一種植物蛋白質(zhì)的提取方法及植物蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種植物蛋白質(zhì)的提取方法及植物蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法。
【背景技術(shù)】
[0002]蛋白質(zhì)組學(xué)研究是在蛋白質(zhì)組學(xué)水平上，對生命活動的功能執(zhí)行體一蛋白質(zhì)進(jìn)行深入系統(tǒng)的研究，不僅有助于全景式地揭示生命活動的本質(zhì)，而且對于研究疾病機(jī)制、發(fā)展預(yù)警、診斷和治療方法均具有重要意義。而動植物樣品的蛋白質(zhì)提取是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的必要步驟。在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，樣品制備是最關(guān)鍵的步驟，直接決定后續(xù)實驗的成敗。在提取植物種子尤其是高油脂類種子的蛋白質(zhì)時，采用常規(guī)方法不僅不能將蛋白質(zhì)提取充分，而且提取的蛋白質(zhì)雜質(zhì)含量極高，不能得到高純度的蛋白質(zhì);而蛋白質(zhì)提取不充分會導(dǎo)致執(zhí)行重要生物功能的低豐度蛋白質(zhì)丟失，蛋白質(zhì)雜質(zhì)含量高則往往會導(dǎo)致蛋白質(zhì)第一向等電聚焦實驗的失敗，第二向垂直板電泳也不能得到清晰的蛋白質(zhì)點，最終導(dǎo)致整個實驗的失敗。為了得到高純度的蛋白質(zhì)，也可采用蛋白純化試劑盒，但價格一般較昂貴。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本申請實施例通過提供一種植物蛋白質(zhì)的提取方法及植物蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法，解決了現(xiàn)有技術(shù)中植物種子蛋白質(zhì)提取不充分和提取雜質(zhì)含量高的問題，不僅能對植物種子蛋白質(zhì)提取更充分而且提取純度更高，且節(jié)省了蛋白質(zhì)提純費用和時間。
[0004]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明主要提供如下技術(shù)方案:
[0005]—方面，本發(fā)明實施例提供了一種植物蛋白質(zhì)的提取方法，包括以下步驟:
[0006](1)將植物樣品研磨成粉末，再和提取液進(jìn)行混合，向混合液中放入研磨珠后進(jìn)行振動，再靜置；
[0007](2)將靜置后的混合液離心，棄上清液，將沉淀先采用第一丙酮溶液洗滌至純白色，再采用第二丙酮溶液進(jìn)行提純，將提純后的沉淀真空冷凍干燥，即得到蛋白質(zhì)干粉。
[0008]作為優(yōu)選，所述植物樣品為植物種子。
[0009]作為優(yōu)選，所述植物樣品為高油脂類植物種子。
[0010]作為優(yōu)選，所述步驟(2)中進(jìn)行所述洗滌時，先向沉淀中加入第一丙酮溶液，再振動、靜置、離心，對離心后的沉淀按照相同的方法重復(fù)洗滌，直至沉淀為純白色。
[0011]作為優(yōu)選，所述步驟(2)中進(jìn)行所述提純時，先向純白色沉淀中加入第二丙酮溶液，再振動、靜置、離心，離心得到的沉淀即為提純后的沉淀。
[0012]作為優(yōu)選，進(jìn)行所述振動時，將混合液和研磨珠放入研磨罐或離心管中，再將研磨罐或離心管放入研磨儀內(nèi)，采用研磨儀進(jìn)行振動。
[0013]作為優(yōu)選，所述研磨珠的直徑為研磨罐直徑或離心管管口直徑的1/3-2/3，研磨珠的數(shù)量為1-2個。
[0014]作為優(yōu)選，所述振動的頻率為1500-2500次/分鐘。
[0015]作為優(yōu)選，所述振動的時間為2-10min。
[0016]作為優(yōu)選，所述研磨珠的材質(zhì)選自二氧化鋯、硬質(zhì)鋼、不銹鋼、碳化鎢、瑪瑙或聚酰胺纖維中的一種;所述研磨罐的材質(zhì)選自二氧化鋯、硬質(zhì)鋼、不銹鋼、碳化鎢、瑪瑙或聚酰胺纖維中的一種;所述離心管的材質(zhì)選自二氧化鋯、硬質(zhì)鋼、不銹鋼、碳化鎢、瑪瑙或聚酰胺纖維中的一種。
[0017]另一方面，本發(fā)明實施例還提供了一種植物蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法，包括對植物蛋白質(zhì)的提取，所述對植物蛋白質(zhì)的提取采用上述的提取方法。
