黃瓜雄性不育基因相關snp標記及應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子遺傳育種技術領域，具體地說，涉及黃瓜雄性不育基因相關SNP的 標記及應用。
【背景技術】
[0002] 黃瓜(CucumissativusL)是我國最重要的蔬菜作物之一，在科技部 五"國 家科技支撐計劃開展的"主要蔬菜作物雄性不育育種關鍵技術集成與良種產(chǎn)業(yè)化"重點項 目中，黃瓜被列為重要攻關項目。雄性不育基因在很多作物中都有發(fā)現(xiàn)，但是，在國內(nèi)外的 文獻報道中，至今極少發(fā)現(xiàn)有關黃瓜雄性不育基因的報道，更沒有與黃瓜雄性不育基因任 何相關標記的開發(fā)。
[0003] 2012年春我們首次在一個高代自交系里發(fā)現(xiàn)了黃瓜雄性不育突變體，經(jīng)驗證，該 不育性狀由細胞核隱性基因控制，雄性不育在其他作物中報道很多，但罕有黃瓜雄性不育 的報道。以往定位一個新基因的方法，通常利用已有的1^0、50六1^?1^、551?等分子標記開 發(fā)的引物，在差異性狀的植物基因組中，大量的擴增，跑膠，篩選差異的條帶，需要耗費大量 的人力，物力和時間，也只能是將基因初步定為在一個很寬的區(qū)域，不能精細的定位一個基 因。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明采用重測序與集群分離分析相結合的方法，精細的定位了此次黃瓜雄性不 育基因，為不育基因的克隆打下良好的基礎。本發(fā)明具有快速、簡便、穩(wěn)定、可靠、低成本、不 受環(huán)境條件影響等優(yōu)點，不僅為黃瓜花粉發(fā)育的研究提供理論基礎，也在黃瓜雜交育種中 具有很大的應用價值。
[0005]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明公開了如下的技術內(nèi)容： 一種黃瓜雄性不育性相關基因SNP的特異性引物，其核苷酸序列如下所示： 引物對1: 正向引物：5 'AGCCATCAAAATCCAAGCTTGTT3 ' 反向引物：5'TTTTGAGTCTTCTAGTTATCGCGTA3' 引物對2: 正向引物：5 'AGCCATCAAAATCCAAGCTTGTT3 ' 反向引物：5 'TTTTGAGTCTTCTAGTTATCGTGGC3。
[0006]本發(fā)明進一步公開了黃瓜雄性不育性相關基因SNP的特異性引物進行標記的方 法，其特征在于按如下的步驟進行： (1)將"YL-5"雄性不育系為母本與遠緣品種"D37-1"為父本進行雜交，得到雜種F1，由 雜種F1自交得到F2代群體，F(xiàn)2代分離群體中存在雄性可育和雄性不育兩種表型； (2 )通過CTAB法提取父本，母本，F(xiàn)2代每個單株基因組DNA，形成4個混池，對這4個混池 的DNA進行重測序，對測序得到的原始雙端序列進行質量評估并過濾得到清晰讀數(shù)，將清晰 讀數(shù)與參考基因組序列進行比對，基于比對的結果，使用GATK軟件包進行SNP的檢測和注 釋； (3) 根據(jù)SNP的檢測結果，篩選兩個混池間有差異的堿基位點，混池間不一致或為雜合 型的SNP位點，并確定SNP在基因組中的位置，以及是否引起基因的非同義突變，從而影響編 碼的蛋白序列，性狀相關侯選區(qū)域的選擇通過混池的基因型頻率差異進行篩選，使用SNP-index關聯(lián)算法選擇候選區(qū)域； (4) 根據(jù)篩選出的SNP位點，使用軟件WebSNAPER設計等位基因特異PCR引物，開發(fā)了與 不育性狀相關的共顯性SNP分子標記;設計時要求引物長度為17-25bp，復性溫度50-62 °C，GC含量為40-60%，利用引物3'端錯配策略將引物3'端的第2-4位堿基進行 一個堿基的錯配處理，有效區(qū)分了該位點在雙親間的差異，鑒定黃瓜的育性。
[0007]本發(fā)明更進一步公開了黃瓜雄性不育性相關基因SNP的特異性引物在精細定位黃 瓜雄性不育基因區(qū)域方面的應用；其中的適用于選育雄性不育黃瓜的共顯性SNP分子標記 的核苷酸序列如下所示： 引物對1: 正向引物：5 'AGCCATCAAAATCCAAGCTTGTT3 ' 反向引物：5'TTTTGAGTCTTCTAGTTATCGCGTA3' 引物對2: 正向引物：5 'AGCCATCAAAATCCAAGCTTGTT3 ' 反向引物：5 'TTTTGAGTCTTCTAGTTATCGTGGC3。
