專利名稱：甘藍型油菜c染色體組定向轉(zhuǎn)基因的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因植物生態(tài)安全研究領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及基因定向轉(zhuǎn)化方法，應(yīng)用該方法獲得的轉(zhuǎn)基因油菜，環(huán)境釋放時外源轉(zhuǎn)基因擴散的生態(tài)風(fēng)險小。
背景技術(shù)：
油菜是以收獲種子榨油為目的的栽培十字花科蕓薹屬植物的統(tǒng)稱，主要包括甘藍型油菜(Brassica napus L.)、白菜型油菜(B.campestris L.)和芥菜型油菜(B.juncea Czern.et Coss.)。當今世界各國種植的油菜主要是甘藍型油菜，其它類型油菜種植面積很小?，F(xiàn)在所說的油菜如不特別說明，均指甘藍型油菜。
油菜是重要的油料作物，在世界油料作物生產(chǎn)中，僅次于大豆，居第二位。中國、印度、加拿大、澳大利亞、歐洲是世界主要油菜生產(chǎn)國。自1999年以來，中國油菜播種面積一直在1億畝以上，總產(chǎn)量在1100萬噸左右，中國是世界油菜第一生產(chǎn)大國，油菜種植面積和總產(chǎn)量均居世界第一位。
1996年全球第一次大面積種植轉(zhuǎn)基因抗除草劑作物，其后持續(xù)擴大，轉(zhuǎn)基因作物迅速發(fā)展，到2004年全球轉(zhuǎn)基因作物的種植面積達8,100萬公頃，比9年前增加了47倍。2004年全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積的增長率為20％，連續(xù)9年增長率達兩位數(shù)。2004年全球共17個國家(11個發(fā)展中國家及6個發(fā)達國家)825萬農(nóng)民種植8,100萬公頃的轉(zhuǎn)基因作物。
轉(zhuǎn)基因油菜的種植面積則由2002年的300萬公頃增長至2005年的360萬公頃，占全球轉(zhuǎn)基因作物總種植面積的5％，主要集中在加拿大和美國。
國內(nèi)外大量的研究已證實在人工授粉和自然生態(tài)條件下，轉(zhuǎn)基因油菜中的外源基因能夠通過花粉傳給其它有親緣關(guān)系的蕓苔屬植物，如白菜類(小白菜、大白菜、菜薹、白菜型油菜等)(Brassica rapa或B.campestris)、芥菜類(芥菜、榨菜、芥菜型油菜等)(B.juncea)，且能在該物種種群中生存下來(劉后利，油菜的遺傳和育種.上海上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，19859～63；Scheffler JA，Dale PJ.Opportunities for gene transfer andorigin of crop Brassicas，a review.Opera Bot，1994a，553-57；Scheffler JA，DalePJ.Opportunities for gene transfer from transgenic oilseed rape(Brassica napus)to related species.Transgenic Res，1994b，3263-278)。在加拿大和歐洲許多國家，野生白菜類植物(B.rapa)還是農(nóng)田優(yōu)勢種群雜草。在我國冬油菜產(chǎn)區(qū)和春油菜產(chǎn)區(qū)野生芥菜類(B.juncea)和白菜類(B.rapa)植物也是農(nóng)田優(yōu)勢種群雜草。轉(zhuǎn)基因甘藍型油菜中的抗除草劑、抗蟲、抗病等外源基因如果擴散到這類野生植物中，可能形成超級雜草，將會給生態(tài)環(huán)境帶來不可預(yù)測的可怕后果，也會給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來不可估量的損失。
由于轉(zhuǎn)基因甘藍型油菜的環(huán)境釋放和商業(yè)化應(yīng)用，轉(zhuǎn)基因油菜中的外源目的基因(如抗除草劑、抗病、抗蟲等外源基因)通過花粉擴散到自然界油菜野生近緣物種中形成“超級雜草”，造成生態(tài)平衡的破壞，引發(fā)生態(tài)災(zāi)難，引起人們廣泛關(guān)注，也給轉(zhuǎn)基因油菜推廣應(yīng)用帶來很大阻力。因此，世界上除加拿大和美國已商業(yè)化種植轉(zhuǎn)基因油菜多年，其他國家還沒有轉(zhuǎn)基因油菜商業(yè)化種植。
甘藍型油菜(B.napus，AACC，2n＝38)屬于異源多倍體作物，是由白菜(B.rapa，AA，2n＝20)與甘藍(B.oleracea，CC，2n＝18)自然雜交，染色體加倍，經(jīng)過長期的自然進化和人工選擇而形成現(xiàn)在人們廣泛種植的栽培甘藍型油菜(劉后利，油菜的遺傳和育種.上海上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，19859～63)。
前人大量研究表明蕓苔屬AA染色體組白菜類物種與AC染色體組的甘藍型油菜雜交較容易獲得雜種，但雜交后代的自然結(jié)實率很低；AB染色體組的芥菜類植物與甘藍型油菜雜交也比較容易，但雜種F1代不育或部分可育；甘藍型油菜與C染色體組的甘藍類植物雜交極為困難，自然條件下很難獲得雜種(劉后利，油菜的遺傳和育種.上海上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，19859～63)。
對于異源多倍體作物來說，只有某一套染色體和其近緣種具有雜交親和性。比如，甘藍型油菜的A染色體組和白菜類植物(B.rapa)、芥菜類植物(B.juncea)的A染色體組具有雜交親和性，因而轉(zhuǎn)基因甘藍型油菜中的外源轉(zhuǎn)基因很容易通過A染色體組轉(zhuǎn)移到這一類植物中；但在自然條件下位于甘藍型油菜C染色體組上的基因極少會轉(zhuǎn)移到其相應(yīng)的近緣物種中。因此，通過染色體定位轉(zhuǎn)基因獲得那些轉(zhuǎn)基因插入到安全性較高染色體組的轉(zhuǎn)基因作物進行產(chǎn)業(yè)化，可以在很大程度上降低產(chǎn)生超級雜草的生態(tài)風(fēng)險。
