紅平紅球菌幾丁質(zhì)脫乙酰基酶及其構(gòu)建方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體的說(shuō)是一種紅平紅球菌幾丁質(zhì)脫乙?；讣?其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 幾丁質(zhì)（chitin)是由N-乙酰氨基葡萄糖以0-1，4糖苷鍵連接而成的多聚體，是 天然多糖中十分重要的一類(lèi)，其數(shù)量?jī)H次于世界上資源最豐富的纖維素，但其利用價(jià)值比 纖維素更高，是自然界中數(shù)量第二多的的含氮類(lèi)有機(jī)化合物，被歐美學(xué)術(shù)界稱(chēng)為世界第六 生命要素。很多類(lèi)似于蝦蟹等節(jié)肢動(dòng)物的外殼里都存在幾丁質(zhì)；像昆蟲(chóng)、動(dòng)物體表及消化道 里也含有豐富的幾丁質(zhì)。
[0003] 據(jù)估計(jì)，自然界中的幾丁質(zhì)生物合成量超過(guò)1000億噸，而人類(lèi)每年所需幾丁質(zhì)的 量也高達(dá)3. 7X 104噸，主要是海洋動(dòng)物產(chǎn)品加工的廢棄物。另外，海洋中產(chǎn)生的大量廢棄 物中，幾丁質(zhì)將近一億噸，而且海洋生物圈中產(chǎn)生的幾丁質(zhì)占全球幾丁質(zhì)總量的絕大部分， 可以說(shuō)是一種取之不盡的生物寶庫(kù)。
[0004] 而殼聚糖(脫乙酰甲殼素，chitosan)是幾丁質(zhì)的一類(lèi)最重要的衍生物，也是自然 存在的唯一一種堿性多糖，可以應(yīng)用于食品、化妝品、紡織、醫(yī)療、印染、保健、廢水處理等許 多領(lǐng)域，其利用價(jià)值很高，是市場(chǎng)推廣和產(chǎn)品研發(fā)的有力組成部分。
[0005] 目前工業(yè)上生產(chǎn)殼聚糖普便采用強(qiáng)堿熱化學(xué)法，該方法生產(chǎn)殼聚糖存在較多的缺 陷和不足，主要包括以下幾方面：生產(chǎn)過(guò)程耗能大、消耗大量強(qiáng)堿，嚴(yán)重污染環(huán)境，不能獲得 質(zhì)量均一、具有特定脫乙酰度的殼聚糖等。幾丁質(zhì)脫乙酰酶能夠催化幾丁質(zhì)生成殼聚糖，具 有工藝條件溫和、環(huán)境友好、產(chǎn)品質(zhì)量高等優(yōu)點(diǎn)。采用幾丁質(zhì)脫乙酰酶生產(chǎn)殼聚糖則可以解 決強(qiáng)堿熱化學(xué)法制備殼寡糖的諸多缺陷和不足，生產(chǎn)出質(zhì)量均一、性能穩(wěn)定的殼聚糖，滿(mǎn)足 生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域?qū)ぞ厶堑母哔|(zhì)量要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明目的在于提供一種紅平紅球菌幾丁質(zhì)脫乙?；讣捌錁?gòu)建方法和應(yīng)用。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0008] 一種紅平紅球菌幾丁質(zhì)脫乙?；?，紅平紅球菌（Rhodococcus erythropolis HG05)幾丁質(zhì)脫乙?；福╟hitin deacetylase，CDA)氨基酸序列為SEQ ID NO. 2所示，或 者
[0009] 在SEQ ID NO. 2中限定的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或者幾個(gè)氨基 酸且仍具有幾丁質(zhì)脫乙?；富钚缘挠蒘EQ ID N0. 2衍生出來(lái)的蛋白質(zhì)。
[0010] 所述紅平紅球菌幾丁質(zhì)脫乙?；妇幋a的基因核苷酸序列為SEQ ID NO. 1所示。
[0011] 紅平紅球菌幾丁質(zhì)脫乙?；傅臉?gòu)建方法：
[0012] 1)構(gòu)建 RhErCDA 重組表達(dá)載體質(zhì)粒 pCT7-CHISP6H-RhErCDA ;
[0013] 2)將步驟1)所得重組表達(dá)載體質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌宿主細(xì)胞（BL21 (DE3))，進(jìn)行誘 導(dǎo)表達(dá)，獲得表達(dá)產(chǎn)物；
[0014] 3)以金屬螯合層析柱分離純化步驟2)所得到的重組蛋白，即SEQ ID N0. 2中氨基 酸所示的重組幾丁質(zhì)脫乙?；?；或者
[0015] 在SEQ ID N0. 2中限定的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或者幾個(gè)氨基 酸且仍具有幾丁質(zhì)脫乙?；富钚缘挠蒘EQ ID N0. 2衍生出來(lái)的蛋白質(zhì)。
[0016] 所述步驟3)中以金屬螯合層析柱一步法純化獲得電泳純的SEQ ID N0. 2中氨基 酸所示的重組RhErCDA。
[0017] 紅平紅球菌幾丁質(zhì)脫乙?；福≧hErCDA)的應(yīng)用，所述重組RhErCDA可用于制備 殼聚糖。
[0018] 本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明獲得了紅平紅球菌幾丁質(zhì)脫乙?；窻hErCDA基 因序列，并在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)其高效分泌表達(dá)以及一步法純化重組RhErCDA。所得重組 RhErCDA的脫乙?；钚裕瑸槊阜ㄖ苽錃ぞ厶枪に嚨拈_(kāi)發(fā)與應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。具體的說(shuō)本發(fā) 明重組RhErCDA的獲得對(duì)幾丁質(zhì)資源的深度開(kāi)發(fā)與高值化利用具有重要的理論意義和實(shí) 踐意義。
