人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性抗體rv3a5及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程抗體技術(shù)，特別是涉及人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性抗體 RV3A5及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 狂犬病是由狂犬病毒引起的世界性人獸共患病，一旦發(fā)病100%死亡。目前世界上 87個(gè)國(guó)家有狂犬病報(bào)道，每年約有5萬(wàn)多人死于狂犬病(Knobel DL，et al.2005)?？袢”?露后預(yù)防是防治狂犬病的主要措施。對(duì)于嚴(yán)重暴露的人，世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO)建議采用狂犬疫苗注射結(jié)合抗狂犬病毒免疫球蛋白（rabies immune globulin，RIG)的方法。目前使用的兩類(lèi)RIG為人抗狂犬病毒免疫球蛋白（human rabies immune globulin，HRIG)和馬抗狂犬病毒免疫球蛋白（Equine rabies immune globulin, ERIG)。由于ERIG副反應(yīng)比較嚴(yán)重，而且對(duì)某些疫苗的抗體反應(yīng)有抑制，而HRIG價(jià)格昂貴，供 應(yīng)量有限并且有潛在的病原威脅。因此制備高效、價(jià)廉、副反應(yīng)小的被動(dòng)免疫制劑成為新的 研發(fā)目標(biāo)。
[0003] 含有特異性抗體的人源或動(dòng)物血清免疫球蛋白用以預(yù)防和治療傳染病已歷史悠 久。單克隆抗體的體外抗病毒中和活性和體內(nèi)保護(hù)肌體抵抗病毒攻擊已獲得許多實(shí)驗(yàn)證 明，如鼠抗甲肝病毒、漢坦病毒、麻疹病毒、RSV病毒、CMV病毒等中和性單克隆抗體可以在體 內(nèi)100%保護(hù)動(dòng)物免受病毒攻擊。以抗原免疫動(dòng)物獲得多抗血清的途徑一直是獲得抗體的 經(jīng)典方法，但缺乏特異性和均一性。繼而建立的B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)使得眾多科學(xué)家通過(guò) 細(xì)胞工程可以在體外定向地制備各種單克隆抗體(monoclonal antibody，McAb)，其特異性 強(qiáng)，性質(zhì)均一，易于大量生產(chǎn)。然而McAb多為鼠源性，鼠源McAb的異源性反應(yīng)極大地限制了 McAb作為治療制劑在人體的應(yīng)用。免疫球蛋白（Vaccinia immune globulin,VIG)作為抗體 成分主要來(lái)自捐獻(xiàn)者(恢復(fù)期病人)免疫血清，從獲得陽(yáng)性血清到通過(guò)安全性檢測(cè)均需花費(fèi) 大量的人力和財(cái)力，這就使其大量制備受到限制，同時(shí)由于來(lái)源于血清因此容易發(fā)生血源 性傳播疾病的感染。因此使用人源基因工程產(chǎn)品替代血制品則可克服這些缺陷，隨著人源 基因工程抗體研究的不斷深入，給這一領(lǐng)域的生物制品發(fā)展帶來(lái)了新的希望和廣闊前景。 通過(guò)抗體分子基因水平的重組可獲得多種多樣的特異性鼠源及人源抗體，使對(duì)單克隆抗體 的研究有了突破性進(jìn)展并越來(lái)越顯示出其重要意義及實(shí)際運(yùn)用前景。人源抗狂犬病毒單克 隆抗體的研制和噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)的產(chǎn)生為解決被動(dòng)免疫制劑問(wèn)題提供了新的思路。狂犬 單克隆抗體CR57和CR4098制成的單克隆抗體雞尾酒中和了26種典型的街毒株。對(duì)動(dòng)物的保 護(hù)性實(shí)驗(yàn)表明，利用單克隆抗體雞尾酒進(jìn)行治療具有可行性和優(yōu)越性(Goudsmit J，et al.2006)〇
