一種轉移因子及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及免疫促進技術領域,具體涉及一種轉移因子及其應用。
【背景技術】
[0002] 轉移因子(Transferfactor,簡稱TF)是淋巴細胞釋放的一種能夠轉移致敏信息 的物質,動物TF分子量一般在3000~15000Da;不含蛋白質,是小分子多肽,含6種以上氨 基酸;不同動物和不同抗原特異性TF的分子量、肽分子大小和氨基酸種類略有差別;TF無 熱原,其活性不被胰酶所破壞,但對熱不穩(wěn)定,在冷凍條件下穩(wěn)定。它能夠特異地將供體的 細胞免疫信息轉移給受體,從而增強受體的免疫功能,目前在國外已成為一種應用廣泛的 增強免疫制劑。
[0003] 除了在人類醫(yī)學中得到廣泛應用之外,近年來轉移因子在獸醫(yī)、尤其是在增強畜 禽疫苗免疫效果方面也表現(xiàn)出了突出的功效。例如,有研究顯示注射TF后,接種減蛋綜合 征滅活油佐劑疫苗可以顯著提高雞體的免疫水平;另有研究者通過實驗發(fā)現(xiàn)口服轉移因子 可以提高雛雞外周血液ANAE+T淋巴細胞百分率;還有研究者將TF加入到狂犬病疫苗中發(fā) 現(xiàn),加入TF后抗體效價高且抗體產(chǎn)生時間提前;還有研究表明試驗組免疫后產(chǎn)生保護力時 間提前,保護期延長,淋巴細胞轉化率提高;還有研究指出TF對IBD具有良好的療效。綜上 所述,大量的試驗研究證明,TF對疫苗均具有協(xié)同作用,能顯著提高機體細胞免疫水平,縮 短機體免疫應答期,促進抗體的產(chǎn)生,并延長抗體高峰期,使之維持更長的時間。TF越來越 多用于動物臨床應用。
[0004] 現(xiàn)有技術中,轉移因子的制備方法主要為透析法(Laurence法)和過濾法。其中 透析法是指對動物脾臟勻漿的上清液進行若干次透析,實現(xiàn)對轉移因子的分離純化,此法 操作簡單,但生產(chǎn)周期長,操作費用高,難以進行工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn);而過濾法是先對脾臟 組織進行破碎勻漿,再離心取上清液進行過濾,實現(xiàn)對轉移因子的分離純化,此方法的破碎 步驟普遍分為組織初步破碎和凍融破碎,其中凍融破碎步驟耗費時間較長,而初步破碎由 于破碎設備的限制常存在細胞破碎不完全的現(xiàn)象。因此,為了最大限度保持產(chǎn)物活性、提高 得率同時適應規(guī)?;a(chǎn)需求,有必要開發(fā)一種周期更短、得率更高的轉移因子制備方法。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 本發(fā)明旨在針對現(xiàn)有技術的技術缺陷,提供一種以方法來表征的轉移因子,以解 決現(xiàn)有技術的轉移因子制備方法產(chǎn)物收率較低的技術問題。
[0006] 本發(fā)明解決的另一技術問題是避免因制備工藝所導致的轉移因子活性降低。
[0007] 本發(fā)明解決的再一技術問題是轉移因子制備周期過長。
[0008] 本發(fā)明解決的又一技術問題是轉移因子制備成本過高。
[0009] 本發(fā)明解決的又一技術問題是提升轉移因子對畜禽的疫苗免疫促進效果。
[0010] 本發(fā)明解決的又一技術問題完善轉移因子在提升禽畜免疫力方面的應用。
[0011] 為實現(xiàn)以上技術目的,本發(fā)明采用以下技術方案:
[0012] -種轉移因子,是由以下方法制備的:
[0013] 1)取動物脾臟,絞碎,得到脾臟勻漿;
