突變檢測(cè)分析的制作方法
【專利說明】突變檢測(cè)分析
[00011本申請(qǐng)是2011年11月2日提交的同名發(fā)明專利申請(qǐng)201180053023.3的分案申請(qǐng)。 [0002]【相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用】
[0003] 本申請(qǐng)要求2010年11月15日遞交的美國專利申請(qǐng)系列號(hào)12/946,752的申請(qǐng)日的 優(yōu)先權(quán)，該申請(qǐng)公開的內(nèi)容通過引用的方式并入本文。
[0004]【背景】
[0005]人類基因組中的一些點(diǎn)突變與疾病有直接關(guān)聯(lián)。例如，發(fā)現(xiàn)一些生殖系KRAS突變 與努南綜合征（Schubbert等人Nat.Genet· 2006 38:331-6)和心-面-皮膚綜合征(附;111〇1^ 等人.Nat.Genet. 2006 38: 294-6)相關(guān)聯(lián)。同樣，發(fā)現(xiàn)體細(xì)胞的KRAS突變?cè)诎籽?、結(jié)直腸 癌（Burmer等人·Proc·Natl·Acad·Sci· 1989 86 : 2403-7)、膜腺癌（Almoguera等人·Cel1 1988 53:549-54)和肺癌（Tam等人.Clin.CancerRes.200612:1647-53)中高頻出現(xiàn)。人類 基因組中有許多點(diǎn)突變與疾病沒有明顯的致病關(guān)聯(lián)。
[0006]點(diǎn)突變的檢測(cè)方法可用于，例如，提供與點(diǎn)突變相關(guān)聯(lián)的疾病的診斷。
[0007]【概述】
[0008]本發(fā)明提供樣品分析的方法。在某些實(shí)施方案中，所述方法包括:a)從樣品擴(kuò)增產(chǎn) 物以產(chǎn)生擴(kuò)增的樣品，所述樣品包含基因組座位的野生型拷貝和所述基因組座位的突變體 拷貝，所述突變體拷貝相對(duì)于所述基因組座位的所述野生型拷貝具有點(diǎn)突變，其中擴(kuò)增 使用第一引物和第二引物完成；以及ii.第一引物包含與所述點(diǎn)突變堿基配對(duì)的3'末端核 苷酸，還包含與所述基因組座位中除了在所述3'末端核苷酸6個(gè)堿基內(nèi)具有單個(gè)堿基錯(cuò)配 之外的序列完全互補(bǔ)的核苷酸序列;和b)使用活瓣分析(flapassay)檢測(cè)所述擴(kuò)增的樣品 中所述產(chǎn)物的存在，所述活瓣分析采用侵入寡核苷酸。本發(fā)明還提供進(jìn)行所述方法的試劑 盒。 【【附圖說明】】
[0009]圖1示例性說明了活瓣分析的一些一般原則。
[0010]圖2示例性說明了所述方法的一個(gè)實(shí)施方案。
[0011] 圖3-7各提供更詳細(xì)描述于本申請(qǐng)實(shí)施例部分的數(shù)據(jù)。
[0012] 【定義】
[0013]本文使用的術(shù)語"樣品"涉及材料或材料的混合物，通常情況下，盡管這不是必須 的，以液體形式，含有一種或多種感興趣的分析物。
[0014]術(shù)語"核苷酸"旨在包括那些不僅包含已知嘌呤和嘧啶堿基而且包含已被修飾的 其他雜環(huán)堿基的基團(tuán)(moieties)。這些修飾包括甲基化的噪呤或啼啶，?；脑脒驶蛱?啶，烷基化的核糖或其他雜環(huán)。此外，術(shù)語"核苷酸"包括那些包含半抗原或熒光標(biāo)記并可以 不僅包含常規(guī)核糖和脫氧核糖的糖，而且也可以包含其他糖的基團(tuán)。修飾的核苷或核苷酸 也包括對(duì)所述糖基團(tuán)的修飾，例如，一個(gè)或多個(gè)羥基被鹵素原子或脂肪族基團(tuán)取代，官能化 為醚、胺等。
