包含4 μ 1步驟S3得到的PCR擴增產(chǎn) 物，2 μ 1 10X酶切緩沖液，1 μ 1化ndIII、化aI、化aI或化0I中的一種限制性內(nèi)切 酶，滅菌水余量；
[0028] 反應(yīng)條件為：37 °C反應(yīng)比。 陽029] 各類限制性內(nèi)切酶所對應(yīng)的酶切緩沖液如下：
[0030]
[0031] 本發(fā)明的技術(shù)創(chuàng)新在于：
[0032] 1、本發(fā)明擴展了PCR-RFLP技術(shù)的應(yīng)用范圍，可成功用于騰潰綿蜜制品種屬的鑒 定，從而明確產(chǎn)品的品質(zhì)，為消費者提供有力保障。
[0033] 2、本發(fā)明檢測過程綠色安全，直接應(yīng)用試劑盒提取DNA準(zhǔn)確性高。同時PCR-RFLP 過程不需要復(fù)雜的設(shè)備，費時少，7h內(nèi)即可完成檢測。
[0034] 3、本發(fā)明所需樣品量少，靈敏度高。采用海蜜屬16SRNA基因作為檢測目標(biāo)分子， 具有特異性強，準(zhǔn)確性高的特點，能夠?qū)κ惺垓v潰海蜜類產(chǎn)品進(jìn)行快速有效的鑒定。
【附圖說明】
[0035] 圖1為騰潰綿蜜16S rRNA基因擴增結(jié)果；
[0036] 圖2為綿蜜、沙蜜16SrRNA基因序列對比圖譜；
[0037] 圖3為綿蜜、沙蜜16S rRNA基因序列限制性內(nèi)切酶酶切位點圖譜； 陽03引 圖4為新鮮綿蜜、沙蜜16SrRNA基因PCR-RFLP結(jié)果；
[0039]圖5為實施例1騰潰綿蜜16S rRNA基因PCR-RFLP結(jié)果； W40] 圖6為市售四種騰潰海蜜產(chǎn)品采用化ndIII限制性內(nèi)切酶酶進(jìn)行16SrRNA基因的 PCR-RFLP結(jié)果；
[0041] 圖7為市售四種騰潰海蜜產(chǎn)品采用化aI限制性內(nèi)切酶酶進(jìn)行16SrRNA基因的 PCR-RFLP結(jié)果； 陽Ο創(chuàng)圖8為市售四種騰潰海蜜產(chǎn)品采用化οI限制性內(nèi)切酶酶進(jìn)行16SrRNA基因的PCR-RFLP結(jié)果； 陽0創(chuàng)圖9為市售四種騰潰海蜜產(chǎn)品采用化aI限制性內(nèi)切酶酶進(jìn)行16SrRNA基因的PCR-RFLP結(jié)果。
【具體實施方式】 W44] 本發(fā)明采用試劑盒提取騰潰綿蜜的基因組DNA，W16SrRNA基因為檢測目標(biāo)，通 過PCR-RELP技術(shù)，從而達(dá)到鑒別基因型的目的。限制性內(nèi)切酶的選擇W新鮮綿蜜和沙蜜 16SrRNA基因的序列對比和酶切位點分析為基礎(chǔ)。本發(fā)明具有方法簡便，操作簡單，效率高 的特點，提取方法條件方便不費時，能快速檢測市售騰潰綿蜜的種屬，為消費者的利益提供 保障，為騰潰海蜜產(chǎn)品的鑒別提供了一個快速有效的方法。
[0045] 經(jīng)檢測，騰潰綿蜜16SrRNA基因擴增理論大小為65化P，檢測結(jié)果如圖1所示。其 中，1代表脫鹽后70% (v/v終濃度）乙醇膽存，2代表脫鹽后0. 1