一種豬脾轉(zhuǎn)移因子制備方法及應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及獸用生物制品技術領域，具體設及一種豬脾轉(zhuǎn)移因子制備方法及應 用。
【背景技術】
[0002] 轉(zhuǎn)移因子（Transferhctor，簡稱町')是淋己細胞釋放的一種能夠轉(zhuǎn)移致敏信息 的物質(zhì)，不含蛋白質(zhì)，是小分子多膚，具有傳遞免疫信息、調(diào)節(jié)免疫功能、增強機體免疫功能 等作用。TF無熱原，不被膜酶所破壞，TF的活性對熱不穩(wěn)定，在冷凍條件下穩(wěn)定，它能夠特 異地將供體的細胞免疫信息轉(zhuǎn)移給受體，從而增強受體的免疫功能，目前其在國外已成為 一種應用廣泛的增強免疫制劑。
[0003] 1、制備工藝
[0004] 目前制備轉(zhuǎn)移因子的現(xiàn)有技術主要采用透析法化aurence法）或過濾法。朱天新 等先將組織絞碎，再凍融破碎，抑調(diào)節(jié)-超濾法適合于轉(zhuǎn)移因子的大規(guī)模生產(chǎn)；顧平和陳德 有使用絮凝劑和助濾劑作用微濾、超濾，工藝操作簡單，生產(chǎn)周期短，操作費用低，產(chǎn)量高， 可W大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的新工藝。
[00化]"口服轉(zhuǎn)移因子"（專利【申請?zhí)枴?3121184.0)將新鮮健康豬脾臟勻漿、凍融、透 析、過濾除菌，制成轉(zhuǎn)移因子原液；"一種抗小碟攝病毒轉(zhuǎn)移因子的制備方法"（專利申請 號：201210136306.0)將免疫后的豬脾臟進行清洗、勻漿、凍融破碎，經(jīng)過濾、超濾后獲得原 液；"一種豬脾轉(zhuǎn)移因子注射液的生產(chǎn)方法"（專利【申請?zhí)枴?01110126248.9)使用勻漿、 低溫超聲破碎、離屯、、超濾工藝提取轉(zhuǎn)移因子；"一種抗雞新城疫病毒轉(zhuǎn)移因子的制備方 法"（專利【申請?zhí)枴?00810053541.5)用組織搗碎機、凍融、離屯、、超濾法制備工藝；"抗流 感病毒轉(zhuǎn)移因子的制備"（專利【申請?zhí)枴?00610035059.訝用組織搗碎機搗碎、低溫凍融、 離屯、、中空纖維管超過濾的制備工藝；"靜脈注射用轉(zhuǎn)移因子制備工藝流程"（專利申請 號：200410046404. 0)使用凍融法和全濾法生產(chǎn)注射液，下游亦使用超濾進行截留篩分。
[0006] 綜上可見，轉(zhuǎn)移因子制備基本包括絞碎、勻漿、凍融破碎、離屯、、超濾等步驟，由于 TF的活性對熱不穩(wěn)定，因此，為了在最大限度保證產(chǎn)物活性，提高產(chǎn)品品質(zhì)，需要一種低溫 制備轉(zhuǎn)移因子的方法。
[0007] 2、轉(zhuǎn)移因子獸醫(yī)臨床應用
[0008] 劉雁等應用豬脾轉(zhuǎn)移因子注射液聯(lián)合豬攝免疫，結(jié)果表明，豬攝免疫配合使用轉(zhuǎn) 移因子，可W改善豬機體免疫機能，顯著提高抗體滴度；高迎春等研究顯示注射TF后，接種 減蛋綜合征滅活油佐劑疫苗可W顯著提高雞體的免疫水平；潘天彪試驗結(jié)果指出，使用豬 用轉(zhuǎn)移因子對仔豬體重的增加很明顯；黃建文等研究表明試驗組免疫后產(chǎn)生保護力時間提 前，保護期延長，淋己細胞轉(zhuǎn)化率提高；李富桂等研究指出TF對IBD具有良好的療效。
[0009] 大量的試驗研究證明，TF對疫苗均具有協(xié)同作用，能顯著提高機體細胞免疫水平， 縮短機體免疫應答期，促進抗體的產(chǎn)生，并延長抗體高峰期，使之維持更長的時間。TF越來 越多用于動物臨床應用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明旨在針對現(xiàn)有技術的技術缺陷，提供一種豬脾轉(zhuǎn)移因子制備方法及應用， W解決現(xiàn)有技術方法所制備的轉(zhuǎn)移因子效價較低。