[0008] 實驗結果表明：采用該方法對黃瓜基因組DNA進行PCR擴增，根據(jù)條帶的有無， 和深淺對比，可以在苗期甚至萌芽時期有效鑒別黃瓜的育性，更好的應用于雜交育種中不 育黃瓜植株的篩選，可免去大量的田間測試工作，提高選擇效率，還可以通過分子標記進行 聚合育種，再和轉基因技術相結合，最終實現(xiàn)品種設計育種理念的新突破。 本發(fā)明的技術關鍵點在于:雄性不育性狀的本身。以及通過重測序與集群分離分析方 法結合的方法定位不育基因，研究結果表明：這種方法可以快速有效地得到與不育性狀相 關的基因及與基因相關聯(lián)的SNP標記，進而為基因的精細定位、克隆轉化、苗期育性的鑒定 以及雜交優(yōu)勢育種奠定基礎。
[0009] 本發(fā)明公開的黃瓜雄性不育基因相關的SNP分子標記與現(xiàn)有技術相比所具有的積 極效果在于： (1)本發(fā)明利用重測序與BSA相結合的方法，只用了 4個月就可以獲得雄性不育相關分 子標記和精細定位區(qū)域，周期短、成本低、效率高，可為在其他物種中開發(fā)功能性分析標記 提供重要的成功案例，也為分子育種、系統(tǒng)進化、種質資源鑒定中分子標記提供了一種重要 的開發(fā)途徑。
[0010] (2)SNP的密度比微衛(wèi)星標記更高，可以在任何一個待研究基因的內(nèi)部或附近提 供一系列標記；由于SNP的二態(tài)性，非此即彼，在基因組中SNP往往只需+/-的分析，而不 用分析片段的長度，利于發(fā)展自動化技術篩選SNP，節(jié)省研究時間；與SSR位點相比，SNP 是高度穩(wěn)定的；由于處于基因編碼區(qū)的SNP(cSNP)，可能會直接影響產(chǎn)物蛋白質的結構或 基因表達水平，因此它們可能代表某些遺傳機理中的一些作用因素。
[0011] (3)目前，在作物育種中已經(jīng)應用的分子標記絕大多數(shù)是與某個基因或某個性狀 連鎖的側翼標記，并非功能基因自身的分子標記。因而，這些標記的絕大多數(shù)在實際意義上 不能與目標基因共分離，選擇效率在很大程度上受標記與目標基因遺傳距離的限制，在分 子標記輔助選擇中具有較大的局限性。而我們開發(fā)的SNP標記直接標記目標基因本身，使研 究者直接通過功能分子標記選擇目標基因，能夠極大地提高分子標記選擇的效率。
[0012]【附圖說明】： 圖1:為SNP分子標記在F2分離群體中的驗證； 注：圖1中，F(xiàn)代表父本，純合可育;Μ代表母本，不育；1 -22代表F2代單株，其中1、3、4、5、 18、20、21為純合可育，6、7、9、14、15、16、22為雜合可育，2、10、11、12、13、17、19為不育。每個 樣本左邊條帶顯示為引物對Chr3-320626[T/G]-l-2擴增結果，右邊條帶為顯示引物對 Chr3-320626[T/G]-3-2 擴增結果； 圖2:SNP-index在全基因組上的分布圖；注：橫坐標表示染色體的位置;縱坐標表示SNP測序深度值；圖中散點表示計算得到混池之間基因型頻率的顯著差異值；圖中曲線表示 混池之間基因型頻率的顯著差異值的擬合值;水平虛線表示擬合值為99%的閾值線； 圖3 :各類型變異在染色體的分布;注:從外到里依次為:染色體坐標、SNP密度分布、InDel密度分布在基因組上的分布(單位為兆）； 圖4:重測序生物分析流程圖。
[0013]
【具體實施方式】
[0014] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條 件所述的條件進行。其中"YL-5"雄性不育系（出自天津市農(nóng)科院武清實驗田的一種高代自 交系）、"D37-1"（出自天津市農(nóng)科院武清實驗田的一種高代自交系）均出自天津科潤黃瓜 研究所(對外可免費提供）。
[0015] 實施例1: 黃瓜雄性不育性狀相關的SNP分子標記的獲得，包括以下步驟： (1)將"YL-5"雄性不育系為母本與遠緣品種"D37-1"為父本進行雜交，得到雜種F1，由 雜種F1自交得到F2代群體，F(xiàn)2代分離群體中存在雄性可育和雄性不育兩種表型(方法參見 河南農(nóng)業(yè)科學，2012,（41)11:14-18,侯磊磊）。
[0016] (2 )通過CTAB法提取父本，母