Metz等(1997)將轉(zhuǎn)基因抗除草劑甘藍型油菜作父本與蕪菁(B.rapa)雜交，然后研究回交后代不同世代的外源基因消失速度，2個轉(zhuǎn)bar基因甘藍型油菜品系研究結(jié)果明顯不同，1個品系回交后代的抗除草劑植株減少快，表示外源bar基因快速丟失，難以整合到蕪菁(B.rapa)基因組中(Metz PLJ，Jacobsen E，Nap JP，Pereira A，et al..The impacton biosafety of the phosphinothricin-tolerance transgene in inter-specific B.rapa×B.napus hybrids and their successive backcrosses.TheorAppl Genet，1997，95442-450)；Zhu等(2004)研究9個轉(zhuǎn)GFP-Bt基因甘藍型油菜品系與三個野生白菜材料雜交、回交后代轉(zhuǎn)基因遺傳行為，也發(fā)現(xiàn)有2個轉(zhuǎn)基因品系的外源基因在甘白雜種的回交后代中快速丟失(Zhu B，John R.LAWRENCE，Suzanne I.WARWICK et al..Inheritance of GFP-Bttransgenes from Brassica napus in backcrosses with three wild B.rapa accessions.Environ.Biosafety Res.2004，345-54)。上述研究結(jié)果都推測是由于外源基因插入甘藍型油菜C染色體上所形成，表明甘藍型油菜C染色體轉(zhuǎn)基因品系基因擴散的生態(tài)風(fēng)險小。
目前，所有的轉(zhuǎn)基因方法(如基因槍介導(dǎo)法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、花粉管通道法等)都不能準確地將外源目標基因轉(zhuǎn)到甘藍型油菜特定染色體上，現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因方法轉(zhuǎn)基因時，外源基因向受體油菜基因組(染色體組)整合是隨機的，目前還沒有快速有效的方法鑒定外源基因是轉(zhuǎn)到A染色體上還是轉(zhuǎn)到C染色體上。應(yīng)用現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因方法，要想獲得目標基因準確插入C染色體上的轉(zhuǎn)基因甘藍型油菜難度很大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種甘藍型油菜C染色體組定向轉(zhuǎn)基因的方法，以便外源基因準確無誤地定向插入甘藍型油菜C染色體，獲得C染色體轉(zhuǎn)基因甘藍型油菜。該方法解決如何將外源基因準確插入甘藍型油菜特定染色體組上的技術(shù)難題，可使100％的轉(zhuǎn)基因油菜株系的目標基因插在特定的C染色體組上。
根據(jù)本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)基因方法并使用本發(fā)明提供的方法可以實現(xiàn)上述目的。
甘藍型油菜C染色體組定向轉(zhuǎn)基因方法，該方法包括以下步驟1、甘藍農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化1)、農(nóng)桿菌菌液制備將含有bar基因表達載體pCAMBIA3300質(zhì)粒(購自澳大利亞CAMBIA，地址Vectors，CAMBIA，GPO Box 3200，Canberra ACT 2601，Australia)的農(nóng)桿菌菌株LBA4404(購自澳大利亞CAMBIA，地址Vectors，CAMBIA，GPO Box 3200，Canberra ACT 2601，Australia)劃線接種于附加50mg/L卡那霉素的YEB平板培養(yǎng)基[Beef extract(牛肉浸膏)5g/L，Yeast extract(酵母膏)1g/L，Peptone(蛋白胨)5g/L，Sucrose(蔗糖)5g/L，MgSO4.7H2O 0.4g/100ml，Agar(瓊脂)1.5g/100ml，pH7.4]上，在28℃溫度下倒置培養(yǎng)2-3天。待菌落長出后，從YEB平板上挑取一個單菌落，接種于5ml YEB(內(nèi)含50mg/L卡那霉素)液體培養(yǎng)基中，置搖床上200rpm，28℃下培養(yǎng)過夜。取菌液劃線接種于附加50mg/L卡那霉素的YEB平板上，在28℃下倒置培養(yǎng)2天，見菌落長出后，將培養(yǎng)皿至于4℃冰箱備用。每次實驗時，取一個單菌落接種于附加50mg/L卡那霉素的YEB平板培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)1-2天，用1/2濃度的MS液體培養(yǎng)基(pH5.4)洗下菌體，并將菌液稀釋至OD600＝0.08，作為侵染用菌液。
2)、外植體制備選擇籽粒飽滿的甘藍種子消毒[70％酒精5-10秒、1％二氯異氰尿酸(Dichloroisocyanuric acid，DICA)消毒8-15分鐘、無菌水洗3-4次]，植入1/2濃度的MS培養(yǎng)基上生長4-5天(25℃、光16小時/暗8小時)，切下葉柄長約1-2mm的子葉和長約的0.5-0.7cm的下胚軸分別作為具柄子葉和下胚軸外植體。