[0014] 2)取步驟1)所述脾臟勻漿固液分離,取上清;
[0015] 3)取步驟2)所述上清液均質破碎,收集均質液;
[0016] 4)取步驟3)所述的均質液固液分離,取上清;
[0017] 5)取步驟4)所述的上清液超濾,收集透過液。
[0018] 優(yōu)選的,步驟1)所述的絞碎,是先利用肉類粉碎裝置粉碎,而后再利用膠體磨研 磨;在此基礎上進一步優(yōu)選的:先利用肉類粉碎裝置粉碎1遍而后再利用膠體磨研磨2~3 遍;在此基礎上進一步優(yōu)選的:利用肉類粉碎裝置粉碎后,加入脾臟原料重量0. 2~0. 6倍 的純化水混勻,而后再利用膠體磨研磨;在此基礎上進一步優(yōu)選的:利用膠體磨研磨后,加 入脾臟原料重量0. 9~1. 3倍的的純化水混勻,得到脾臟勻漿。
[0019] 優(yōu)選的,所述肉類粉碎裝置的篩目尺寸為2~4mm,更優(yōu)的是3mm。
[0020] 優(yōu)選的,所述純化水的溫度是5~8°C,更優(yōu)的是6°C。
[0021] 優(yōu)選的,步驟2)所述的固液分離是利用三足離心機離心,所述三足離心機的截留 篩為40~60目,更優(yōu)的是50目;在此基礎上進一步優(yōu)選的,離心轉速為600~1000r/min, 更優(yōu)的轉速是800r/min。
[0022] 優(yōu)選的,步驟3)所述的均質破碎,其執(zhí)行壓力為65~75MPa,更優(yōu)的是70MPa。
[0023] 優(yōu)選的,步驟3)均質破碎過程中,物料溫度不高于48°C。
[0024] 優(yōu)選的,步驟4)所述的固液分離,是在2~6°C溫度下完成的,更優(yōu)的是4°C。
[0025] 優(yōu)選的,步驟4)所述的固液分離是以4500~5500r/min的轉速離心8~12min, 更優(yōu)的是:以5000r/min的轉速離心lOmin。
[0026] 優(yōu)選的,步驟4)用于超濾的膜組件是內(nèi)壓式膜組件,材質為聚醚砜,截留分子量 為5~7KDa,更優(yōu)的為6KDa。
[0027] 優(yōu)選的,還包括步驟6),所述步驟6)的技術特征為:取步驟5)所述透過液作為轉 移因子原液,經(jīng)檢測合格進行配藥、無菌分裝、檢驗、包裝,檢驗合格并批準后,可上市銷售。
[0028] 此外,本發(fā)明還提供了所述轉移因子作為動物疫苗免疫促進劑的應用,該應用 具體為:每天口服〇. 5~ImL的轉移因子,持續(xù)3~5d,所述轉移因子中多肽含量不低于 I.Omg/ml、核糖含量不低于30yg/ml。
[0029] 本發(fā)明結合使用冷凍破碎和高壓破碎的工藝進行轉移因子生產(chǎn),降低生產(chǎn)溫度, 能更有效的保持轉移因子活性;同時,由于無需凍融步驟,因此半成品生產(chǎn)周期縮短為1 天,與凍融法(2天)比較,縮短了一半生產(chǎn)周期;與透析法(4天)比較,縮短更長生產(chǎn)周 期;此外,本發(fā)明方法顯著提升了產(chǎn)率,傳統(tǒng)凍融和透析方法生產(chǎn)的轉移因子原液,每Ikg 脾臟生產(chǎn)含2.Omg/ml的原液2500ml,而本發(fā)明每Ikg脾臟生產(chǎn)含量約為6.Omg/ml的原液 1400ml,折合產(chǎn)量增加68% ;
[0030] 本發(fā)明以健康豬脾臟為原料,經(jīng)去脂肪、細胞破碎、微濾、超濾制備的轉移因子溶 液,不含蛋白質,屬小分子多肽,無熱原,活性不被胰酶所破壞,無毒性反應,是一種廣泛應 用的免疫調節(jié)劑,用于增強動物機體免疫功能。利用本發(fā)明制備的轉移因子能夠對畜禽起 到顯著的免疫促進作用,有助于提升疫苗效價,延長抗體持續(xù)期,增強機體免疫功能,提高 治療率。
