ssembly產(chǎn)物2μ1，補助超純水至50μ1)和擴增程序進行擴增(98°C30s;25個循 環(huán) 98°C10s，55 ~65°C20 ~30s，72°C15 ~30s/kb;72°C5min 延伸），最終獲得 usp45-egl3 融合 基因。整個合成過程以及合成過程中所涉及的引物均由該公司設(shè)計完成。
[0036] 2、usp45-egl3融合基因中各構(gòu)成基因的相似性分析
[0037] usp45-egl3融合基因克隆到載體pGHn中，熱激法轉(zhuǎn)化到E.coli ToplO感受態(tài)細(xì) 胞，挑取單菌落，經(jīng)菌體P C R (上游引物： GCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGATTAGTTGATAGA;下游引物： CGTTTCAGCAGAAAAATTCGTAATTCGAGCTC; PCR 程序是：95°C 預(yù)變性 5min，95°C 變性 30 秒，59°C 退 火20秒，72°C延伸1分鐘，30個循環(huán)，72°C保持10分鐘。），用OMEGA質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒， Xba I單酶切，Sma I和Xba I雙酶切鑒定后將陽性克隆子送到上海英濰捷基生物科技有限 公司測序，并與文獻基因進行序列比對，分析相似性。
[0038] 其中單酶切體系如下：總DNA 5yg，10XBuffer 50yl，Xba I酶5μ1，超純水補齊體 系至500μ1，混合均勻后，37°C酶切9〇11^11。1 %瓊脂糖電泳30min，如圖1。
[0039] 其中雙酶切體系如下：總DNA 5yg，10XBuffer 50yl，Sma I酶和Xba I酶各5μ1,超 純水補齊體系至500μ1，混合均勻后，30°C酶切90min，37°C酶切90min。酶切產(chǎn)物通過1%瓊 脂糖電泳30min后分離分子量較小的條帶，如圖1。
[0040] 采用Omega D2500-01瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收分子量較小的條帶，測序分析后 獲得正確序列的usp45-egl3融合基因，如圖2。
[0041] 3、分泌型表達質(zhì)粒的構(gòu)建
[0042] 采用Takara Ligation Kit Ver · 2 · 1試劑盒將測序正確的usp45_egl3片段與經(jīng) Sma I和Xba I雙酶切的pMG36e質(zhì)粒過夜連接;采用T4DNA連接酶連接后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到 感受態(tài)E.coli DH5a中并涂于含有300yg/mL紅霉素的LB固體培養(yǎng)基進行篩選。將陽性轉(zhuǎn)化 子菌體PCR擴增、提取質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，得陽性菌株E. coli DH5a/pMG36e-usp45-egl3。
[0043] 4、重組大腸桿菌表達β-l，4_葡聚糖內(nèi)切酶的效果
[0044] β-l，4-葡聚糖內(nèi)切酶活性檢測采用剛果紅染色法，具體步驟如下：將E. coli DH5 a/pMG36e-usp45-egl3和E. coli DH5a/pMG36e菌液接種到含有質(zhì)量體積比為0.5% (W/V，g/ mL)羧甲基纖維素鈉、250yg/mL紅霉素的LB固體培養(yǎng)基37°C培養(yǎng)36h后，加入0.1%(W/V，g/ mL)剛果紅溶液覆蓋平板表面，室溫下染色20min后倒掉剛果紅溶液，加入適量lmol/L的 NaCl溶液室溫下脫色反應(yīng)20min后觀察不同菌落周圍是否有水解圈。DNS法分析E.coli DH5 a/PMG36e-uSp45-egl3表達出的β-l，4-葡聚糖內(nèi)切酶的活性：以羧甲基纖維素鈉為底物，在 pH 6.0的醋酸緩沖液中50°C反應(yīng)15min，在520nm下測定其吸光值，分析所產(chǎn)生的葡萄糖含 量。重組大腸桿菌E. coli DH5a/pMG36e-usp45-egl3產(chǎn)β-l，4-葡聚糖內(nèi)切酶的活性:β-l，4-葡聚糖內(nèi)切酶每分鐘水解羧甲基纖維素鈉產(chǎn)生Ιμπιο 1葡萄糖的酶量定義為1個酶活單位。