[0015]術(shù)語"核酸"和"寡核苷酸"在本文中可以互換使用，用于描述任意長(zhǎng)度的聚合物， 例如，長(zhǎng)于大約2個(gè)堿基，長(zhǎng)于大約10個(gè)堿基，長(zhǎng)于大約100個(gè)堿基，長(zhǎng)于大約500個(gè)堿基，長(zhǎng) 于大約1000個(gè)堿基，長(zhǎng)達(dá)大約10,000個(gè)或更多堿基組成的核苷酸，例如，脫氧核糖核苷酸或 核糖核苷酸，并可通過酶法或合成法制備(例如，PNA記載于美國專利號(hào)5，948，902和其中所 引用的參考文獻(xiàn))其可以與天然存在的核酸以序列特異性的方式進(jìn)行雜交，該方式與兩種 天然存在的核酸雜交類似，例如，能夠參與沃森-克里克堿基配對(duì)相互作用。天然存在的核 苷酸包括鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和胸腺嘧啶(分別為G、C、A和T)。
[0016]本文使用的術(shù)語"核酸樣品"指含有核酸的樣品。
[0017]本文使用的術(shù)語"靶多核苷酸"指研究中的目的多核苷酸。在某些實(shí)施方案中，靶 多核苷酸含有研究中的一個(gè)或多個(gè)目的靶位點(diǎn)。
[0018] 本文使用的術(shù)語"寡核苷酸"指大約2至200個(gè)核苷酸的核苷酸單鏈多聚體。寡核苷 酸可以通過合成或可以通過酶法制備，并且，在一些實(shí)施方案中，長(zhǎng)度為10至50個(gè)核苷酸。 寡核苷酸可以含有核糖核苷酸單體（即，可以為寡核糖核苷酸)或脫氧核糖核苷酸單體。例 如，寡核苷酸的長(zhǎng)度可以為10至20、11至30、31至40、41至50、51至60、61至70、71至80、80至 100、100至150或150至200個(gè)核苷酸。
[0019]本文使用的術(shù)語"雙鏈體"或"雙鏈的"描述兩個(gè)互補(bǔ)的堿基配對(duì)的多核苷酸，即， 雜交在一起。
[0020]本文使用的術(shù)語"引物"指這樣的寡核苷酸，其具有與靶多核苷酸的一個(gè)區(qū)域互補(bǔ) 的核苷酸序列。在引物延伸條件下，使用靶核酸作為模板，引物結(jié)合至所述互補(bǔ)區(qū)域并延 伸。引物可為大約15至大約50個(gè)核苷酸范圍內(nèi)，但也可使用在上述長(zhǎng)度范圍之外的引物。弓丨 物可通過聚合酶的作用從引物的3 '末端開始延伸。不能通過聚合酶的作用從其3 '末端開始 延伸的寡核苷酸不是引物。
[0021 ]本文使用的術(shù)語"延伸"指向核酸末端添加一個(gè)或更多的核苷酸，例如通過寡核苷 酸的連接或通過使用聚合酶。
[0022]本文使用的術(shù)語"擴(kuò)增"指使用靶核酸作為模板產(chǎn)生一個(gè)或更多拷貝的靶核酸。 [0023]本文使用的術(shù)語"變性"指核酸雙鏈體分開為兩條單鏈。
[0024]本文的術(shù)語"測(cè)定（determining)"、"測(cè)量（measuring)"、"評(píng)估（evaluating)"、 "評(píng)估(assessing)"、"分析（assaying)"、"檢測(cè)（detecting)"、"分析（analyzing)"可以互 換使用，指任何形式的測(cè)量，并包括測(cè)定一種成分(element)存在與否。這些屬于包括定性 和/或定量測(cè)定。評(píng)估可為相對(duì)或絕對(duì)。"評(píng)估其存在"包括測(cè)定存在的某種物質(zhì)的量，以及 測(cè)定其存在或不存在。
[0025]術(shù)語"使用"有其常規(guī)含義，因此，是指采用，例如，將方法或組合物付諸運(yùn)行至結(jié) 束。
[0026]本文使用的術(shù)語"Tm"指寡核苷酸雙鏈體的解鏈溫度，在該溫度，一半的雙鏈體保 持雜交而一半的雙鏈體解離成單鏈。寡核苷酸雙鏈體的Tm可以通過實(shí)驗(yàn)測(cè)定或使用下述公 式預(yù)測(cè)丄=81.5+16.6(1〇 81()[他+])+0.41(部分6+〇-(60/^)，其中~是鏈長(zhǎng)且[他+]小于謂。 參見Sambrook和Russell(2001;MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rded.，Cold SpringHarborPress，ColdSpringHarborN.Y.，ch.lO)。還有其他預(yù)測(cè)寡核苷酸雙鏈體 的!》的公式并且一個(gè)公式可以或多或少地適用于給定的條件或一組條件。