[0018]本申請實施例中提供的一個或多個技術(shù)方案，至少具有如下技術(shù)效果或優(yōu)點:
[0019]本發(fā)明實施例通過采用研磨儀對植物樣品提取混合液進(jìn)行振動，使植物樣品能與提取液充分接觸，使植物樣品中的蛋白質(zhì)充分沉淀并充分釋放包裹在顆粒中的雜質(zhì)，從而使蛋白質(zhì)的提取更充分并減少了提取的蛋白質(zhì)中的雜質(zhì)含量，避免了使用價格昂貴的蛋白純化試劑盒，節(jié)省了蛋白質(zhì)提純費用;對蛋白質(zhì)提取混合液進(jìn)行振動的時間短且操作簡便、成本較低，節(jié)省了提取時間和提取成本。
【附圖說明】
[0020]圖1為本發(fā)明實施例和對比例提取的蛋白質(zhì)的雙向電泳圖譜。
【具體實施方式】
[0021]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述，但不作為對本發(fā)明的限定。
[0022]實施例1
[0023](1)稱取0.25g去殼棉花種子，加入0.05g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)及液氮，迅速研磨成粉末，裝入2mL離心管中，再加入1.2mL-20°C預(yù)冷的TCA(三氯乙酸)-丙酮提取液進(jìn)行混合，該提取液為含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10 %的TCA、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.07 %的β_巰基乙醇以及摩爾濃度為lmmol/L的苯甲基磺酰氟的丙酮溶液，其中提取液的體積為棉花種子粉末體積的3倍，向混合液中放入1個研磨珠后，將離心管置于研磨儀中振動2min，再置于-20°C的環(huán)境中靜置過夜，其間振蕩多次，其中離心管的材質(zhì)為聚丙烯，研磨珠的材質(zhì)為二氧化鋯，研磨珠直徑為5mm，振動頻率為1800次/分鐘；
[0024](2)將上述靜置過夜后的混合液于4°C的條件下以25000 Xg的離心力離心30min，棄上清液，向離心管內(nèi)的沉淀中加入1.2mL-20°C預(yù)冷的第一丙酮溶液混合，該第一丙酮溶液為含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.07%的β-巰基乙醇和摩爾濃度為lmmol/L的苯甲基磺酰氟的丙酮溶液，將離心管置于研磨儀中振動2min(此時研磨珠仍在離心管內(nèi))，振動頻率為1800次/分鐘，再置于_20°C的環(huán)境中靜置lh，然后于4°C的條件下以25000Xg的離心力離心30min，對離心后的沉淀按照相同的方法重復(fù)洗滌，直至沉淀為純白色;再向離心管內(nèi)的純白色沉淀中加入1.2mL-20°C預(yù)冷的第二丙酮溶液，該第二丙酮溶液為丙酮體積分?jǐn)?shù)為80%的丙酮水溶液，然后將離心管置于研磨儀中振動2min(此時研磨珠仍在離心管內(nèi))，振動頻率為1800次/分鐘，再置于_20°C的環(huán)境中靜置lh，于4°C的條件下以25000Xg的離心力離心30min，最后將離心得到的沉淀真空冷凍干燥成干粉，該干粉即為棉花種子蛋白質(zhì)干粉，保存?zhèn)溆没蜻M(jìn)行后續(xù)操作。
[0025]實施例2
[0026](1)稱取0.25g油葵種子，加入0.05g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)及液氮，迅速研磨成粉末，裝入2mL離心管中，再加入1.2mL-20°C預(yù)冷的TCA-丙酮提取液進(jìn)行混合，該提取液為含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的TCA、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.07%的β-巰基乙醇以及摩爾濃度為lmmol/L的苯甲基磺酰氟的丙酮溶液，其中提取液的體積為油葵種子粉末體積的3倍，向混合液中放入1個研磨珠后，將離心管置于研磨儀中振動5min，再置于-20°C的環(huán)境中靜置過夜，其間振蕩多次，其中離心管的材質(zhì)為聚丙烯，研磨珠的材質(zhì)為碳化鎢，研磨珠直徑為5mm，振動頻率為2500次/分鐘；