從 圖3可見，重組大腸桿菌E.coliDH5a/pMG36e-usp45-egl3菌株在0.5%羧甲基纖維素鈉培 養(yǎng)基上呈現(xiàn)清晰的水解圈，而E.coli DH5a/pMG36e_egl3和E.coli DH5a/pMG36e周圍均未 見水解圈，說明重組大腸桿菌E.coli DH5a/pMG36e-usp45-egl3分泌了活性β-1，4-葡聚糖 內(nèi)切酶。綜上所述，成功獲得了分泌表達β-l，4-葡聚糖內(nèi)切酶的重組大腸桿菌E. co 1 i DH5 a/pMG36e_usp45_egl3菌株。如表 1，重組大腸桿菌Ε· coli DH5a/pMG36e-usp45_egl3菌培養(yǎng) 14h后，其產(chǎn)生β-1，4-葡聚糖內(nèi)切酶的活性達到最高。β-1，4-葡聚糖內(nèi)切酶分泌到細(xì)胞外的 活性為226mU/mL，分泌到細(xì)胞內(nèi)的活性為535mU/mL。
[0045] 表1重組大腸桿菌分泌β-1，4_葡聚糖內(nèi)切酶的活性
[0046]
[0047]注:相應(yīng)煮沸失活的樣品為對照
[0048] 5、重組大腸桿菌分泌的β-l，4_葡聚糖內(nèi)切酶降解纖維素的能力 [0049] 米用羧甲基纖維素鈉糖化力法評價重組大腸桿菌E. coli DH5a/pMG36e-usp45-egl3分泌的β_1,4-葡聚糖內(nèi)切酶降解纖維素的能力。取重組大腸桿菌E. coli DH5a/ pMG36e_usp45_egl3 產(chǎn) β_1,4-葡聚糖內(nèi)切酶穩(wěn)定期（12h，14h 和 16h)的菌液 lmL，8000r/min， 4°C離心10min，獲得上清液。采用羧甲基纖維素鈉糖化力法，分析重組大腸桿菌E.coli DH5 a/PMG36e-USp45-egl3分泌到細(xì)胞外的β-1，4-葡聚糖內(nèi)切酶降解羧甲基纖維素鈉產(chǎn)生還原 糖的速率。如圖4,培養(yǎng)12h，14h和16h后，重組大腸桿菌E.coli DH5a/pMG36e-usp45-egl3產(chǎn) 生的β-1，4-葡聚糖內(nèi)切酶降解羧甲基纖維素鈉生成還原糖的速率分別為2.07，2.53和 2.45mg/h · mL，平均速率為2.35mg/h · mL。
[0050] 6、β_1，4-葡聚糖內(nèi)切酶表達分析
[0051 ] DH5a/pMG36e-usp45_egl3在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)14小時后至對數(shù)中期， lOOOOrpm，4°C，離心10min，收集上清液。三氯乙酸法在濾液中加入1/4體積的10 % (W/V，g/ mL)的三氯乙酸，充分混勾，冰上沉淀蛋白lh后，12000rpm，離心15min，棄上清，收集沉淀。用 預(yù)冷的丙酮將沉淀洗滌3次，12000rpm離心15min，倒掉丙酮，在通風(fēng)廚中揮發(fā)殘余的丙酮。 取適量的去離子水將沉淀或菌體重懸，加等體積的2 X上樣緩沖液，混勻，于沸水中沸煮 10min，離心。各取10μ1上清液和菌體樣品液，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE)。如圖6，結(jié)果表明，該重組大腸桿菌E. co 1 i DH5a/pMG36e-usp45-egl3產(chǎn)β-l，4-葡聚糖內(nèi)切酶的分子量約為25kDa。
[0052] Okada等發(fā)現(xiàn)大腸桿菌中表達egl3基因的活性約25mU/ml，且不能分泌到細(xì)胞外。 與Okada等的結(jié)果相比較，產(chǎn)β-1，4-葡聚糖內(nèi)切酶的活性提高了4.52倍。綜上所述，成功構(gòu) 建了Ε·coli DH5a/pMG36e-usp45_egl3重組功能菌。所構(gòu)建的Ε·coli DH5a/pMG36e_usp45-egl3功能菌能將β-1，4-葡聚糖內(nèi)切酶分泌到細(xì)胞外，有效地降解了羧甲基纖維素鈉，所分 泌的β-l，4_葡聚糖內(nèi)切酶分子量約為25kDa，氫基酸序列見SEQ ID如.2，活性為2261111]/1111。
【主權(quán)項】
