一種支鏈脂肪酸微量分離富集方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于食品加工技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種脂肪酸微量分離富集方法，更具體地涉 及一種支鏈脂肪酸的微量分離富集方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 支鏈脂肪酸（branchedchainfattyacid，BCFA)是一類碳骨架上帶有一個或多 個支鏈（主要是甲基）的脂肪酸，通常是飽和脂肪酸。BCFA分為單支鏈和多支鏈脂肪酸。 單支鏈脂肪酸（monomethylBCFA)的甲基位置對分子構(gòu)型非常重要，如果甲基位于脂肪酸 分子碳鏈骨架倒數(shù)第2個碳原子上，形成的結(jié)構(gòu)稱為iso-構(gòu)型，如果甲基位于脂肪酸分子 碳鏈骨架倒數(shù)第3個碳原子上，形成的結(jié)構(gòu)稱為anteiso-構(gòu)型。類萜支鏈脂肪酸在碳鏈內(nèi) 部有多個支鏈，如植烷酸及其α-氧化產(chǎn)物降植烷酸。
[0003]BCFA廣泛的存在于大自然中。許多水鳥羽毛上附著的蠟類物質(zhì)就是由帶有甲基的 支鏈脂肪酸和甲基脂肪醇組成的。這些對水鳥來說十分重要的蠟可以保護(hù)水鳥適應(yīng)各種氣 候的變化，使其羽毛處于最佳狀態(tài)；同時，這些帶有支鏈的脂肪酸酯蠟在皮膚上形成的薄膜 是透氣性的，因此它也使水鳥皮膚的呼吸得以通暢。在反芻動物的乳脂以及內(nèi)部組織中有 特定含量與種類的BCFA，這些BCFA主要是來自于反芻動物瘤胃中的細(xì)菌，還有一部分來源 于動物器官自身合成。支鏈脂肪酸在絕對大多數(shù)的植物中含量都很低，主要存在于植物體 表的蠟質(zhì)當(dāng)中。BCFA還是微生物細(xì)胞膜的主要成分（尤其是耐極端溫度微生物）。在人體 中，支鏈脂肪酸多存在于皮膚及其分泌物中，如胎皮脂（BCFA占干重的10~20% )。近年 來，各種研究證明BCFA是新生兒胃腸道的主要成分，與腸道菌群定植有關(guān)。BCFA在人體內(nèi) 部組織中含量很少（除了人眼瞼的瞼板腺），在人乳中含量最高可達(dá)1.5% (wt/wt)左右。
[0004] 由于特殊的支鏈結(jié)構(gòu)，支鏈脂肪酸及其衍生物具有特有的理化性質(zhì)，如較低的凍 點和傾點、良好的熱穩(wěn)定性和氧化穩(wěn)定性，其衍生物有較高的水解和溶解穩(wěn)定性，支鏈脂肪 酸及其鹽有較大的溶解度等。BCFA在體內(nèi)與直鏈酸不同的消化代謝途徑，使其具有獨特的 生理調(diào)控功能。油脂中的脂肪酸主要是由直鏈飽和脂肪酸、直鏈不飽和脂肪酸和一些含有 支鏈及特殊官能團(tuán)的脂肪酸組成的混合物。通常，前兩種脂肪酸含量在絕大多數(shù)油脂中占 主導(dǎo)地位，因此從混有直鏈脂肪酸的脂質(zhì)中直接分離檢測出含量極低的支鏈脂肪酸難度很 大。所以，有研究者們通過先去除其中的直鏈脂肪酸，將支鏈脂肪酸富集后再檢測。目前， 支鏈脂肪酸的分離富集方法都是用尿素甲醇/乙醇溶液結(jié)晶去除飽和直鏈脂肪酸，后用硝 酸銀硅膠薄層或者多次尿素溶液分離不飽和直鏈脂肪酸，富集得到支鏈脂肪酸含量相對較 高的脂肪酸混合物。這些溶劑法耗時2天以上，試劑消耗大，上樣量大，操作復(fù)雜，且直鏈脂 肪酸去除率低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本部分的目的在于概述本發(fā)明的實施例的一些方面以及簡要介紹一些較佳實施 例。在本部分以及本申請的說明書摘要和發(fā)明名稱中可能會做些簡化或省略以避免使本部 分、說明書摘要和發(fā)明名稱的目的模糊，而這種簡化或省略不能用于限制本發(fā)明的范圍。