[0004] 上世紀(jì)80年代末90年代初興起的噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)興起和整個(gè)基因工程抗體技 術(shù)研究領(lǐng)域的發(fā)展，使當(dāng)今世界人源或基因工程抗體的開(kāi)發(fā)研究取得很大進(jìn)展并已由基礎(chǔ) 研究階段步入實(shí)質(zhì)性應(yīng)用研究和開(kāi)發(fā)階段。人源抗病毒基因工程抗體，尤其是人源全抗體 的研究成功，給各種病毒性傳染病的特異性預(yù)防和治療帶來(lái)了新的希望，在抗病毒感染生 物藥領(lǐng)域逐漸形成了一類(lèi)新的抗病毒藥，即所謂的抗體藥(Antibody Drug)。如同當(dāng)初血源 性疫苗向基因工程疫苗的轉(zhuǎn)變，現(xiàn)在也急需用基因工程抗體替代血源性VIG，如通過(guò)嵌合抗 體技術(shù)（Boul ianne，G · L · et al ·，1984 ;Morrison，S.L.et al.，1984)、人源化抗體技術(shù) (Jones，P.T.et al. ,1986)、攜帶人單抗的轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)(Green，L.L.et al. ,1994)、異 體雜交瘤技術(shù)(James,K.et al. ,1987)、·菌體表面展示技術(shù)(Barbas,C.F.et al. ,1991) 等產(chǎn)生人源化抗體，已成為國(guó)內(nèi)外研究的重大方向，并逐步走向成功。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性抗體RV3A5或其活性片段。
[0006] 本發(fā)明的另一目的是提供編碼上述中和性抗體RV3A5或其活性片段的基因。
[0007] 本發(fā)明的再一目的是提供上述中和性抗體RV3A5及其活性片段在制備預(yù)防或治療 狂犬病藥物或診斷試劑中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明運(yùn)用噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)，采集多個(gè)具有高滴度狂犬病毒抗體的疫苗接種者 外周血淋巴細(xì)胞，通過(guò)基因工程手段構(gòu)建了人源抗狂犬病毒基因工程抗體文庫(kù)，并篩選獲 得特異抗狂犬病毒基因工程抗體Fab段。獲得的Fab段抗體命名為RV3A5。
[0009] 這株重組抗體是由存在于抗體輕鏈和重鏈基因可變區(qū)中的高變區(qū)（CDRs)特異性 基因序列決定的，并在原核細(xì)胞中獲得有效表達(dá)的特異性結(jié)合狂犬病毒的功能性抗體。它 們特異性識(shí)別狂犬病毒顆?？乖?，且均針對(duì)狂犬病毒糖蛋白G，與狂犬病毒具有明顯的免疫 熒光反應(yīng)(IFA)和酶聯(lián)免疫(ELISA)反應(yīng)，具有抗狂犬病毒感染的中和活性功能。
[0010] RV3A5特異性的輕鏈可變區(qū)基因來(lái)源于對(duì)人源抗狂犬病毒抗體基因庫(kù)的特異性富 積篩選，該抗體庫(kù)的建立來(lái)源于以狂犬單克隆抗體CR4098為骨架，從狂犬病疫苗接種者外 周血淋巴細(xì)胞通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增抗體輕鏈可變區(qū)基因，替換單抗CR4098的輕鏈基因，構(gòu)建輕 鏈置換文庫(kù)。RV3A5特異性的重鏈可變區(qū)基因與CR4098相同。其輕鏈和重鏈可變區(qū)相應(yīng)的三 個(gè)CDR區(qū)序列組合及其CDR區(qū)之間的框架區(qū)序列組成了每個(gè)抗體可變區(qū)序列特征，RV3A5隸 屬于抗體輕鏈家族VL6。抗體蛋白功能由存在于抗體基因輕鏈和重鏈可變區(qū)的決定族互補(bǔ) 區(qū)域⑶R1、CDR2和⑶R3中特異性核苷酸序列及其互補(bǔ)所決定，6個(gè)相應(yīng)的⑶R區(qū)氨基酸序列 構(gòu)成了抗體的特異性抗原結(jié)合區(qū)域，決定了每個(gè)抗體的抗原結(jié)合特征和抗狂犬病毒功能特 征。決定每株中和抗體功能的抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)氨基酸序列如表1所示：
[0011] 表1
[0012]
[0013]中和性抗體RV3A5輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID No: 1所示，其重鏈可變區(qū)的 氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。
[0014] 編碼中和性抗體RV3A5輕鏈可變區(qū)的基因序列如SEQ ID No: 3所示，重鏈可變區(qū)的 基因序列如SEQ ID No:4所示。
