8)將小室放入95%乙醇中固定10分；（9)用 PBS輕柔沖洗小室表面的固定液，再將小室放入蘇木素中染色5分鐘；（10)小室放入1%鹽 酸酒精中分化，自來水沖洗返藍(lán)5分鐘；（11)將小室放入伊紅中染色5分鐘，然后自來水沖 洗；（12)小室依次放入75%乙醇1分鐘、85%乙醇1中分鐘、95%乙醇1中分鐘、100%乙醇4 分鐘；（13)將小室風(fēng)干，用刀片小心沿邊緣切下小室底面的膜。膜底面朝上放在蓋玻片上， 中性樹膠封片；（14)在正置顯微鏡下觀察，每張片在200 X下取8個(gè)隨機(jī)視野，數(shù)出每個(gè)視 野中穿過的細(xì)胞數(shù)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
[0032] 6、統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用SPSS20. 0 (IBMInc，USA)軟件處理數(shù)據(jù)，所有數(shù)據(jù)用'x±s表示。多組間差異比 車父米用單因素方差分析，兩兩間比$父米用Dunnett-t檢驗(yàn)，兩組間比$父差異米用student-t 檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0. 05。
[0033] 三、結(jié)果及結(jié)論 1、化合物（I )對(duì)腎癌細(xì)胞株786-0和0S-RC-2增殖能力的影響 生長曲線顯示加入不同濃度的化合物（I )后，兩種腎癌細(xì)胞株的增殖都受到了明顯 的抑制。0. lmg/mL化合物（I )作用于786-0細(xì)胞24小時(shí)即出現(xiàn)顯著的抑制生長作用 (Ρ〈0· 035)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，0· lmg/mL化合物（I )及0· 25mg/mL化合物（I )對(duì)細(xì)胞 增殖保持明顯的抑制作用，而〇. 5mg/mL化合物（I )使786-0細(xì)胞的增殖停滯?；衔铮↖ ) 對(duì)0S-RC-2細(xì)胞的增殖同樣有抑制作用，在培養(yǎng)第3天0. lmg/mL、0. 25mg/mL、0. 5mg/mL表 現(xiàn)出對(duì)0S-RC-2細(xì)胞的顯著抑制（P分別為0. 026、0. 004、0. 002)。繪制的生長曲線顯示化 合物（I )對(duì)786-0細(xì)胞株的增殖抑制作用較對(duì)0S-RC-2細(xì)胞的增殖抑制作用更為明顯。生 長曲線周期中每天的細(xì)胞增殖情況見表1 (注：*在相應(yīng)作用時(shí)間與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差 異（ρ〈0· 05))〇
[0034] WST-8細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，化合物（I )對(duì)腎癌細(xì)胞株786-0細(xì)胞及0S-RC-2 細(xì)胞活力均有明顯的抑制作用，化合物（I ) 〇. lmg/mL即在24小時(shí)對(duì)786-0及0S-RC-2細(xì) 胞的活力有顯著的抑制作用，且與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。藥物在24小時(shí)對(duì)兩種細(xì) 胞的半數(shù)抑制濃度（IC 5。）分別為3. 5mg/mL和16. 45mg/mL，在48小時(shí)分別為為0· 165mg/mL 和I. 762mg/mL。對(duì)兩種細(xì)胞的活性抑制作用見表2(注：*在相應(yīng)作用時(shí)間與對(duì)照組相比有 統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P〈〇. 05))。
[0035] 2、化合物（I )抑制腎癌細(xì)胞株迀移和侵襲能力 細(xì)胞劃痕迀移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，化合物（I )對(duì)腎癌細(xì)胞株786-0和0S-RC-2的迀移能 力有抑制作用，化合物（I ) 〇· 25mg/mL組在6h、12h、18h對(duì)786-0迀移的抑制率為10. 95%、 21. 96%和43. 02%，12h和18h的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為0. 004和0. 000);對(duì)0S-RC-2 的抑制率為3. 81%、19. 67%、28. 44%，12h和18h的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為0. 009和 0. 000)?；衔铮↖ ) 0. 5mg/mL 組在 6h、12h、18h 對(duì) 786-0 的抑制率為 76. 82%、81. 18%、和 82. 62%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為0. 001、0. 000和0. 000);對(duì)0S-RC-2細(xì)胞的抑 制率為22. 01%、52. 95%、和61. 50%，12小時(shí)和18小時(shí)的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為 0. 000和0. 000)。各組在對(duì)應(yīng)時(shí)間的迀移率如表3。
[0036] Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)過12小時(shí)后，786-0細(xì)胞株加藥組 (0. 25mg/mL化合物（I ))和對(duì)照組每個(gè)200X視野穿過的細(xì)胞數(shù)分別為262. 38±22. 13 和74. 75±10. 50,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.00 0) ;0S-RC-2細(xì)胞株則分別為102. 75±8. 75、 65. 13±9. 66,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.00 0)。