[0006] 鑒于上述和/或現(xiàn)有支鏈脂肪酸微量分離富集方法中存在的問題，提出了本發(fā) 明。
[0007] 因此，本發(fā)明的一個目的是提供一種新型的支鏈脂肪酸微量分離純化方法，脂質(zhì) 經(jīng)過衍生化、尿素溶液包合、尿素硅膠薄層制備、尿素硅膠薄層分離、硝酸銀硅膠薄層制備、 硝酸銀硅膠薄層分離步驟制得支鏈脂肪酸含量相對很高的脂肪酸產(chǎn)品。
[0008] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：一種支鏈脂肪酸微量分離富集 方法，其原料經(jīng)過衍生化、尿素溶液包合、尿素硅膠薄層板制備、尿素硅膠薄層展開與提取、 硝酸銀薄層板制備、硝酸銀薄層展開與提取步驟，從天然可食用脂質(zhì)中富集得到支鏈脂肪 酸，其包括，
[0009] 將油脂原料衍生化為脂肪酸甲酯：取一定量油脂于試管，加入KOH-NaOH溶液， 65°C皂化30min，加入BF3-CH30H，70°C條件下酯化3~5min，加入正己烷后，再加入飽和 NaCl后取上層液體，加入無水硫酸鈉，離心10000rpm/5min，取上清，氮氣吹干得到脂肪酸 甲酯；
[0010] 尿素溶液包合：尿素按照體積比1 : 4比例加入到純甲醇中，于65°C加熱，待尿素 完全溶解，加入所述脂肪酸甲酯，攪拌溶解完全，繼續(xù)加熱20min后，冷卻到室溫，放置于低 溫下保存后，過濾分離尿素包合物，濾液用等體積石油醚萃取2次，每次萃取lOmin，石油醚 層用〇. 5倍量的5%NaCl溶液洗滌，石油醚層用無水硫酸鈉脫水后，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溶劑； [0011] 尿素硅膠薄層板制備：將硅膠薄層板，浸入尿素甲醇飽和溶液中，取出于通風(fēng)廚晾 干30min，制備得尿素硅膠薄層板，立即使用；
[0012] 尿素硅膠薄層展開與提取：取所述尿素溶液包合中分離得到的脂肪酸甲酯在尿 素硅膠薄層板上展開，點樣后待出現(xiàn)白色絡(luò)合物，覆蓋一層尿素甲醇飽和溶液，25°C烘干 5min，取出用第一展開劑展開，展開完畢，取出碘顯色，待碘揮發(fā)后，刮出RF= 0. 63~0. 76 處甲酯條帶，4mL無水乙醚提取，氮氣吹干；
[0013] 硝酸銀薄層板制備：在展開裝置的一側(cè)倒入乙腈，另一側(cè)倒入20%硝酸銀的乙腈 溶液，在所述20 %硝酸銀的乙腈溶液的一側(cè)放入硅膠薄層板，避光展開，展開完畢，取出避 光通風(fēng)櫥晾干，制備得硝酸銀硅膠薄層板；
[0014] 硝酸銀薄層展開與提?。簩⒛蛩毓枘z薄層板分離得到的脂肪酸甲酯溶于氯仿在硝 酸銀硅膠薄層板上用第二展開劑展開，取出碘顯色，待碘揮發(fā)后，刮出飽和脂肪酸條帶，無 水乙醚提取三次，氮氣吹干，富含支鏈脂肪酸的脂肪酸產(chǎn)品。
[0015] 作為本發(fā)明所述的支鏈脂肪酸微量分離富集方法的一種優(yōu)選方案，其中：所 述第一展開劑為正己烷、無水乙醚和乙酸，且滿足體積比正己烷：無水乙醚：乙酸= 80 ： 20 ： 1〇
[0016] 作為本發(fā)明所述的支鏈脂肪酸微量分離富集方法的一種優(yōu)選方案，其中：所述第 二展開劑為甲苯和正己烷，且滿足體積比甲苯：正己烷=40 : 60。
[0017] 作為本發(fā)明所述的支鏈脂肪酸微量分離富集方法的一種優(yōu)選方案，其中：所述尿 素溶液包合中，其中，加入所述脂肪酸甲酯，尿素與脂肪酸甲酯體積比例為4 : 1，包合溫度 為4°C，包合時間2h。