【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的RhErCDA基因推導(dǎo)的氨基酸序列特征。
[0020] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的誘導(dǎo)表達(dá)的重組RhErCDA酶解實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中，A為未 涂布重組RhErCDA室溫放置7天后的4-硝基乙酰苯胺固體平板；B為涂布重組RhErCDA室 溫放置7天后的4-硝基乙酰苯胺固體平板。
[0021] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例提供的分離純化的重組RhErCDA的SDS-PAGE分析結(jié)果圖，其 中，M為蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量；P為咪唑洗脫樣品。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 下面實(shí)施例中將對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述，但本發(fā)明不限于此。
[0023] 實(shí)施例1 :紅平紅球菌幾丁質(zhì)脫乙酰基酶基因的克隆
[0024] 以NCBI中提供的4個(gè)R. erythropolis全基因組序列中注釋為幾丁質(zhì)脫乙?；?(chitin deacetylase，CDA)的序列信息設(shè)計(jì)引物用于擴(kuò)增R.erythropolis HG05的幾丁 質(zhì)脫乙醜基酶基因。引物具體為：
[0025] RhErCDA-dF ：ATGGACCGCCGACGCTTCCTC
[0026] RhErCDA-dR : TCACGGCTTCAGATARACAT (R 代表 A/G)
[0027] 以菌體 R. erythropolis HG05 作為模板（R. erythropolis HG05 為紅平紅球菌 (Rhodococcus erythropolis),并利用響應(yīng)面分析的方法對(duì)其產(chǎn)酶條件進(jìn)行了優(yōu)化（Sun YY，Zhang JQ, Wu SJ, Wang SJ. Statistical optimization for production of chitin deacetylase from Rhodococcus erythropolis HG05. Carbohydrate Polymers, http:// dx. doi. org/10. 1016/j. carbpol. 2013. 11. 010)〇 )〇
[0028] PCR 的反應(yīng)體系為：模板 1 u L ;5u L10XPCR buffer，2u L dNTP(10mmol/L)，2u L 引物 RhErCDA-dF (10 u mol/L)，2 u L 引物 RhErCDA-dR (10 u mol/L)，1 U L Taq DNA 聚合酶 (5U/u L)，加 ddH20 補(bǔ)至體積 50 u L。PCR 反應(yīng)條件：95t：預(yù)變性 5min ;95t：變性 30s，55DC 退火30s，72°C延伸2min，30個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin。利用1%的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR擴(kuò) 增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，將PCR產(chǎn)物切膠，利用瓊脂糖凝膠純化試劑盒回收，回收PCR產(chǎn)物連 接PMD19-T載體(按照使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行)，16°C連接30min。將連接產(chǎn)物（pMD19-RhErCDA)轉(zhuǎn) 化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，涂布含有l(wèi)〇〇ii g/mL氨芐青霉素的LB固體平板，37°C培養(yǎng) 過(guò)夜，以M13-F/M13-R為引物對(duì)，利用PCR方法對(duì)LB平板上的單克隆進(jìn)行檢測(cè)，將PCR檢測(cè) 陽(yáng)性克隆搖囷后進(jìn)彳丁 DNA測(cè)序。測(cè)序結(jié)果如SEQ ID NO. 1中喊基序列所不：
[0029] ATGGACCGCCGACGCTTCCTCAGTGCCCTCGCAGCAGCAACTCTGACCGGAACCGCCGCGGTGACCATG GGAACCGCTTGTTCGTCACGTTCGGTCGGCACGGCAATCGCCGCAGCCGACGAACCAACCGACCCCGTCCCGGTCCC GGATCTCCCGCCTGCCTTGTTGCCGCCTCCACCGCCGTCTGCCCGGGTGCCGCTGCCCGCCGGCGGATCGTTGACCG CGTTACCCGGCGGTGGGGATCTGTTTGCCCTGACGGTTGACGACGGAGCCAGCTCCGAAGTCGTGCGCCTCTACACA CAGTTCGCAAAAGACACCGGCATCCGTTTGACGTACTTCGTAAACGGGCAATACAACTCGTGGACCGAAAACGCCGG ACTTCTCAGACCGCTGGTCGAGAGCGGACAAATTCAGCTCGGCAATCACACCTAC