3)、遺傳轉(zhuǎn)化將外植體置于農(nóng)桿菌菌株LBA4404菌液中，22℃侵染5-10分鐘，其間輕輕搖動。在無菌吸水紙上吸干菌液，轉(zhuǎn)至共培培養(yǎng)基[MS培養(yǎng)基+1mg/L2，4-D+0.2mg/L6-芐氨基嘌呤(6-BA)]上，22℃暗培養(yǎng)2-3天，然后轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基[MS培養(yǎng)基+4.5mg/L6-BA+5mg/L AgNO3+500mg/L羧芐青霉素(Cb)]上延遲培養(yǎng)5-7天，再轉(zhuǎn)到篩選培養(yǎng)基[MS培養(yǎng)基+4.5mg/L 6-BA+5mg/L AgNO3+500mg/L Cb+10mg/L草胺膦(PPT)]上培養(yǎng)3-4周，每2周轉(zhuǎn)接一次。待再生綠苗長至1-2cm時，切下小綠苗，植入生根培養(yǎng)基[MS培養(yǎng)基+0.2mg/L萘乙酸(NAA)+10mg/LPPT]上，待形成完整植株時，經(jīng)煉苗移栽花盆中遮蔭保濕培養(yǎng)。轉(zhuǎn)基因結(jié)果見表1。
表1農(nóng)桿菌介導(dǎo)的子葉與下胚軸遺傳轉(zhuǎn)化結(jié)果

4)、除草劑抗性檢測T0代轉(zhuǎn)基因植株5-6片真葉期用13.5％的Basta(德國拜耳公司生產(chǎn)的草胺膦注冊商標)1∶200倍稀釋液噴施。轉(zhuǎn)基因陽性植株對該除草劑沒有反應(yīng)，表現(xiàn)除草劑抗性；轉(zhuǎn)基因陰性植株在噴藥5天后死亡。
5)、PCR分子檢測為盡量避免T0代轉(zhuǎn)基因植株的假陽性和農(nóng)桿菌菌株LBA4404污染，選取用草胺膦篩選呈陽性的T0代株系植株進行剝蕾自交，獲得T1代種子。將T1代種子種在網(wǎng)室，苗期用13.5％的Basta1∶200倍稀釋液噴施。取抗性轉(zhuǎn)基因甘藍和非轉(zhuǎn)基因甘藍植株的幼嫩葉片，采用CTAB法提取植物基因組DNA(Doyle JJ，Doyle JL.A rapid DNA isolationprocedure for small quantities of fresh leaf tissue.Phytochemical Bulletin，1987，1911-15)。采用20ul反應(yīng)體系對目的基因進行PCR擴增，設(shè)陰性對照(以非轉(zhuǎn)基因甘藍植株總DNA為模板)和陽性對照(以pCAMBIA3300質(zhì)粒DNA為模板)。反應(yīng)程序為95℃，2分鐘；94℃，30秒；50℃，30秒；72℃，1分鐘；35cycles；72℃，5分鐘。PCR產(chǎn)物用l％的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。
檢測bar基因所用的正向引物為5′-GAT CTC GGT GAC GGG CAG GA-3′，反向引物為5′-GGC GGT CTG CAC CAT CGT CAA-3′，由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成。
2、轉(zhuǎn)基因甘藍型油菜的人工合成1)、白菜細胞質(zhì)轉(zhuǎn)基因甘藍型油菜人工合成以白菜作母本、轉(zhuǎn)bar基因甘藍作父本進行種間雜交。取授粉7天后的子房，消毒(70％酒精5～10秒、1％DICA消毒8～10分鐘、無菌水洗3～4次)后進行培養(yǎng)，培養(yǎng)基為附加500mg/L水解酪蛋白的MS培養(yǎng)基(瓊脂濃度0.8％，蔗糖濃度3.0％)。待子房培養(yǎng)約35～40天后，剝出子房中的種子，將剝出的癟小種子接種在MS培養(yǎng)基上萌發(fā)，直到長成正常小苗。然后轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基+0.2mg/L NAA)上生根和擴繁植株，每株系至少擴繁3株以上。待健壯根系形成后，經(jīng)煉苗移栽花盆中遮蔭保濕培養(yǎng)。結(jié)果見表2。
表2白菜×芥藍子房培養(yǎng)雜種獲得率a)

注結(jié)實率＝獲得種子數(shù)/子房數(shù)×100％；雜種獲得率＝雜種苗數(shù)/子房數(shù)×100％。
黑葉白(編號QF01)、蓉優(yōu)矮抗青(QF04)、特早50白菜苔(QF05)、黃金地小白菜(QF06)、黃金小白菜(QF08)、九月鮮紅菜薹(QF10)、潮汕甜白菜(QF11)和一個雙低白菜型油菜品種(QF15)，轉(zhuǎn)基因芥藍(編號J)2)、甘藍細胞質(zhì)轉(zhuǎn)基因甘藍型油菜人工合成以轉(zhuǎn)bar基因甘藍藍作母本、白菜作父本進行種間雜交。取授粉17～20天的子房，消毒(70％酒精5～10秒、1％DICA消毒8～10分鐘、無菌水洗3～4次)后，剝出莢中的胚進行離體培養(yǎng)，培養(yǎng)基為附加500mg/L水解酪蛋白的MS培養(yǎng)基(瓊脂濃度0.8％，蔗糖濃度3.0％)，直到長成正常小苗。轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基+0.2mg/L NAA)上生根和擴繁，每株系至少擴繁3株以上。待健壯根系形成后，經(jīng)煉苗移栽花盆中遮蔭保濕培養(yǎng)。結(jié)果見表3。
表3芥藍×白菜組合胚培養(yǎng)雜種獲得率

注雜種獲得率＝成苗數(shù)/培養(yǎng)胚數(shù)×100％。黑葉白(編號QF01)、蓉優(yōu)矮抗青(QF04)、特早50白菜苔(QF05)、黃金地小白菜(QF06)、黃金小白菜(QF08)、九月鮮紅菜薹(QF10)、潮汕甜白菜(QF11)、一個雙低白菜型油菜品種(QF15)和轉(zhuǎn)基因芥藍(編號J)3)、染色體加倍對人工合成的單倍體油菜采取如下方法進行染色體加倍處理①切下幼苗移植于含0.01％秋水仙堿的MS培養(yǎng)基上處理7～10天，取出幼苗，切去粘有0.01％秋水仙堿的MS培養(yǎng)基的莖基部，轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基+0.2mg/L NAA)上生根和擴繁，每株系至少擴繁3株以上。待健壯根系形成后，經(jīng)煉苗移栽花盆中遮蔭保濕培養(yǎng)；②秋水仙堿溶液浸根處理。將現(xiàn)蕾的植株從土壤中挖出來，洗凈根部泥土，將根浸泡在800mg/L的秋水仙堿水溶液中。4小時之后，用自來水沖洗根部2分鐘，移栽到田間。移栽成活后，剪掉現(xiàn)蕾的主花序和分枝，使其產(chǎn)生更多的新枝；③油菜植株現(xiàn)蕾時，將蘸有0.3％秋水仙堿的棉球置于植株的葉腋處，每天處理2次，連續(xù)處理3天。結(jié)果見表4。