[0018] 作為本發(fā)明所述的支鏈脂肪酸微量分離富集方法的一種優(yōu)選方案，其中：所述尿 素硅膠薄層板制備中，尿素硅膠薄層板的浸泡時間為lmin，浸泡高度為8cm。
[0019] 作為本發(fā)明所述的支鏈脂肪酸微量分離富集方法的一種優(yōu)選方案，其中：所述尿 素硅膠薄層展開與提取中點樣，其點樣方式為脂肪酸甲酯中加入按質(zhì)量體積比為3 : 57的 尿素和甲醇。
[0020] 作為本發(fā)明所述的支鏈脂肪酸微量分離富集方法的一種優(yōu)選方案，其中：所述硝 酸銀薄層展開與提取中，飽和脂肪酸條帶的相對位移為RF= 0. 714~0. 857。
[0021] 本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明用尿素溶液包合預(yù)處理，用尿素硅膠薄層分離結(jié)合硝 酸銀硅膠薄層分離法，充分利用兩種分離方法的優(yōu)點同時互相彌補各自的缺點，能夠快速、 簡便，且在上樣量小的情況下，高效去除油脂中的直鏈脂肪酸，得到支鏈脂肪酸含量高的脂 肪酸產(chǎn)品的分離方法。
【具體實施方式】
[0022] 為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點能夠更加明顯易懂，下面對本發(fā)明的具體實 施方式做詳細(xì)的說明。
[0023] 在下面的描述中闡述了很多具體細(xì)節(jié)以便于充分理解本發(fā)明，但是本發(fā)明還可以 采用其他不同于在此描述的其它方式來實施，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不違背本發(fā)明內(nèi)涵的 情況下做類似推廣，因此本發(fā)明不受下面公開的具體實施例的限制。
[0024] 其次，此處所稱的"一個實施例"或"實施例"是指可包含于本發(fā)明至少一個實現(xiàn) 方式中的特定特征、結(jié)構(gòu)或特性。在本說明書中不同地方出現(xiàn)的"在一個實施例中"并非均 指同一個實施例，也不是單獨的或選擇性的與其他實施例互相排斥的實施例。
[0025] 實施例1
[0026] 以牛乳為原料，從牧場采集新鮮牛乳，-20°C運輸，凍存于_80°C冰箱備用。
[0027] 取10ml上述牛乳樣品于250ml燒瓶中，加入10ml無水乙醇，混合，加入25ml無水 乙醚，震蕩lmin，加入25ml石油醚震蕩30s，將上層液體倒入收集瓶。第二次抽提，步驟同 第一次將乙醇換成5ml，無水乙醚和石油醚換成15ml，收集上層液體。第三次抽提，步驟同 第二次，不加乙醇，收集上層液體。40°C真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)。
[0028]取 400mg牛乳脂于試管，加入 32mL0.5mol/LKOH-NaOH溶液，65°C皂化 30min， 加入32mLBF3-CH30H(1 : 3)，酯化3~5min(70°C)。加入4ml正己烷（色譜純），震蕩 3~4min。加入適量飽和NaCl，吸取上層于1. 5ml離心管中，加入少量無水硫酸鈉，離心 10000rpm/5min，取上清，氮氣吹干。
[0029] 尿素按照1 : 4比例加入到純甲醇中，于65°C水浴加熱，待尿素完全溶解，加入一 定量上述脂肪酸甲酯，攪拌溶解完全，繼續(xù)加熱20min后，冷卻到室溫，放置于低溫下保存 后，過濾分離尿素包合物。濾液用等體積石油醚萃取2次，每次萃取lOmin。石油醚層