[0027]本文使用的術(shù)語"Tm_匹配的"指多個(gè)核酸雙鏈體有在定義范圍內(nèi)的Tm，例如，在互 相的5°C或10°C范圍內(nèi)。
[0028]本文使用的術(shù)語"反應(yīng)混合物"指試劑的混合物，所述試劑能夠在能夠在適當(dāng)?shù)耐?部條件下經(jīng)過一段時(shí)間一起反應(yīng)產(chǎn)生產(chǎn)物。反應(yīng)混合物可以包含PCR試劑和活瓣切割試劑， 例如，各自在本領(lǐng)域已知的配方。
[0029]本文使用的術(shù)語"混合物"指成分的組合，所述成分是散在的并沒有任何特定順 序。混合物是異質(zhì)的且沒有在空間上分離成其不同成分?；旌衔锍煞值膶?shí)施例包括大量不 同的溶解于相同水溶液的成分，或大量不同的附著到固相載體的成分或在沒有特定順序上 不同成分在空間上沒有不同。混合物是無法定位的（addressable)。舉例說明，作為本領(lǐng)域 中通常已知的，空間上分離的表面結(jié)合多核苷酸的陣列不是表面結(jié)合多核苷酸的混合物， 因?yàn)榇祟惐砻娼Y(jié)合多核苷酸空間上不同且所述陣列是可以定位的。
[0030]本文使用的術(shù)語"PCR試劑"指對(duì)模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)所必需的所有試 劑。正如本領(lǐng)域中已知的，PCR試劑基本上包括第一引物、第二引物、熱穩(wěn)定聚合酶和核苷 酸。取決于所使用的聚合酶，也可存在離子(例如，Mf+hPCR試劑可以任選地包含可擴(kuò)增靶 序列的模板。
[0031]本文使用的術(shù)語"活瓣分析"指一種分析，其中活瓣寡核苷酸以重疊依賴的方式通 過活瓣核酸內(nèi)切酶切割從而釋放隨后被檢測(cè)到的活瓣?；畎攴治龅脑肀娝苤⑶矣涊d 于，例如，Lyamichev等人·（Nat.Biotechnol· 1999 17 : 292-296)、Ryan等人 (Mol.Diagn. 1999 4:135-44)和Allawi等人（JClinMicrobiol.2006 44:3443-3447)。為 了清楚，某些應(yīng)用于活瓣分析的試劑記載如下。活瓣分析的原理如圖1所示。如圖1所示的活 瓣分析，侵入寡核苷酸2和活瓣寡核苷酸4與靶6雜交產(chǎn)生包含在位置10處有一個(gè)核苷酸重 疊的第一復(fù)合體8。第一復(fù)合體8是活瓣核酸內(nèi)切酶的底物。活瓣核酸內(nèi)切酶12切割活瓣寡 核苷酸4從而釋放活瓣14,活瓣14與FRET盒16雜交，F(xiàn)RET盒16包含猝滅劑"Q"和附近的淬滅 熒光基團(tuán)"R"，"R"被猝滅劑Q淬滅?；畎?4與FRET盒16的雜交產(chǎn)生包含在位置20處有一個(gè)核 苷酸重疊的第二復(fù)合體18。第二復(fù)合體也是活瓣核酸內(nèi)切酶的底物?；畎旰怂醿?nèi)切酶12切 割FRET盒16導(dǎo)致熒光基團(tuán)22的釋放，這產(chǎn)生熒光信號(hào)。這些成分在下面進(jìn)行更詳細(xì)的記載。 [0032]本文使用的術(shù)語"侵入寡核苷酸"指一種與靶核苷酸的一個(gè)區(qū)域互補(bǔ)的寡核苷酸。 侵入寡核苷酸的3'末端核苷酸可以與靶的核苷酸堿基配對(duì)，也可以不配對(duì)(例如，其可為 SNP的位點(diǎn)或例如突變）。