表4人工合成油菜的花粉育性

注觀察花粉數(shù)(平均)＝同一株系各株觀察的花粉數(shù)之和/觀察株數(shù)。黑葉白(編號QF01)、特早50白菜苔(QF05)、黃金小白菜(QF08)、潮汕甜白菜(QF11)和轉(zhuǎn)基因芥藍(編號J)。
3、轉(zhuǎn)基因油菜的鑒定1)、植株染色體數(shù)目觀察種子萌發(fā)植株根尖觀察法將種子在10-15℃冷水浸泡2-4小時，置濕潤濾紙上于25℃下萌發(fā)，待根長至1～1.5cm時，取根尖在22℃下、0.002mol/L8-羥基喹啉中處理3小時，用卡諾液固定24小時，然后置于70％乙醇中4℃下保存。
幼小雌蕊觀察法剝?nèi)∮仔』ɡ僦械拇迫铮?.002mol/L 8-羥基喹啉處理5小時。經(jīng)卡諾液固定24小時后，然后置于70％乙醇中4℃下保存。
幼小花蕾觀察法將幼小花蕾用0.002mol/L 8-羥基喹啉處理4小時后，轉(zhuǎn)到卡諾液中固定，24小時后轉(zhuǎn)到70％乙醇中保存。
觀察時，取上述固定保存的根尖、幼小雌蕊和幼小花蕾材料，在60℃下用1mol/L的鹽酸水解10分鐘，移至載玻片上，加一滴改良的卡寶品紅染液，壓片鏡檢。甘藍型油菜的染色體數(shù)為38條。
2)、轉(zhuǎn)基因油菜的除草劑抗性檢測人工合成油菜植株5-6葉期，噴施13.5％的Basta1∶200倍稀釋液，5天后調(diào)查葉片藥害表現(xiàn)，設(shè)非轉(zhuǎn)基因油菜噴施對照?？钩輨┯筒藳]有反應(yīng)，非轉(zhuǎn)基因抗除草劑油菜枯死。
3)、轉(zhuǎn)基因油菜基因組Southern blotting分子檢測采用CTAB法提取植物基因組DNA(Doyle JJ，Doyle JL.A rapid DNA isolation procedure for small quantities of freshleaf tissue.Phytochemical Bulletin，1987，1911-15)。取人工合成的C染色體組轉(zhuǎn)基因甘藍行油菜、轉(zhuǎn)基因甘藍、非轉(zhuǎn)基因油菜、非轉(zhuǎn)基因甘藍等材料基因組總DNA和pCAMBIA3300質(zhì)粒DNA各約20μg，分別用內(nèi)切酶EcoR I將其完全消化后在0.8％瓊脂糖凝膠上電泳分離。預(yù)雜交、雜交和洗膜的程序按Sharpe等(1995)報道的方法(Sharpe AG，ParkinIA，Keith DJ.Frequent nonreciprocal translocations in the amphidiploid genome ofoilseed rape(Brassica napus).Genome，1995，381112-1121)進行。所用探針為pCAMBIA3300質(zhì)粒PCR擴增bar基因的0.5kb片段，檢測使用地高辛標記試劑盒進行(購自Roche Diagnostics，Swiss)。pCAMBIA3300質(zhì)粒、轉(zhuǎn)基因油菜、轉(zhuǎn)基因甘藍有特異帶出現(xiàn)，并且，轉(zhuǎn)基因油菜與轉(zhuǎn)基因甘藍帶型一致；非轉(zhuǎn)基因油菜和甘藍沒有特異帶出現(xiàn)。
4)、外源基因位于甘藍型油菜C染色體上的細胞遺傳學(xué)驗證以轉(zhuǎn)基因油菜作父本或母本與白菜雜交，甘白雜種與白菜回交，獲得回交一代種子。苗期對回交一代植株進行抗除草劑涂葉鑒定，不抗除草劑植株出現(xiàn)癥狀時將涂藥葉片摘除，并對所有植株進行PCR分子檢測。根據(jù)抗除草劑表型和分子檢測結(jié)果給每株掛抗、感牌。花期取每株幼小花蕾用2mM 8-羥基喹啉處理4小時，轉(zhuǎn)到卡諾固定液中固定，24小時后轉(zhuǎn)到70％乙醇中保存?zhèn)溆谩?br> 觀察時，將花藥挑出在60℃下、1M鹽酸中解離5分鐘，然后在改良卡寶品紅中進行染色、壓片，在顯微鏡下觀察、照相。
所有20條染色體(AA)的植株都是不抗除草劑，并且PCR檢測為陰性；染色體在20-28條之間的植株出現(xiàn)抗、感除草劑分離；染色體數(shù)為29的植株抗除草劑，PCR分子檢測陽性。
本發(fā)明的方法與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點1、外源目的基因可以準確無誤地轉(zhuǎn)到甘藍型油菜C染色體組上，獲得C染色體組轉(zhuǎn)基因甘藍型油菜概率是100％。傳統(tǒng)方法則不能確定可以將外源目的基因定向轉(zhuǎn)到甘藍型油菜C染色體組上，即使能實現(xiàn)，轉(zhuǎn)到C染色體組的概率最高只有47.4％(甘藍型油菜有38條染色體，C染色體18條，18/38＝0.474)。
2、操作簡單，只需按傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因方法先將外源目的基因轉(zhuǎn)到甘藍中，再人工合成甘藍型油菜即可。
3、應(yīng)用本發(fā)明的方法獲得的轉(zhuǎn)基因甘藍型油菜，可以不作任何鑒定就可以確定外源目的基因是插在甘藍型油菜的C染色體組上。傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因方法獲得的轉(zhuǎn)基因油菜必須經(jīng)過一系列鑒定才能從中找出很少一些外源基因插在C染色體組上的株系，但目前還沒有切實可行的鑒定方法。
4、應(yīng)用本發(fā)明的方法獲得的轉(zhuǎn)基因甘藍型油菜，釋放到環(huán)境中，其外源轉(zhuǎn)基因向甘藍型油菜近緣物種(如白菜類植物、芥菜類植物、甘藍類植物等)擴散的概率極低。可以解決人們對轉(zhuǎn)基因油菜環(huán)境釋放引起的基因擴散所造成的生態(tài)環(huán)境風(fēng)險的關(guān)切。