[0011] 本發(fā)明要解決的另一技術問題是現(xiàn)有技術方法因操作過程溫度較高導致所制備 轉(zhuǎn)移因子效價較低。
[0012] 本發(fā)明要解決的再一技術問題是提升疫苗的免疫保護效果。
[0013] 為實現(xiàn)W上技術目的，本發(fā)明采用W下技術方案：
[0014] 一種豬脾轉(zhuǎn)移因子制備方法，包括W下步驟：
[0015] 1)取豬脾臟絞碎得到勻漿液；
[0016] 2)將步驟1)所述勻漿液于-25~-15°C速凍，而后于35~40°C速融，如此反復凍 融6~8次； 陽017] 3)將步驟2)凍融后的勻漿在10~15°C條件下8000~1000化/min離屯、，取上清 液；
[0018] 4)將步驟3)所述上清液超濾，取濾液即為豬脾轉(zhuǎn)移因子溶液。
[0019] 作為優(yōu)選，所述豬脾臟是去除了筋膜、油脂的臟器實體。
[0020] 作為優(yōu)選，步驟1)中所述脾臟先用生理鹽水清洗，再用注射水清洗，而后再絞碎 得到勻漿液；在此基礎上進一步優(yōu)選的，所述注射水的溫度是5~1(TC。
[0021] 作為優(yōu)選，步驟1)中所述的絞碎，是先利用絞肉機粗絞1遍并加入脾臟總質(zhì)量 0. 5~1倍的注射水混勻，而后再利用膠體磨精絞2~3遍，并加入脾臟總質(zhì)量0. 5~1倍的 注射水混勻；在此基礎上進一步優(yōu)選的，所述的絞肉機粗絞，絞肉機孔板的孔徑是3~5mm。
[0022] 作為優(yōu)選，步驟2)中凍融的總時間小于化。
[0023] 作為優(yōu)選，步驟4)所述的超濾，所用膜組件是內(nèi)壓式膜組件。
[0024] 作為優(yōu)選，步驟4)所述的超濾，所用膜組件材質(zhì)是PVDF。
[0025] 作為優(yōu)選，步驟4)所述的超濾，其截留分子量是5KDa。
[00%] 本發(fā)明同時提供了上述轉(zhuǎn)移因子用于提高疫苗效價的應用；作為優(yōu)選，其應用方 式是接種疫苗后體內(nèi)注射轉(zhuǎn)移因子。
[0027] 本發(fā)明制備的轉(zhuǎn)移因子系一種W健康豬脾臟為原料，經(jīng)破碎、離屯、、超濾后制備的 含有多膚、核糖等活性物質(zhì)的制劑，用于提高動物機體免疫力，提高免疫效果。其應用動物 包括家禽（雞、鴨、碟等）、家畜（豬、牛、羊等），W及寵物（犬、貓等）。
[0028] 豬脾臟呈扁長條形，色澤均勻一致，無充血、結(jié)節(jié)、出血點及腫脹等，具有一定的彈 性和硬度，被膜呈灰白色，淺褐色或微灰紅色，切面呈深紅色，實質(zhì)柔軟，較脆，無腐敗變質(zhì)， 有固有的氣味。本發(fā)明中，可W從屠宰場收集健康豬脾臟，剪去筋膜和大塊油脂，用注射水 配制的0. 9%生理鹽水清洗2~3遍，注射水沖洗1遍，1~化g/份包裝后于-15°c凍存，用 于后續(xù)制備。
[0029] W本發(fā)明方法制備得到轉(zhuǎn)移因子溶液，可W作為原料藥進一步制備生物制品，例 如可W經(jīng)檢測合格進行配藥、無菌分裝、檢驗、包裝、入庫等流程，檢驗合格并批準后，上市 銷售。劑型優(yōu)選為注射液。
[0030] 配合疫苗使用或單獨使用時，可0. 1~2. 0ml的用量注射轉(zhuǎn)移因子注射液 (規(guī)格：多膚> 1. 5mg/ml;核糖> 50μg/ml)，提高疫苗滴度和動物生長性能。
[0031] 本發(fā)明結(jié)合使用冷凍破碎、凍融破碎及離屯、工藝進行轉(zhuǎn)移因子生產(chǎn)，在保證產(chǎn)量 的基礎上降低了生產(chǎn)溫度，能更有效的保證轉(zhuǎn)移因子活性。
