一種強化圓紅冬孢酵母產(chǎn)α-亞麻酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種利用微生物產(chǎn)α-亞麻酸的方法，尤其是強化圓紅冬孢酵母產(chǎn)α -亞麻酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]微生物油脂(Microbial oil)又稱單細胞油脂(SCO, single celloil)，是由酵母、霉菌、細菌和藻類等微生物在一定條件下，利用碳水化合物、碳氫化合物和普通油脂作為碳源，在菌體內(nèi)產(chǎn)生的大量油脂。與傳統(tǒng)的油脂生產(chǎn)工藝相比，利用微生物生產(chǎn)油脂除了具有油脂含量高外，還有許多特殊的優(yōu)點:如微生物細胞增殖快，生產(chǎn)周期短；利用微生物生產(chǎn)油脂，比農(nóng)業(yè)生產(chǎn)油脂所需的勞動力少，而且不受場地設(shè)施、季節(jié)因素和天氣變化的限制；微生物生長代謝所需的生物質(zhì)原料來源廣，價格便宜，如淀粉、糖類，以及食品工業(yè)和造紙行業(yè)的廢棄物等都可以加以利用；能進行連續(xù)化的大規(guī)模生產(chǎn)，生產(chǎn)成本低；目前可以利用基因工程改造、代謝系統(tǒng)重構(gòu)、細胞誘變等高科技方法，使微生物生產(chǎn)出比動、植物油脂更符合人們需要的高營養(yǎng)油脂或某些特定脂肪酸的油脂。
[0003]α -亞麻酸(cisA9，12，15)是一種ω-3家族的多不飽和脂肪酸，它在人體內(nèi)不能合成，必須從體外攝取。如果身體缺乏α-亞麻酸，維生素、礦物質(zhì)、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)素均不能被有效吸收和利用，而且會導(dǎo)致機體脂質(zhì)代謝紊亂，進而引起免疫力降低、健忘、疲勞、視力減退、動脈粥樣硬化等癥狀的發(fā)生。同時，α-亞麻酸在體內(nèi)能合成、代謝，轉(zhuǎn)化為機體必需的生命活性因子DHA和ΕΡΑ，是構(gòu)成人體組織細胞的主要成分。尤其是嬰幼兒、青少年如果缺乏α -亞麻酸，就會嚴重影響其智力正常發(fā)育，這一點已經(jīng)被世界營養(yǎng)學(xué)界所公認。
[0004]圓紅冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)是自然界中為數(shù)不多的可以合成亞麻酸的產(chǎn)油酵母。但是常規(guī)的圓紅冬孢酵母發(fā)酵方法的α-亞麻酸產(chǎn)率很低，所以強化圓紅冬孢酵母生產(chǎn)α-亞麻酸具有重要的研究和應(yīng)用價值。
[0005]微生物油脂的產(chǎn)量和組分構(gòu)成會隨著發(fā)酵條件的不同而發(fā)生變化。已有諸多文獻做了相關(guān)披露。
[0006]中國專利申請CN103642858A公開了一種調(diào)控油脂酵母發(fā)酵產(chǎn)生的微生物油脂的脂肪酸組成的方法，在油脂酵母的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加短鏈水溶性有機酸，就得到含有短鏈水溶性有機酸的發(fā)酵培養(yǎng)基；發(fā)酵過后提取微生物油脂，可以獲得脂肪酸酯組成顯著改變的微生物油脂。這種方法簡單可行，能夠快速改造產(chǎn)油脂酵母的油脂脂肪酸組成。
[0007]中國專利申請CN101153299A公開了一種補料批式發(fā)酵粘紅酵母(Rhodotorulaglutinis)生產(chǎn)微生物油脂的方法。在菌體對數(shù)生長中期向發(fā)酵培養(yǎng)液中補加碳源葡萄糖，并以C/N 40同時進行氮源(硫酸銨或硝酸鉀)的補加，這種方法使粘紅酵母的油脂含量和產(chǎn)量顯著提高。
[0008]中國專利申請CN104862349A公開了一種提高粘紅酵母(Rhodotorulaglutinis)油脂產(chǎn)量的培養(yǎng)基，其成分包括葡萄糖、酵母浸粉、磷酸氫二鉀、硫酸銨、硫酸鈉、七水硫酸鎂和螺旋藻蛋白酶解物。這項技術(shù)將螺旋藻蛋白酶解物作為功能性促進物直接添加到葡萄糖培養(yǎng)基中，也作為一種有機氮源部分或全部替代葡萄糖培養(yǎng)基中的有機氮源酵母浸粉，從而在較低成本的前提下得到較高的微生物油脂產(chǎn)量。
[0009]美國專利申請US7932077使用基因工程的方法，顯著提高了產(chǎn)油的解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)胞內(nèi)二十碳五稀酸(EPA)的含量，這種方法利用多個嵌合基因，分別表達外源的脫飽和酶、碳鏈延長酶和酰基轉(zhuǎn)移酶以及敲除了解脂耶氏酵母自身活性不高的脫飽和酶和?；D(zhuǎn)移酶，并且優(yōu)化了發(fā)酵條件，使二十碳五烯酸在解脂耶氏酵母胞內(nèi)的含量達到了 25%以上。
[0010]這些方法使得某種微生物的總油脂產(chǎn)率或某種特定油脂的產(chǎn)率得到了提升。但是，目前還沒有簡單有效地強化圓紅冬孢酵母產(chǎn)α-亞麻酸的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]為了解決現(xiàn)有圓紅冬孢酵母生產(chǎn)α-亞麻酸產(chǎn)量低的問題，本發(fā)明提供了一種強化圓紅冬孢酵母產(chǎn)α-亞麻酸的方法，有效地提升了圓紅冬孢酵母生產(chǎn)α-亞麻酸的產(chǎn)量。