為了敘述方便，在本發(fā)明中轉(zhuǎn)基因方法僅使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，其它能將外源基因?qū)胧荏w細胞并整合到基因組中的各種轉(zhuǎn)基因方法都適用，包括直接轉(zhuǎn)化法(PEG介導(dǎo)法、脂質(zhì)體介導(dǎo)法、電激法、微注射法、基因槍介導(dǎo)法、超聲波介導(dǎo)法、脈沖電泳法、激光微束法、碳硅纖維導(dǎo)入法、離子束介導(dǎo)法等)、間接轉(zhuǎn)化法(農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、病毒介導(dǎo)法、染色體介導(dǎo)的直接轉(zhuǎn)化等)和生殖細胞轉(zhuǎn)化法(花粉管通道法、花粉管介導(dǎo)法、種胚浸泡法等)等。MS培養(yǎng)基是指Murashige T和Skoog F 1962年發(fā)明的培養(yǎng)基(Murashige T，Skoog F.A revisedmedium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures.Physiol Plant，1962，15473-497.)，1/2MS培養(yǎng)基是將MS培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分稀釋一倍?？▽毱芳t染色液配制方法1)原液A稱取3g堿性品紅(Basic fuchsin)溶于100ml 70％乙醇中；2)原液B取10ml原液A加入90ml 5％的苯酚水溶液，在37℃下溫浴2～4小時(2～4周內(nèi)使用)；3)原液C取55ml原液B加入6ml冰乙酸和6ml甲醛，充分混勻；4)卡寶品紅染液取10～20ml原液C加入約80ml 45％的冰乙酸和1g山梨醇(配制兩周后使用)?？ㄖZ固定液是3份甲醇和1份冰醋酸配成，現(xiàn)配現(xiàn)用。
本發(fā)明中的甘藍是指任一甘藍(B.oleracea)品種，白菜是指任一白菜(B.rapa)品種。


圖1十字花科蕓薹屬基本物種與復(fù)合物種間親緣關(guān)系禹氏三角圖，本圖說明甘藍型油菜(B.napus)是由白菜(B.rapa)和甘藍(B.oleracea)雜交、染色體加倍形成的異源多倍體新物種，以及甘藍型油菜與蕓薹屬內(nèi)其它物種的親緣關(guān)系。
圖2pCAMBIA3300質(zhì)粒圖譜，該質(zhì)?？烧系街参锘蚪M中的T-DNA由CaMV35S啟動子、草胺膦除草劑抗性bar基因和CaMV35S polyA終止子組成，農(nóng)桿菌中表達的卡那霉素(kanamycin)抗性基因是細菌篩選標記基因。
圖3轉(zhuǎn)bar基因芥藍抗除草劑Basta鑒定抗、感植株癥狀圖?？剐灾仓耆~片綠色，沒有任何癥狀；不抗除草劑植株葉片變黃、卷曲、整株枯死。
圖4人工合成轉(zhuǎn)基因甘藍型油菜花期圖片，具有典型的栽培甘藍型油菜植物學(xué)特征，下部葉大頭羽裂，葉緣具鈍齒，總狀花序，花乳白色?？钩輨┎莅缝?。
圖5人工合成油菜染色體圖，白菜和甘藍分別有20條和18條染色體，由白菜和甘藍人工合成的甘藍型油菜具有38條染色體，是白菜和甘藍染色體總和。
圖6人工合成轉(zhuǎn)基因油菜的基因組southern blot分析。圖中M帶是DNA分子量marker帶；1號是具有bar基因的pCAMBIA3300質(zhì)粒陽性雜交帶；2號是非轉(zhuǎn)基因油菜，沒有雜交帶；3號是轉(zhuǎn)基因甘藍，具有陽性雜交帶；4-6號是人工合成的C染色體組轉(zhuǎn)基因甘藍型油菜，具有陽性雜交帶。轉(zhuǎn)基因甘藍與人工合成油菜帶型一致，表明合成油菜中的外源基因所在的染色體和在該染色體上的位點與甘藍一樣，證明外源基因在合成油菜C染色體上。
具體實施例方式
以下是本發(fā)明的實施例，這些實施例不以任何方式對本發(fā)明的范圍構(gòu)成限制。
實施例1轉(zhuǎn)bar基因芥藍(B.oleracea var.alboglabra)1芥藍的遺傳轉(zhuǎn)化1.1農(nóng)桿菌準備將含有bar基因表達載體pCAMBIA3300質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌株LBA4404劃線接種于附加50mg/L卡那霉素的YEB平板培養(yǎng)基上，在28℃下倒置培養(yǎng)2-3天。待菌落長出后，從YEB平板上挑取一個單菌落，接種于5ml YEB(內(nèi)含50mg/L卡那霉素)液體培養(yǎng)基中，置搖床上200rpm，28℃下培養(yǎng)過夜。取菌液劃線接種于附加50mg/L卡那霉素的YEB平板上，在28℃下倒置培養(yǎng)2天，見菌落長出后，將培養(yǎng)皿至于4℃冰箱備用。每次實驗時，取一個單菌落接種于附加50mg/L卡那霉素的YEB平板培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)1-2天，用1/2MS液體培養(yǎng)基(pH5.4)洗下菌體，并將菌液稀釋至OD600＝0.08，作為侵染用菌液。
1.2具柄子葉的遺傳轉(zhuǎn)化外植體準備選擇籽粒飽滿的香港尖葉中花芥藍種子消毒(70％酒精5-10秒、1％DICA消毒8-15分鐘、無菌水洗3-4次)，植入1/2MS培養(yǎng)基上生長3-4天(25℃、光16小時/暗8小時)，從子葉節(jié)上1mm處切下具柄子葉作為外植體。
二步組培再生方法將具柄子葉接至MS+1mg/L2，4-D+0.2mg/L6-BA培養(yǎng)基上，22℃暗培養(yǎng)2-3天，然后轉(zhuǎn)移到MS+4.5mg/L6-BA+5mg/LAgNO3上繼續(xù)培養(yǎng)2-3周，待再生綠苗長至1-2cm大時，切下，植入生根培養(yǎng)基MS+0.2mg/L NAA上，待根系發(fā)達成為完整植株時，經(jīng)煉苗移栽花盆中遮蔭保濕培養(yǎng)。