[0032] 此外，本發(fā)明方法用健康豬脾臟為原料，經(jīng)去脂肪、細胞破碎、離屯、、超濾制備的轉(zhuǎn) 移因子溶液，不含蛋白質(zhì)，是小分子多膚，無熱原，活性不被膜酶所破壞，無毒性反應，是一 種廣泛應用的免疫調(diào)節(jié)劑，可提高疫苗效價，亦可用于增強動物機體免疫功能，提高生產(chǎn)性 能。當聯(lián)合疫苗使用，能顯著增強動物機體免疫力，同時提高疫苗效價水平，縮短機體免疫 應答期，降低養(yǎng)殖中疾病發(fā)生風險。
【具體實施方式】
[0033]W下將對本發(fā)明的【具體實施方式】進行詳細描述。為了避免過多不必要的細節(jié)，在 W下實施例中對屬于公知的結(jié)構(gòu)或功能將不進行詳細描述。
[0034] W下實施例中所使用的近似性語言可用于定量表述，表明在不改變基本功能的情 況下可允許數(shù)量有一定的變動。因此，用"大約"、"左右"等語言所修正的數(shù)值不限于該準 確數(shù)值本身。在一些實施例中，"大約"表示允許其修正的數(shù)值在正負百分之十（10%)的 范圍內(nèi)變化，比如，"大約100"表示的可W是90到110之間的任何數(shù)值。此外，在"大約第 一數(shù)值到第二數(shù)值"的表述中，大約同時修正第一和第二數(shù)值兩個數(shù)值。在某些情況下，近 似性語言可能與測量儀器的精度有關。
[0035]除有定義外，W下實施例中所用的技術和科學術語具有與本發(fā)明所屬領域技術人 員普遍理解的相同含義。
[0036]W下實施例中所用的試驗試劑耗材，如無特殊說明，均為常規(guī)生化試劑；所述實驗 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；W下實施例中的定量試驗，均設置Ξ次重復實驗，結(jié)果 取平均值；W下實施例中的％，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。
[0037] 實施例1(轉(zhuǎn)移因子注射液制備）
[0038] (1)領料根據(jù)生產(chǎn)計劃領取凍存原料50kg，進入生產(chǎn)區(qū)除去外包裝；
[0039] (2)粗絞按凍肉絞肉機操作規(guī)程，凍肉絞肉機粗絞，使用3mm篩，出料加入0. 5倍 8°C注射水混合，攬拌成流體狀；
[0040] (3)精絞按膠體磨操作規(guī)程，膠體磨研磨粗絞液2~3遍，加入1倍8°C注射水，混 勻，收獲精絞液123kg;
[0041] (4)凍融精絞液W-20°c- 37°C反復凍融6次；
[0042] (5)離屯、凍融料液在10°C下，經(jīng)1000化/min離屯、，去除沉淀，收獲上清，共83kg;
[0043] (6)超濾離屯、上清經(jīng)超濾裝置（截留分子量5邸a)超濾，收集透過液，共79kg，即 為半成品；
[0044] (7)半成品檢驗留樣檢測，剩余無菌過濾至4°C無菌罐，暫存；
[0045] (8)配藥半成品檢驗合格，多膚含量為3. 8mg/ml，核糖含量為116. 3μg/ml;按成 品含量要求：多膚含量> 1. 5mg/ml，核糖含量> 50. 0μg/ml，半成品用注射水稀釋2. 3倍， 抑值調(diào)節(jié)約為7. 0,共配制181.化g;
[0046] (9)無菌灌裝規(guī)格10ml/瓶（多膚含量> 1. 5mg/ml，核糖含量> 50. 0μg/ml)，共 生產(chǎn)18130瓶；
[0047] (10)成品檢驗成品抽檢，合格放行。 W48] 實施例2 (轉(zhuǎn)移因子注射液制備）
[0049] (1)領料根據(jù)生產(chǎn)計劃領取凍存原料60kg，進入生產(chǎn)區(qū)除去外包裝；
[0050] (2)粗絞按凍肉絞肉機操作規(guī)程，凍肉絞肉機粗絞，使用5mm篩，出料加入0. 8倍 10°c注射水混合，攬拌成流體狀；
[0051] (3)精絞按膠體磨操作規(guī)程，膠體磨研磨粗絞液2~3遍，加入0. 7倍10°C注射水， 混勻，收獲精絞液14化g;
[0052] (4)凍融精絞液W-20°C- 37°C反復凍融8次；
[0053] (5