[0027](2)將上述靜置過夜后的混合液于4°C的條件下以25000 Xg的離心力離心30min，棄上清液，向離心管內(nèi)的沉淀中加入1.2mL-20°C預(yù)冷的第一丙酮溶液混合，該第一丙酮溶液為含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.07%的β-巰基乙醇和摩爾濃度為lmmol/L的苯甲基磺酰氟的丙酮溶液，將離心管置于研磨儀中振動5min(此時研磨珠仍在離心管內(nèi))，振動頻率為2500次/分鐘，再置于_20°C的環(huán)境中靜置lh，然后于4°C的條件下以25000Xg的離心力離心30min，對離心后的沉淀按照相同的方法重復(fù)洗滌，直至沉淀為純白色;再向離心管內(nèi)的純白色沉淀中加入1.2mL-20°C預(yù)冷的第二丙酮溶液，該第二丙酮溶液為丙酮體積分?jǐn)?shù)為80%的丙酮水溶液，然后將離心管置于研磨儀中振動5min(此時研磨珠仍在離心管內(nèi))，振動頻率為2500次/分鐘，再置于_20°C的環(huán)境中靜置lh，于4°C的條件下以25000Xg的離心力離心30min，最后將離心得到的沉淀真空冷凍干燥成干粉，該干粉即為油葵種子蛋白質(zhì)干粉，保存?zhèn)溆没蜻M(jìn)行后續(xù)操作。
[0028]實施例3
[0029](1)稱取6.25g花生種子，加入1.25g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)及液氮，迅速研磨成粉末，裝入50mL研磨罐中，再加入30mL-20°C預(yù)冷的TCA-丙酮提取液進(jìn)行混合，該提取液為含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的TCA、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.07%的β-巰基乙醇以及摩爾濃度為lmmol/L的苯甲基磺酰氟的丙酮溶液，其中提取液的體積為花生種子粉末體積的3倍，向混合液中放入2個研磨珠后，將研磨罐置于研磨儀中振動lOmin，再置于-20°C的環(huán)境中靜置過夜，其間振蕩多次，其中研磨罐的材質(zhì)為不銹鋼，研磨珠的材質(zhì)為不銹鋼，研磨珠直徑為10mm，振動頻率為1500次/分鐘；
[0030](2)將上述靜置過夜后的混合液和研磨珠一起轉(zhuǎn)移到離心管中，并于4°C的條件下以25000Xg的離心力離心30min，棄上清液，向離心管內(nèi)的沉淀中加入30mL-20°C預(yù)冷的第一丙酮溶液混合，該第一丙酮溶液為含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.07%的β-巰基乙醇和摩爾濃度為lmmol/L的苯甲基磺酰氟的丙酮溶液，將離心管內(nèi)的混合液和研磨珠轉(zhuǎn)移到研磨罐中，并置于研磨儀中振動lOmin，振動頻率為1500次/分鐘，再置于-20°C的環(huán)境中靜置lh，然后將混合液和研磨珠一起轉(zhuǎn)移到離心管中，并于4°C的條件下以25000 Xg的離心力離心30min，對離心后的沉淀按照相同的方法重復(fù)洗滌，直至沉淀為純白色;再向離心管內(nèi)的純白色沉淀中加入30mL-20°C預(yù)冷的第二丙酮溶液，該第二丙酮溶液為丙酮體積分?jǐn)?shù)為80 %的丙酮水溶液，然后將離心管內(nèi)的混合液和研磨珠轉(zhuǎn)移到研磨罐中，并置于研磨儀中振動lOmin，振動頻率為1500次/分鐘，再置于-20°C的環(huán)境中靜置lh，然后將混合液和研磨珠一起轉(zhuǎn)移到離心管中，并于4°C的條件下以25000 Xg的離心力離心30min，最后將離心得到的沉淀真空冷凍干燥成干粉，該干粉即為花生種子蛋白質(zhì)干粉，保存?zhèn)溆没蜻M(jìn)行后續(xù)操作。
[0031 ] 實施例4
[0032](1)稱取6.25g大豆種子，加入1.25g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)及液氮，迅速研磨成粉末，裝入50mL研磨罐中，再加入30mL-20°C預(yù)冷的TCA-丙酮提取液進(jìn)行混合，該提取液為含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的TCA、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.07%的β-巰基乙醇以及摩爾濃度為lmmol/L的苯甲基磺酰氟的丙酮溶液，其中提取液的體積為大豆種子粉末體積的3倍，向混合液中放入2個研磨珠后，將研磨罐置于研磨儀中振動8min，再置于-20°C的環(huán)境中靜置過夜，其間振蕩多次，其中研磨罐的材質(zhì)為瑪瑙，研磨珠的材質(zhì)為瑪瑙，研磨珠直徑為10mm，振動頻率為2000次/分鐘；
[0033](2)將上述靜置過夜后的混合