[0012]本發(fā)明提供的一種強化圓紅冬孢酵母產(chǎn)α -亞麻酸的方法，包括以下步驟:
[0013]1)將活化的圓紅冬孢酵母在ΥΕΗ)培養(yǎng)基培養(yǎng)；
[0014]2)收集步驟1)培養(yǎng)而得的圓紅冬孢酵母菌體，接種至補料發(fā)酵培養(yǎng)基進行補料發(fā)酵，所述補料發(fā)酵培養(yǎng)基含有碳源、氮源和無機鹽，補料發(fā)酵過程中，總碳氮比始終維持在 100:0.7 ?1.5。
[0015]活化的圓紅冬孢酵母可以直接采用活化狀態(tài)的菌株，也可由保藏狀態(tài)的菌株活化而來。
[0016]所述YEH)培養(yǎng)基或稱為YH)培養(yǎng)基，S卩，酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基(YeastExtract Peptone Dextrose Medium)，按照常規(guī)配方配置即可。優(yōu)選地，按照如下配方配置:8?12g/L酵母粉，8?20g/L蛋白胨，15?25g/L葡萄糖，pH為5.8?6.0。若制固體培養(yǎng)基，加入10?20g/L瓊脂粉，優(yōu)選為15g/L瓊脂粉。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，YEH)培養(yǎng)基按照如下配方配置:10g/L酵母粉，10g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，pH = 5.8?
6.0o
[0017]步驟1)和步驟2)可以在發(fā)酵罐中進行。步驟2)中，補料發(fā)酵是指，通過補料流加所述碳源維持所需的碳氮比。
[0018]根據(jù)本發(fā)明所述的方法，優(yōu)選地，步驟2)中，所述碳源為含有葡萄糖和木糖的混合碳源，所述氮源為谷氨酸鈉或蛋白胨，所述無機鹽含有鉀元素、鎂元素和磷元素。
[0019]根據(jù)本發(fā)明所述的方法，優(yōu)選地，步驟2)中，碳源為含有15?25g/L葡萄糖和25?35g/L木糖的混合碳源，氮源為5.8?6.5g/L的谷氨酸鈉或4.6?5.5g/L的蛋白胨，所述無機鹽包括 0.3 ?0.7wt% 的 ΚΗ2Ρ04、0.1 ?0.3wt% 的 Κ2ΗΡ04^Ρ 0.3 ?0.7wt% 的MgCl2。以上各成分的含量是指各成分在補料發(fā)酵培養(yǎng)基中的含量。補料發(fā)酵過程中，通過流加所述碳源的水溶液(即，通過流加含有15?25g/L的葡萄糖和25?35g/L的木糖的混合碳源水溶液)，使總碳氮比始終維持在100:0.8?1.2。更優(yōu)選地，步驟2)中，碳源為含有18?22g/L葡萄糖和28?32g/L木糖的混合碳源，氮源為5.8?6.2g/L的谷氨酸鈉或4.6?5.2g/L的蛋白胨，所述無機鹽包括0.4?0.6wt%^ ΚΗ2Ρ04、0.1?0.2wt%^K2HP0jP 0.4?0.6被％的MgCl 2，補料發(fā)酵過程中，通過流加所述混合碳源的水溶液(即，通過流加含有18?22g/L的葡萄糖和28?32g/L的木糖的混合碳源水溶液)，使總碳氮比始終維持在100:0.9?1.1。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式，步驟2)中，碳源為含20g/L葡萄糖和30g/L木糖的混合碳源，氮源為6.2g/L的谷氨酸鈉或4.6g/L的蛋白胨，所述無機鹽包括0.52被％的ΚΗ2Ρ04、0.16被％的K2HP0# 0.48被％的MgCl 2，補料發(fā)酵過程中，通過流加所述碳源的水溶液(即，通過流加含有18?22g/L的葡萄糖和28?32g/L的木糖的混合碳源水溶液)，使總碳氮比始終維持在100:1。
[0020]根據(jù)本發(fā)明所述的方法，優(yōu)選地，步驟1)中，圓紅冬孢酵母在YEro培養(yǎng)基培養(yǎng)至0D6。。為10以上。更優(yōu)選地，培養(yǎng)至0D6。。為12?15。
[0021]根據(jù)本發(fā)明所述的方法，優(yōu)選地，步驟2)中，補料發(fā)酵的時間為80?150h。更優(yōu)選地，補料發(fā)酵的時間為100?140h。
[0022]根據(jù)本發(fā)明所述的方法，優(yōu)選地，步驟1)中，圓紅冬孢酵母在YEro液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為28?30°C，180?230rpm，培養(yǎng)40?60h ;步驟2)中，補料發(fā)酵的時間為100?130h。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方式，步驟1)中，圓紅冬孢酵母在YEH)液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為30°C，200rpm，培養(yǎng)48h ;步驟2)中，補料發(fā)酵的時間為120h。
[0023]