【具體實施方式】
[0031] 以下將對本發(fā)明的【具體實施方式】進行詳細描述。為了避免過多不必要的細節(jié),在 以下實施例中對屬于公知的結構或功能將不進行詳細描述。
[0032] 以下實施例中所使用的近似性語言可用于定量表述,表明在不改變基本功能的情 況下可允許數(shù)量有一定的變動。因此,用"大約"、"左右"等語言所修正的數(shù)值不限于該準 確數(shù)值本身。在一些實施例中,"大約"表示允許其修正的數(shù)值在正負百分之十(10%)的 范圍內(nèi)變化,比如,"大約1〇〇"表示的可以是90到110之間的任何數(shù)值。此外,在"大約第 一數(shù)值到第二數(shù)值"的表述中,大約同時修正第一和第二數(shù)值兩個數(shù)值。在某些情況下,近 似性語言可能與測量儀器的精度有關。
[0033] 除有定義外,以下實施例中所用的技術和科學術語具有與本發(fā)明所屬領域技術人 員普遍理解的相同含義。
[0034] 實施例1
[0035] -、轉移因子口服液制備
[0036] (1)領料根據(jù)生產(chǎn)計劃領料40kg,進入生產(chǎn)區(qū)除去外包裝;
[0037] (2)粗絞按凍肉絞肉機操作規(guī)程,凍肉絞肉機粗絞,并加入0. 4倍純化水混合,攪 拌成流體狀;
[0038] (3)精絞按膠體磨操作規(guī)程,膠體磨研磨粗絞液2~3遍,收獲精絞液55kg;
[0039] (4)離心精絞液以原料:純化水=1:1. 5比例加純化水稀釋,攪勾,收獲97kg稀釋 液,經(jīng)離心機(60目篩)除去大片筋膜,收獲精絞液88kg;
[0040] (5)細胞破碎離心后精絞液經(jīng)高壓均質機(75MPa)破碎,收獲均質液87kg;
[0041] (6)離心均質液在4°C下,經(jīng)5000r/min離心lOmin,去除沉淀,收獲上清,共 60. 8kg;
[0042] (7)超濾離心上清經(jīng)超濾裝置(截留分子量6KDa)進行超濾,收集透過液,共 56. 3kg,即為半成品;
[0043] (8)半成品檢驗留樣檢測,剩余無菌過濾至4°C無菌罐,暫存;
[0044] (9)配藥半成品檢驗合格,多肽含量為5. 6mg/ml,核糖含量為196. 3yg/ml;按成 品含量要求:多肽含量彡I. 〇mg/ml,核糖含量彡30. 0yg/ml,半成品用純化水稀釋4. 6倍, pH值調節(jié)約為7. 0,共配制258.Okg;
[0045] (10)無菌灌裝規(guī)格200ml/瓶(多肽含量彡I.Omg/ml,核糖含量彡30. 0yg/ml), 共生產(chǎn)1290瓶;
[0046] (11)成品檢驗成品抽檢,合格放行。
[0047] 二、以上制備的轉移因子對新城疫疫苗效價的提高作用
[0048] (1)分組選擇雞場,20日齡雛雞,設正常免疫組、轉移因子組和不免疫組,每組500 只,共1500只雛雞;
[0049] (2)方法除不免疫組外,其余雛雞均使用新城疫IV系活苗滴鼻免疫,同時轉移因子 組按產(chǎn)品說明書飲用轉移因子口服液,連續(xù)3天;分別于接種后2、5、8、ll、14、30、45d各組 隨機抓取10只雞采集血液,分離血清,測定新城疫HI抗體效價;
[0050] (3)結果和討論新城疫HI抗體效價測定結果見表1。正常免疫組和轉移因子組的 抗體在14天達最高峰,縮短機體免疫