遺傳轉(zhuǎn)化采用二步法組培方法，將具柄子葉置入農(nóng)桿菌菌液中，22℃侵染5-10分鐘，其間輕輕搖動。撈出后在無菌吸水紙上吸干菌液，將子葉轉(zhuǎn)至MS+1mg/L 2.4-D+0.2mg/L6-BA培養(yǎng)基上，22℃暗培養(yǎng)2-3天，然后轉(zhuǎn)移到MS+4.5mg/L6-BA+5mg/L AgNO3+500mg/LCb(羧芐)上延遲培養(yǎng)5-7天，再轉(zhuǎn)至篩選培養(yǎng)基MS+4.5mg/L6-BA+5mg/L AgNO3+500mg/LCb+10mg/L草胺膦(PPT)上培養(yǎng)3-4周，待再生綠苗長至1-2cm大時，切下，植入生根培養(yǎng)基MS+0.2mg/L NAA+10mg/L PPT上，待根系發(fā)達成為完整植株時，經(jīng)煉苗移栽花盆中遮蔭保濕培養(yǎng)。
1.3轉(zhuǎn)基因芥藍的PCR檢測取F1代抗性轉(zhuǎn)基因芥藍和非轉(zhuǎn)基因芥藍植株的幼嫩葉片各1-2g，采用CTAB法提取植物基因組DNA。
檢測Bar基因所用的引物為5′端引物5′GAT CTC GGT GAC GGG CAG GA3′，3′端引物5′GGC GGT CTG CAC CAT CGT CAA3′。引物由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成。
轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測以上制備的基因組DNA為模板，采用25ul反應(yīng)體系對目的基因進行PCR擴增，設(shè)陰性對照(以非轉(zhuǎn)基因芥藍植物總DNA為模板)和陽性對照(以質(zhì)粒DNA為模板)。反應(yīng)程序為95℃，2分鐘；94℃，30秒；50℃，30秒；72℃，1分鐘；35cycles；72℃，5分鐘。PCR產(chǎn)物用1％的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。
轉(zhuǎn)bar基因陽性的植株P(guān)CR擴增出500bp特異性條帶。
實施例2C染色體轉(zhuǎn)bar基因甘藍型油菜的人工合成1.1白菜類植物作母本的甘藍型油菜人工合成以黑葉白、蓉優(yōu)矮抗青、特早50白菜苔、黃金小白菜、紅菜薹、潮汕甜白菜和雙低白菜型油菜等7個白菜類品種作母本、轉(zhuǎn)bar基因芥藍作父本進行種間雜交。授粉后4-7天，取受精子房消毒，進行子房培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含500mg/L水解酪蛋白的MS培養(yǎng)基。子房培養(yǎng)40天后，從成熟的莢果中剝出種子，轉(zhuǎn)入MS培養(yǎng)基中萌發(fā)。當種子萌發(fā)出幼苗時，切下幼苗移植于含0.01％秋水仙堿的MS培養(yǎng)基上處理7-10天，進行染色體加倍。然后，將小苗轉(zhuǎn)入MS加0.2％NAA的培養(yǎng)基中生根，待根系發(fā)達時，移栽花盆中遮蔭保濕培養(yǎng)，開花結(jié)果，收獲種子。
1.2甘藍類植物作母本的甘藍型油菜人工合成以轉(zhuǎn)bar基因芥藍作母本，黑葉白、蓉優(yōu)矮抗青、特早50白菜苔、黃金小白菜、紅菜薹、潮汕甜白菜和雙低白菜型油菜等7個白菜類品種作父本進行種間雜交。授粉后20天，取子房消毒，剝出雜種胚，進行胚拯救培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含6-BA(0.5mg/L)的MS培養(yǎng)基。當胚上長出幼芽時，切下幼芽移于含0.01％秋水仙堿的MS培養(yǎng)基上，進行7-10天的染色體加倍。然后，將小苗轉(zhuǎn)入MS加0.2％NAA的培養(yǎng)基中生根，待根系發(fā)達時，移栽花盆中遮蔭保濕培養(yǎng)，開花結(jié)果，收獲種子。
1.3人工合成的轉(zhuǎn)基因甘藍型油菜的PCR檢測、除草劑抗性檢測及細胞學(xué)檢測人工合成的轉(zhuǎn)基因甘藍型油菜的PCR分子檢測方法參照轉(zhuǎn)基因芥藍的方法進行。
除草劑抗性檢測；油菜苗4-5葉期，用13.5％的Basta1∶200倍稀釋液噴灑植株葉片，5天后開始調(diào)查植株是否死亡，設(shè)非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?。PCR檢測是陽性的植株抗除草劑，植株不死亡，陰性的植株和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓晁劳觥?br> 細胞學(xué)檢測在合成油菜花期，每個雜交組合取3個株系，剝?nèi)∮仔』ɡ僦械拇迫?，?.002mol/L8-羥基喹啉處理4小時，經(jīng)卡諾液固定24小時后，4℃保存于70％乙醇中，觀察時取出材料，在60℃下，用1mol/L鹽酸水解10分鐘，移至玻片上，加一滴改良的卡寶品紅染液，壓片鏡檢。花粉育性正常的植株，觀察到細胞的染色體是38條，植株能正常結(jié)實；花粉育性不正常的植株，觀察到細胞的染色體是19條，植株不能正常結(jié)實。
實施例3bar基因位于甘藍型油菜C染色體上的分子驗證基因組Southern blotting分析取轉(zhuǎn)bar基因芥藍、C染色體轉(zhuǎn)bar基因甘藍型油菜和非轉(zhuǎn)基因油菜基因組總DNA約20μg，分別用內(nèi)切酶EcoR I將其完全消化后在0.8％瓊脂糖凝膠上電泳分離，以質(zhì)粒pCAMBIA3300的DNA作為陽性對照。預(yù)雜交、雜交和洗膜的程序按Sharpe等(1995)報道的方法進行。所用探針為質(zhì)粒PCR擴增bar基因的0.5kb片段，檢測使用地高辛標記試劑盒進行(Roche Diagnostics，Swiss)。
隨機抽取三個PCR及Basta檢測為陽性人工合成油菜株系(同一轉(zhuǎn)基因芥藍父本)及其父本芥藍進行基因組Southern blot分析結(jié)果顯示外源bar基因已經(jīng)整合到了人工合成甘藍型油菜的基因組中，父本芥藍與三個人工合成甘藍型油菜株系的Southern blot隨機酶切的雜交帶型一致，表明人工合成轉(zhuǎn)基因油菜中的bar基因位點與轉(zhuǎn)bar基因芥藍中的bar基因位點一致，即在人工合成的轉(zhuǎn)bar基因甘藍型油菜中，外源bar基因位于C染色體上。