[0033]本文使用的術(shù)語"活瓣寡核苷酸"指一種包含活瓣區(qū)域和與靶核酸的區(qū)域互補(bǔ)的 區(qū)域的寡核苷酸。侵入寡核苷酸上的靶互補(bǔ)區(qū)域和活瓣寡核苷酸重疊單個(gè)核苷酸，因而當(dāng) 它們與靶核酸退火時(shí)，互補(bǔ)序列重疊。正如已知的，如果:a)侵入核苷酸的3'末端核苷酸和 b)與活瓣寡核苷酸中的那個(gè)核苷酸重疊的核苷酸二者均與靶核酸中的核苷酸堿基配對(duì)，那 么形成一種具體結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)是酶的底物，所述酶如下定義為活瓣核酸內(nèi)切酶，其從活瓣 寡核苷酸的靶互補(bǔ)區(qū)域切割活瓣。如果侵入寡核苷酸的3'末端核苷酸沒有與靶核酸里的核 苷酸堿基配對(duì)，或如果活瓣寡核苷酸中的重疊核苷酸沒有與靶核酸中的核苷酸堿基配對(duì)， 復(fù)合體不是所述酶的底物并只有很少或者沒有切割。
[0034]本文使用的術(shù)語"活瓣核酸內(nèi)切酶"或簡(jiǎn)稱"FEN"指一類核苷酸分解酶，其作為結(jié) 構(gòu)特異性核酸內(nèi)切酶作用于DNA結(jié)構(gòu)，所述DNA結(jié)構(gòu)于一條鏈上包含單鏈5 '突出端或活瓣， 該條鏈被核酸的另一條鏈取代，即，使得在單鏈和雙鏈DNA之間的交界處有重疊核苷酸。FEN 催化單鏈和雙鏈DNA交界處的磷酸二酯鍵水解斷裂，釋放所述突出端，或所述活瓣?；畎旰?酸內(nèi)切酶由Ceska和Savers(Trends Biochem.Sci.1998 23:331-336)及Liu等 (Annu.Rev.Biochem.2004 73:589-615)綜述。FEN可以是單獨(dú)的酶、多亞基酶或作為其它酶 或者蛋白復(fù)合體的活性存在，例如，DNA聚合酶?；畎旰怂醿?nèi)切酶可以是熱穩(wěn)定的。
[0035]本文使用的術(shù)語"切割的活瓣"指活瓣分析的切割產(chǎn)物的單鏈寡核苷酸。
[0036]本文使用的術(shù)語"FRET盒"指包含熒光基團(tuán)和附近的淬滅所述熒光基團(tuán)的猝滅劑 基團(tuán)的發(fā)夾寡核苷酸。切割的活瓣與FRET盒的雜交產(chǎn)生活瓣核酸內(nèi)切酶所需的二級(jí)底物。 一旦形成該底物，包含5 '熒光基團(tuán)的堿基從盒切割出，從而產(chǎn)生熒光信號(hào)。
[0037]本文使用的術(shù)語"活瓣分析試劑"指對(duì)底物進(jìn)行活瓣分析所需的所有試劑。正如本 領(lǐng)域已知的，活瓣分析包括如上所述的侵入寡核苷酸、活瓣寡核苷酸、活瓣核酸內(nèi)切酶和 FRET盒?；畎攴治鲈噭┛梢匀芜x地包含所述侵入寡核苷酸和活瓣寡核苷酸結(jié)合的靶。
[0038]本文使用的術(shù)語"基因組座位"指基因組中的指定區(qū)域?；蚪M座位存在于來自同 一個(gè)體的不同細(xì)胞的基因組的相同位置，或不同個(gè)體中。一個(gè)細(xì)胞或個(gè)體的基因組座位可 有與不同細(xì)胞或個(gè)體的相同基因組座位相同或非常相似（即，超過99%相同）。不同細(xì)胞或 個(gè)體中相同基因組座位之間核苷酸序列的差異可以是因?yàn)橐粋€(gè)或多個(gè)核苷酸取代。SNP(單 核苷酸多態(tài)性)是點(diǎn)突變的一種類型，在人群中不同個(gè)體之間相同的基因組座位中發(fā)生點(diǎn) 突變。點(diǎn)突變可以是體細(xì)胞的，其發(fā)生在同一個(gè)體的不同細(xì)胞之間?；蚪M座位突變可通過 基因組坐標(biāo)、名稱或使用符號(hào)進(jìn)行定義。
[0039]本文使用的"突變位點(diǎn)"指基因組座位中核苷酸取代的位置。除非另有說明，核酸 中突變位點(diǎn)可具有突變體等位基因或突變的野生型等位基因。突變位點(diǎn)可通過基因組坐標(biāo) 或相對(duì)于基因起始密碼子的坐標(biāo)進(jìn)行定義(例如，"KRASG35T突變"的情形）。
[0040]本文使用的術(shù)語"點(diǎn)突變"指基因組座位的突變體拷貝的突變位點(diǎn)處的核苷酸的 特性。所述核苷酸可位于雙鏈DNA分子的任一條鏈。
[0041]本文使用的術(shù)語"野生型"，參照基因組座位，指含有野生型序列的基因組座位的 等位基因。在含有SNP的基因組座位的情形下，野生型序列可含有SNP的主要等位基因。
[0042]本文使用的術(shù)語"突變體"，參照基因組座位，指含有突變體序列的基因組座位的 等位基因。在含