褐色橘蚜幾丁質(zhì)合成酶基因及其dsRNA的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及昆蟲的生長發(fā)育調(diào)控和基因工程領(lǐng)域，特別涉及一種褐色橘蚜幾丁質(zhì) 合成酶基因及其dsRNA。
【背景技術(shù)】
[0002] 褐色橘姐（Toxoptera citricida)是一種世界性的柑橘害蟲，同時是柑橘衰退病 病毒的主要傳播媒介，對柑橘產(chǎn)量和品質(zhì)影響較大，目前化學(xué)防治仍是控制褐色橘蚜的重 要措施。化學(xué)農(nóng)藥施用不當(dāng)，不僅影響果品安全，同時還會導(dǎo)致嚴(yán)重的抗藥性。
[0003] RNA干擾（RNAinterference，RNAi)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種重要基因沉默手段，是 指在進(jìn)化過程中高度保守的、由雙鏈RNA(dsRNA，Double-strandedRNA，雙鏈核糖核酸） 誘發(fā)的、同源RNA高效特異性降解的現(xiàn)象，是通過dsRNA的介導(dǎo)特異性的降解對應(yīng)序列的 mRNA。由于使用RNAi技術(shù)可以特異性抑制特定基因的表達(dá)，所以該技術(shù)已被廣泛用于探索 基因功能和基因治療領(lǐng)域。
[0004] 幾丁質(zhì)是廣泛存在于自然界的一種含氮多糖類生物性高分子，主要的來源為蝦、 蟹、昆蟲等甲殼類動物的外殼與軟體動物的器官，以及真菌類的細(xì)胞壁等。在昆蟲中主要存 在于昆蟲表皮層中的上表皮以及消化道的圍食膜基質(zhì)中，昆蟲的變態(tài)發(fā)育依賴于體內(nèi)幾丁 質(zhì)生物合成和降解的精確控制。幾丁質(zhì)在生物體內(nèi)的合成是由一系列酶催化完成的，其中 幾丁質(zhì)合成酶（chitin synthase，CHS)在合成的最后一步起著關(guān)鍵作用，所以幾丁質(zhì)合成 酶的缺失可影響到昆蟲的正常生長發(fā)育，由于人類、高等動物、植物并不含有幾丁質(zhì)，故幾 丁質(zhì)合成途徑作為害蟲的靶標(biāo)相對安全，基于該途徑研發(fā)新型的殺蟲劑，應(yīng)用于害蟲的防 治具有很大的潛力，但是目前針對褐色橘蚜幾丁質(zhì)合成酶的相關(guān)研究較少，也未見針對褐 色橘蚜幾丁質(zhì)合成酶基因的dsRNA的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于克服已有技術(shù)的缺陷，提供一種褐色橘蚜幾丁質(zhì) 合成酶基因及其dsRNA。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0007] -種褐色橘蚜幾丁質(zhì)合成酶基因，其序列如SEQIDN0:3所示。
[0008] -種褐色橘蚜幾丁質(zhì)合成酶基因的dsRNA，其序列如SEQ ID NO: 6所示。
[0009] -種褐色橘蚜幾丁質(zhì)合成酶基因的dsRNA的合成方法，包括如下步驟：提取褐色 橘蚜的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成為cDNA作為擴(kuò)增模板，以序列為SEQIDN0:4的上游引物和以序列 為SEQIDN0:5的下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳后回收產(chǎn)物，以膠回收產(chǎn) 物為模板合成得到褐色橘蚜幾丁質(zhì)合成酶基因的dsRNA。
[0010] 在上述技術(shù)方案中，PCR擴(kuò)增時25μ1的PCR反應(yīng)體系包括：濃度為800-1200ng/ μ1 的cDNA模板 0· 5μ1，濃度為 0· 15-0. 25μΜ的上、下游引物各 1μ1，PrimeSTARMax Premix12. 5μ1以及去核酸酶水10μ1。
[0011] 在上述技術(shù)方案中，PCR反應(yīng)條件為：95°C預(yù)變性3min;95°C變性30s、60°C退火 10s、72°C延伸5min，共35個循環(huán)；72°C條件下延伸lOmin。
[0012] 本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明鑒定得到褐色橘蚜幾丁質(zhì)合成酶基因序列，并根據(jù) 該序列得到幾丁質(zhì)合成酶基因的dsRNA，可以應(yīng)用于對褐色橘蚜進(jìn)行RNA干擾從而起到防 治褐色橘蚜的效果。通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，該dsRNA基因沉默效率高，基因干擾后褐色橘蚜有明顯 表型變化，解決了褐色橘蚜目前沒有有效的幾丁質(zhì)合成酶基因的dsRNA的問題，在研發(fā)新 型殺蟲劑方面有很好的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0013] 圖1為褐色橘蚜CHS基因在NCBI中Protein Blast比對圖。
[0014] 圖2為褐色橘蚜及其它昆蟲幾丁質(zhì)合成酶系統(tǒng)發(fā)育樹圖。
[0015] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例中的飼喂dsRNA的裝置。
[0016] 圖4為褐色橘蚜飼喂CHS基因的dsRNA后的CHS基因相對表達(dá)量，其中PBS表示 對照組，dsTCiCHS表示實(shí)驗(yàn)組。
[0017] 圖5為褐色橘蚜飼喂CHS基因的dsRNA后的累積蛻皮率，其中PBS表示對照組， dsTCiCHS表示實(shí)驗(yàn)組。
[0018] 圖6為褐色橘蚜飼喂CHS基因的dsRNA后的累積死亡率，其中PBS表示對照組， dsTCiCHS表示實(shí)驗(yàn)組。