[0015]應(yīng)當(dāng)理解，在不影響scFv抗體活性的前提下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可對(duì)SEQ ID No: 1-2 所示的氨基酸序列進(jìn)行各種取代、添加和/或缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸獲得具有同等功能的 氨基酸序列，例如在非高變區(qū)將具有類(lèi)似性質(zhì)的氨基酸進(jìn)行替換，如將RV3A5的輕鏈VL序列 的第6位的Val替換為Ala。
[0016] 本發(fā)明還提供含有編碼所述中和性抗體RV3A5輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)基因的表 達(dá)載體。
[0017] 本發(fā)明還提供含有編碼所述中和性抗體RV3A5輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)基因的工 程菌及轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
[0018] 本發(fā)明還提供所述中和性抗體RV3A5在制備預(yù)防或治療狂犬病的藥物或診斷試劑 中的應(yīng)用。
[0019] 本發(fā)明進(jìn)一步提供含有所述中和性抗體RV3A5的藥物或診斷試劑。
[0020] 此外，考慮到密碼子的簡(jiǎn)并性，例如可在其編碼區(qū)，在不改變氨基酸序列的條件 下，對(duì)編碼上述scFv段抗體的基因序列進(jìn)行修改，獲得編碼相同抗體的基因。本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以根據(jù)表達(dá)抗體宿主的密碼子偏愛(ài)性，人工合成改造基因，以提高抗體的表達(dá)效率。
[0021] 進(jìn)一步，本發(fā)明將上述scFv抗體的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)進(jìn)行重組，獲得其它 分子形式如Fab抗體，該抗體同樣能夠特異性識(shí)別狂犬病毒表面抗原，具有細(xì)胞內(nèi)免疫的作 用。單鏈抗體穿透力強(qiáng)，易于進(jìn)入局部組織發(fā)揮作用。
[0022] 可將上述編碼Fab抗體的基因、scFv基因克隆到表達(dá)載體中，進(jìn)而轉(zhuǎn)化宿主，通過(guò) 誘導(dǎo)表達(dá)獲得Fab抗體以及單鏈抗體。
[0023] 此外，可將上述scFv抗體的輕重鏈編碼基因隆到全抗表達(dá)載體中，并導(dǎo)入宿主細(xì) 胞中，獲得表達(dá)抗狂犬病毒的全抗免疫球蛋白。
[0024] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，將上述scFv抗體RV3A5的輕鏈和重鏈基因分別克隆入VH/VK 全抗體表達(dá)載體，采用轉(zhuǎn)染試劑聚乙烯亞胺(PEI)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞系 統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了全抗體的分泌型表達(dá)，得到全抗體免疫球蛋白IgG(即人源IgG全抗體RV3A5)。 [0025] 利用EL ISA、I FA、SDS-PAGE對(duì)獲得的全抗體進(jìn)行功能鑒定，結(jié)果表明人源I gG全抗 體RV3A5針對(duì)aG株和CTN株狂犬病毒顆粒均有特異性結(jié)合，與利用桿狀病毒/昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng) 表達(dá)的狂犬病毒aG株糖蛋白有特異性結(jié)合。采用快速免疫熒光灶抑制實(shí)驗(yàn)檢測(cè)抗體在體外 與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)攻擊毒株CVS株和國(guó)內(nèi)疫苗株aG株的中和反應(yīng)，結(jié)果顯示，CR4098置換抗體 RV3A5對(duì)狂犬病毒aG株和CVS株均具有較高的中和效價(jià)分別為834IU/ml和779IU/ml，與單抗 CR4098的中和活性相近。
[0026] 本發(fā)明運(yùn)用噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)，成功地獲得了特異性針對(duì)狂犬病毒糖蛋白的人源 中和性抗體;利用上述獲得的人源中和性抗狂犬病毒糖蛋白基因工程抗體可變區(qū)基因 、Fab 抗體基因以及上述每個(gè)抗體基因特征下的全抗體基因