1. 一種融合基因usp45-eg13,它包含乳酸乳球菌分泌蛋白基因usp45的基因片段和瑞 氏木霉β-1，4-葡聚糖內(nèi)切酶基因egl3中編碼成熟蛋白的核苷酸序列，其核苷酸序列為SEQ IDNo.l，全長為738bp。2. 同權(quán)利要求1所述的融合基因usp45-egl3核苷酸序列同源性大于50%的核苷酸序列 或權(quán)利要求1所述的融合基因usp45-egl3核苷酸序列的互補序列。3. 權(quán)利要求1所述的融合基因usp45-egl3在表達β-1，4-葡聚糖內(nèi)切酶中的應(yīng)用。4. 權(quán)利要求1~3中任意一項所述的融合基因usp45-egl3所編碼的融合蛋白，其氨基酸 序列為SEQIDNo.2,全長為245個氨基酸。5. 含有權(quán)利要求1~3中任意一項所述融合基因usp45-egl3的表達盒、重組表達載體、 轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或轉(zhuǎn)基因重組菌。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組表達載體，其特征在于為將所述的融合基因uSp45-egl3 亞克隆至pMG36e原核表達載體中，構(gòu)建出的重組表達載體pMG36e-usp45-egl3。7. 含權(quán)利要求6所述的重組表達載體pMG36e-usp45-egl3的轉(zhuǎn)基因重組菌E.coliDH5 a/pMG36e_usp45_egl3。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的轉(zhuǎn)基因重組菌E.coliDH5a/pMG36e-usp45-egl3，其特征在于 其構(gòu)建流程如下:采用重疊延伸PCR合成技術(shù)合成正向帶有SmaI，反向帶有XbaI酶切位點 的usp45-egl3融合基因；將經(jīng)SmaI和XbaI雙酶切后的usp45-egl3融合基因和同樣用這兩 種酶切好的克隆載體pGHn質(zhì)粒在DNA連接酶作用下進行連接，獲得質(zhì)粒pGHn-usp45-egl3; 將質(zhì)粒pGHn-usp45-egl3克隆到ToplO大腸桿菌并獲取陽性克隆，提取陽性克隆的質(zhì)粒并酶 切回收正確的usp45-egl3融合基因，亞克隆至pMG36e原核表達載體中，構(gòu)建出重組載體 pMG36e_usp45_egl3，米用熱激法轉(zhuǎn)化至DH5a構(gòu)建重組大腸桿菌E.coliDH5a/pMG36e_ usp45_egl3〇9. 權(quán)利要求1中所述的融合基因usp45-cbh2及權(quán)利要求7中所述的表達盒、重組表達載 體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或轉(zhuǎn)基因重組菌在制備β-1，4-葡聚糖內(nèi)切酶及水解纖維素中的應(yīng)用。10. 權(quán)利要求7或8所述的轉(zhuǎn)基因重組菌E.coliDH5a/pMG36e-usp45-egl3在分泌表達 β-1，4-葡聚糖內(nèi)切酶蛋白質(zhì)中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明屬于應(yīng)用工業(yè)微生物領(lǐng)域。公開了一種融合基因usp45-egl3及其所編碼的蛋白和應(yīng)用，它包含乳酸乳球菌分泌蛋白基因usp45的基因片段和瑞氏木霉β-1,4-葡聚糖內(nèi)切酶基因egl3中編碼成熟蛋白的核苷酸序列，其核苷酸序列為SEQ？ID？No.1，全長為738bp，編碼245個氨基酸。利用該融合基因構(gòu)建的工程菌株能高效分泌表達β-1,4-葡聚糖內(nèi)切酶，產(chǎn)酶活性為226mU/ml，能夠有效地降解羧甲基纖維素鈉。生產(chǎn)的酶制劑安全，能夠有效利用纖維素，可用于食品、能源、醫(yī)藥、飼料、紡織、洗滌等工業(yè)，具有可觀的經(jīng)濟效益。
【IPC分類】C12N9/42, C12N15/56, C12R1/19, C07K19/00, C12N15/31, C12N15/62, C12N15/70, C12N1/21
【公開號】CN105441468
【申請?zhí)枴緾N201510890755
【發(fā)明人】劉秦華, 邵濤, 王思然, 董志浩, 原現(xiàn)軍
【申請人】南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2016年3月30日
【申請日】2015年12月7日