實施例4bar基因位于甘藍型油菜C染色體上的細胞遺傳學(xué)驗證以轉(zhuǎn)基因油菜作父本或母本與白菜雜交，甘白雜種與白菜回交，獲得回交一代種子。苗期對回交—代植株進行抗除草劑涂葉鑒定，不抗除草劑植株出現(xiàn)癥狀時將涂藥葉片摘除，并對所有植株進行PCR分子檢測(方法同上)。根據(jù)抗除草劑表型和分子檢測結(jié)果給每株掛抗、感牌?；ㄆ谌∶恐暧仔』ɡ儆?mM 8-羥基喹啉處理4小時，轉(zhuǎn)到卡諾固定液中固定，24小時后轉(zhuǎn)到70％乙醇中保存?zhèn)溆谩?br> 觀察時，將花藥挑出在60℃下、1M鹽酸中解離5分鐘，然后在改良卡寶品紅中進行染色、壓片，在顯微鏡下觀察、照相。
所有20條染色體(AA)的植株都是不抗除草劑，并且PCR檢測為陰性；染色體數(shù)大于20的植株出現(xiàn)抗、感除草劑分離；染色體數(shù)為29的植株抗除草劑，PCR分子檢測陽性。
權(quán)利要求
1.一種甘藍型油菜C染色體組定向轉(zhuǎn)基因的方法，該方法包括下列步驟A、甘藍農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化首先是農(nóng)桿菌菌液制備，將含有bar基因表達載體pCAMBIA3300質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌株LBA4404劃線接種于附加50mg/L卡那霉素的YEB平板培養(yǎng)基上，在28℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2-3天，待菌落長出后，從YEB平板上挑取一個單菌落，接種于5ml YEB液體培養(yǎng)基中，置搖床上，培養(yǎng)過夜，取菌液劃線接種于附加50mg/L卡那霉素的YEB平板上，在28℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2天，見菌落長出后，將培養(yǎng)皿至于4℃冰箱備用，在甘藍轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灂r，取一個單菌落接種于附加50mg/L卡那霉素的YEB平板培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)1-2天，用1/2濃度的MS液體培養(yǎng)基洗下菌體，并將菌液稀釋至OD600＝0.08；其次是外植體制備，將甘藍種子消毒，植入1/2濃度MS培養(yǎng)基上生長4-5天，25℃、光16小時/暗8小時，切下葉柄長1-2mm的子葉和長0.5-0.7cm的下胚軸分別作為具柄子葉和下胚軸外植體；第三是遺傳轉(zhuǎn)化，將外植體置于農(nóng)桿菌菌液中，22℃侵染5-10分鐘，其間搖動，在無菌吸水紙上吸干菌液，轉(zhuǎn)至培養(yǎng)基MS+1mg/L 2，4-D+0.2mg/L 6-芐氨基嘌呤上，22℃暗培養(yǎng)2-3天，然后轉(zhuǎn)到培養(yǎng)基MS+4.5mg/L 6-BA+5mg/L AgNO3+500mg/L羧芐青霉素上延遲培養(yǎng)5-7天，再轉(zhuǎn)到篩選培養(yǎng)基MS+4.5mg/L 6-BA+5mg/L AgNO3+500mg/L Cb+10mg/L草胺膦上培養(yǎng)3-4周，每2周轉(zhuǎn)接一次，待再生綠苗長至1-2cm時，切下綠苗，植入生根培養(yǎng)基上，待形成植株時，經(jīng)煉茁移栽花盆中遮蔭保濕培養(yǎng)；第四是除草劑抗性檢測，T0代轉(zhuǎn)基因植株5-6片真葉期用13.5％的Basta1∶200倍稀釋液噴施，轉(zhuǎn)基因陽性植株對該除草劑沒有反應(yīng)，表現(xiàn)除草劑抗性，轉(zhuǎn)基因陰性植株在噴藥5天后死亡；第五是PCR分子檢測，為避免T0代轉(zhuǎn)基因植株的假陽性和農(nóng)桿菌LBA4404污染，選取用草胺膦篩選呈陽性的T0代株系植株進行剝蕾自交，獲得T1代種子，將T1代種子種在網(wǎng)室，苗期用13.5％的Basta1∶200倍稀釋液噴施，取抗性轉(zhuǎn)基因甘藍和非轉(zhuǎn)基因甘藍植株的幼嫩葉片，采用CTAB法提取植物基因組DNA，然后用20ul反應(yīng)體系對目的基因進行PCR擴增，設(shè)陰性對照以非轉(zhuǎn)基因甘藍植株總DNA為模板和陽性對照以pCAMBIA3300質(zhì)粒DNA為模板，反應(yīng)程序為95℃，2分鐘；94℃，30秒；50℃，30秒；72℃，1分鐘，35cycles，72℃，5分鐘，PCR產(chǎn)物用1％的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，轉(zhuǎn)基因陽性植株與陽性對照均擴增出500bp的條帶，檢測bar基因所用的正向引物為5′-GAT CTC GGT GAC GGG CAG GA-3′，反向引物為5′-GGC GGTCTG CAC CAT CGT CAA-3′；B、轉(zhuǎn)基因甘藍型油菜的人工合成，首先是白菜細胞質(zhì)轉(zhuǎn)基因甘藍型油菜人工合成，以白菜作母本、轉(zhuǎn)bar基因甘藍作父本進行種間雜交，取授粉7天后的子房，消毒用70％酒精5～10秒、1％DICA消毒8～10分鐘、無菌水洗3～4次后進行培養(yǎng)，培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+500mg/L水解酪蛋白，待子房培養(yǎng)35～40天后，剝出子房中的種子，將剝出的種子接種在MS培養(yǎng)基上萌發(fā)，直到長成苗，然后轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上生根和擴繁植株，待根系形成后，經(jīng)煉苗移栽花盆中遮蔭保濕培養(yǎng)；其次是甘藍細胞質(zhì)轉(zhuǎn)基因甘藍型油菜人工合成，以轉(zhuǎn)bar基因甘藍作母本、白菜作父本進行種間雜交，取授粉17～20天的子房，消毒后，剝出雜種胚，進行胚拯救培養(yǎng)，培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+0.5mg/L 