[0019] 圖7為褐色橘!??牙伺喂CHS基因的dsRNA后表型表現(xiàn)圖；其中1為實(shí)驗(yàn)組的不能正 常蛻皮死亡的褐色橘蚜，2為對照組的能夠正常蛻皮的褐色橘蚜。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 本發(fā)明實(shí)施例所用化學(xué)試劑來源如下：
[0021] LATaq MIX(Takara公司，日本）
[0022] TRIzol kit (Invitrogen公司，美國）
[0023] RNeasy Plus Micro Kit (QIAGEN公司，德國）
[0024] PrimeSTAR Max Premix(Takara公司，日本）
[0025] 膠回收純化試劑盒（Takara公司，日本）
[0026] Transcript Aid T7 High Yield Transcription Kit(Thermo fisher Scientific 公司，美國）
[0027] Perfect real time RT reagent (Takara公司，日本）
[0028] GoTaCj1? qPCR Master Mix(Promega公司，美國）
[0029] TranscriptAid Enzyme Mix (Thermo fisher Scientific公司，美國）
[0030] ATP/CTP/GTP/UTP Mix (Thermo fisher Scientific公司，美國）
[0031] PrimeScriptRT Enzyme Mix I (Thermo fisher Scientific公司，美國）
[0032] Oligo dT Primer (Thermo fisher Scientific公司，美國）
[0033] Random 6 mers (Thermo fisher Scientific公司，美國）
[0034] 實(shí)施例一、褐色橘蚜幾丁質(zhì)合成酶基因序列鑒定
[0035] 1)從褐色橘蚜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（西南大學(xué)昆蟲學(xué)與害蟲控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供）中查 找可能的幾丁質(zhì)合成酶Unigene序列，通過tBlastn，在轉(zhuǎn)錄組當(dāng)中查找到一條unigene序 列。
[0036] 2)利用RNA提取試劑盒RNeasyPlusMicroKit按照使用說明提取褐色橘蚜的總 RNA，然后利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PerfectrealtimeRTreagent按照使用說明將lyg總RNA 反轉(zhuǎn)錄成為cDNA。
[0037] 3)以上述得到的cDNA為模板，設(shè)計全長擴(kuò)增引物，利用上下游引物CHS-A和 CHS-S進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR條件為：95°C預(yù)變性3min;95°C變性30s、60°C退火10s、72°C延伸 5min，共35個循環(huán)；72°C條件下延伸lOmin。PCR反應(yīng)體系共25μ1，包括：濃度為lOOOng/ μ1 的cDNA模板 1μ1，濃度為(λ15-0. 25μΜ的上下游引物各 1μ1，LATaqMIX(λ25μ1， 10XBuffer(Mg2+plus) 3μ1，dNTP4μ1 以及去核酸酶水 14. 75μ1 ;引物CHS-A(如SEQID NO: 1所示）和CHS-S(如SEQIDNO:2所示）的序列如下：
[0038]CHS-A：ATGACGTCTCTCCAGCGT,
[0039] CHS-S：TCAGTTAATGGCGTGCAT〇
[0040] 4)將PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳中進(jìn)行分離，得到4700bp左右的條帶，將PCR 產(chǎn)物送測序公司進(jìn)行測序。
[0041] 5)將測序結(jié)果通過手工校對，序列拼接，并在NCBI中進(jìn)行ProteinBlast相似 性比對，比對結(jié)果如圖1所示，褐色橘姐幾丁質(zhì)合成酶基因與野豌豆姐（Apisglycines， 99% )的CHS基因同源性最高，然后是豌豆姐（Acyrthosiphonpisum，98% )CHS同源性次 之，也與半翅目的溫帶臭蟲有較高的同源性。
[0042] 6)通過氨基酸系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，如圖2所示褐色橘蚜的CHS基因氨基酸序列與 半翅目的蚜蟲，褐飛虱，白背飛虱的聚到一枝，確定得到的序列為褐色橘蚜幾丁質(zhì)合成酶基 因序列（如SEQIDN0:3所示）。
[0043] 實(shí)施例二、褐色橘蚜幾丁質(zhì)合成酶基因的dsRNA的合成
[0044] 1)根據(jù)褐色橘蚜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（西南大學(xué)昆蟲學(xué)與害蟲控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供）， 設(shè)計擴(kuò)增幾丁質(zhì)合成酶（CHS)基因的上下游引物T7-CHS-S1 (如SEQIDN0:4所示）、 T7-CHS-A1 (如SEQID勵:5所示），合成引物，引物序列分別為：
[0045]T7-CHS-S1：
[0046]TAATACGACTCACTATAGGGAGACGTAAAAACTGAAGAC；
[0047]T7-CHS-A1：
[0048]TAATACGACTCACTATAGGGCGTCCATGAAAATGTGAGT。
[0