[0037] 結(jié)論，本研究結(jié)果表明一定濃度的化合物（I )對(duì)腎癌細(xì)胞的增殖、迀移、侵襲、死 亡都有顯著地影響，且在這些實(shí)驗(yàn)中對(duì)786-0細(xì)胞系的作用明顯比對(duì)0S-RC-2細(xì)胞系更為 明顯。表明這種藥物也有可能通過這一機(jī)制對(duì)控制腎癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移發(fā)揮一定的作用。
[0038] 表1化合物（I )對(duì)腎癌細(xì)胞株786-0和0S-RC-2增殖能力的影響
表2化合物（I )對(duì)腎癌細(xì)胞株786-0和0S-RC-2抑制率的影響
表3化合物（I )對(duì)腎癌細(xì)胞株迀移和侵襲能力的影響
實(shí)施例3 片劑的制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物（I )，以及利用有機(jī)酸如酒石酸、或檸檬 酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按其與賦形劑重量比為1:9 的比例加入賦形劑，制粒壓片。
[0039] 實(shí)施例4 口服液制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物（I )，以及利用有機(jī)酸如酒石酸、或檸檬酸 或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按常規(guī)口服液制法制成口服液。
[0040] 實(shí)施例5 膠囊劑或顆粒劑的制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物（I )，以及利用有機(jī)酸如酒石 酸、或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按其與賦形劑重量 比為1:9的比例加入賦形劑，制成膠囊或顆粒劑。
[0041] 實(shí)施例6 注射液的制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物（I )，以及利用有機(jī)酸如酒石酸、或檸檬 酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按常規(guī)加注射用水，精濾，灌 封滅菌制成注射液。
[0042] 實(shí)施例7 無菌粉針的制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物（I )，以及利用有機(jī)酸如酒石酸、或檸 檬酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，將其溶于無菌注射用水中， 攪拌使溶，用無菌抽濾漏斗過濾，再無菌精濾，分裝于安瓿中，低溫冷凍干燥后無菌熔封得 粉針劑。
[0043] 上述實(shí)施例的作用在于說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明的保護(hù) 范圍。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換， 而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物（I)，2. 權(quán)利要求1所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于包含以下操作步驟：（a)將 粘毛鼠尾草干燥全草粉碎，用75~85%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用 石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁 醇萃取物；（b)步驟（a)中乙酸乙酯萃取物用大孔樹脂除雜，先用10%乙醇洗脫6個(gè)柱體積， 再用75%乙醇洗脫8個(gè)柱體積，收集75%乙醇洗脫液，減壓濃縮得75%乙醇洗脫物浸膏；（c) 步驟（b)中75%乙醇洗脫浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為80:1、50:1、35:1、15:1和 1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到5個(gè)組分；（d)步驟（c)中組分4用正相硅膠進(jìn)一步分 離，依次用體積比為20:1、12:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；（e)步驟 (d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為70%的甲醇水溶液等 度洗脫，收集8~10個(gè)柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物（I)。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于：所述大孔樹脂為AB-8 型大孔吸附樹脂。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于：所述用乙醇熱回流提 取采用的乙醇濃度為80%。5. -種藥物組合物，其特征在于：其中含有治療有效量的權(quán)利要求1所述的化合物 (I)和藥學(xué)上可接受的載體。6. 權(quán)利要求1所述的化合物（I)在制備治療腎癌的藥物中的應(yīng)用。7. 權(quán)利要求5所述的藥物組合物在制備治療腎癌的藥物中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于治療腎癌的貝殼杉烷類二萜化合物物。該化合物為首次報(bào)道，是一種結(jié)構(gòu)新穎的貝殼杉烷類二萜化合物，可以從粘毛鼠尾草干燥全草中提取、分離純化得到。體外試驗(yàn)證明該化合物對(duì)腎癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲、死亡都有顯著地影響，可以用來開發(fā)成治療腎癌的藥物。
【IPC分類】C07D493/10, A61K31/366, A61P35/00
【公開號(hào)】CN105384750
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510647882
【發(fā)明人】葉澄
【申請(qǐng)人】溫州泓呈祥科技有限公司
【公開日】2016年3月9日
【申請(qǐng)日】2015年10月9日