6-BA，當胚上長出芽時，切下芽移植到含0.01％秋水仙堿的MS培養(yǎng)基上，進行7-10天的培養(yǎng)，然后，將苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中生根，待根系發(fā)達時，移栽花盆中遮蔭保濕培養(yǎng)，開花結(jié)果，收獲種子；第三是染色體加倍，對人工合成的單倍體油菜采取如下方法進行染色體加倍處理a、切下幼苗移植于含0.01％秋水仙堿的MS培養(yǎng)基上處理7～10天，取出苗，切去粘有0.01％秋水仙堿的MS培養(yǎng)基的莖基部，轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基上生根和擴繁，每株系至少擴繁3株，待根系形成后，經(jīng)煉苗移栽花盆中遮蔭保濕培養(yǎng)；b、秋水仙堿溶液浸根處理，將現(xiàn)蕾的植株從土壤中挖出來，洗凈根部泥土，將根浸泡在800mg/L的秋水仙堿水溶液中，4小時之后，用自來水沖洗根部2分鐘，移栽到田間，移栽成活后，剪掉已現(xiàn)蕾的主花序和分枝，使其產(chǎn)生新枝；c、油菜植株現(xiàn)蕾時，將蘸有0.3％秋水仙堿的棉球置于植株的葉腋處，每天處理2次，連續(xù)處理3天；C、轉(zhuǎn)基因油菜的鑒定a、植株染色體數(shù)目觀察，首先是種子萌發(fā)植株根尖觀察法，將種子在10-15℃冷水浸泡2-4小時，置濕潤濾紙上于25℃下萌發(fā)，待根長至1～1.5cm時，取根尖在22℃下、0.002mol/L8-羥基喹啉中處理3小時，用卡諾液固定24小時，然后置于70％乙醇中4℃下保存；其次是幼小雌蕊觀察法剝?nèi)∮仔』ɡ僦械拇迫铮?.002mol/L 8-羥基喹啉處理5小時，用卡諾液固定24小時，然后置于70％乙醇中4℃下保存；第三是幼小花蕾觀察法將幼小花蕾用0.002mol/L 8-羥基喹啉處理4小時后，轉(zhuǎn)到卡諾液中固定，24小時后轉(zhuǎn)到70％乙醇中4℃下保存；b、轉(zhuǎn)基因油菜的除草劑抗性檢測，人工合成油菜植株5-6葉期，噴施13.5％的Basta1∶200倍稀釋液，5天后調(diào)查葉片藥害表現(xiàn)，設(shè)非轉(zhuǎn)基因油菜噴施對照，轉(zhuǎn)基因油菜沒有反應(yīng)，非轉(zhuǎn)基因油菜枯死；c、轉(zhuǎn)基因油菜基因組Southern blotting分子檢測，采用CTAB法提取植物基因組DNA，取人工合成的C染色體組轉(zhuǎn)基因甘藍行油菜、轉(zhuǎn)基因甘藍、非轉(zhuǎn)基因油菜、非轉(zhuǎn)基因甘藍材料基因組總DNA和轉(zhuǎn)基因pCAMBIA3300質(zhì)粒DNA各20μg，分別用內(nèi)切酶EcoR I將其消化后在0.8％瓊脂糖凝膠上電泳分離，進行預(yù)雜交、雜交和洗膜的程序，所用探針為pCAMBIA3300質(zhì)粒PCR擴增bar基因的0.5kb片段，檢測使用地高辛標記試劑盒進行，質(zhì)粒、轉(zhuǎn)基因油菜、轉(zhuǎn)基因甘藍有特異帶出現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因油菜與轉(zhuǎn)基因甘藍帶型一致，非轉(zhuǎn)基因油菜和甘藍沒有特異帶出現(xiàn)；d、外源基因位于甘藍型油菜C染色體上的細胞遺傳學(xué)驗證，以轉(zhuǎn)基因油菜作父本或母本與白菜雜交，甘白雜種與白菜回交，獲得回交一代種子，苗期對回交一代植株進行抗除草劑涂葉鑒定，不抗除草劑植株葉片出現(xiàn)枯死癥狀時，將該葉片摘除，并對植株進行PCR分子檢測，根據(jù)抗除草劑表型和分子檢測結(jié)果給每株掛抗、感牌，花期取每株幼小花蕾用0.002mol/L 8-羥基喹啉處理4小時，轉(zhuǎn)到卡諾固定液中固定，24小時后轉(zhuǎn)到70％乙醇中保存?zhèn)溆?，將幼小花蕾中的花藥挑出，?0℃下、1M鹽酸中解離5分鐘，然后在改良卡寶品紅中進行染色、壓片，在顯微鏡下觀察、照相，觀察到20條染色體的植株都是不抗除草劑，并且PCR檢測為陰性；染色體在21-28條之間的植株出現(xiàn)抗、感除草劑分離；染色體數(shù)為29的植株抗除草劑，PCR分子檢測陽性。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種甘藍型油菜C染色體組定向轉(zhuǎn)基因的方法，其步驟是A.甘藍農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，首先是農(nóng)桿菌菌液制備，其次是外植體制備，第三是將外植體置于農(nóng)桿菌液中進行遺傳轉(zhuǎn)化，第四是除草劑抗性檢測，第五是PCR分子檢測；B.轉(zhuǎn)基因甘藍型油菜的人工合成，首先是白菜細胞質(zhì)轉(zhuǎn)基因甘藍型油菜人工合成，其次是甘藍細胞質(zhì)轉(zhuǎn)基因甘藍型油菜人工合成，最后是對人工合成的單倍體油菜進行染色體加倍；C.轉(zhuǎn)基因油菜的鑒定。本發(fā)明操作簡單，外源目的基因可準確無誤地轉(zhuǎn)到甘藍型油菜C染色體上，所獲得的轉(zhuǎn)基因油菜，環(huán)境釋放時外源轉(zhuǎn)基因擴散的生態(tài)風(fēng)險小。
文檔編號A01H1/02GK1884518SQ20061001946
公開日2006年12月27日 申請日期2006年6月27日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月27日
發(fā)明者方小平, 李均, 王轉(zhuǎn), 羅莉霞, 李俊 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所