在4°C和42°C的極端 環(huán)境下，粘質(zhì)沙雷氏菌也能夠在平板培養(yǎng)基中生長。
[0037] 將粘質(zhì)沙雷氏菌XA07進(jìn)行Biolog(GN2/GP2)自動鑒定分析（GP板透光率：28% 土 3 %，GN板透光率:52 % ± 3 % )，具體步驟包括：
[0038]挑取待測的粘質(zhì)沙雷氏菌XA07的菌苔接種于Biolog平板上，在28°C下培養(yǎng)至對數(shù) 生長期。用滅菌棉簽蘸取Biolog IF液體后將平板上的菌苔刮下，再溶入Biolog IF液體中， 振蕩混勻得到菌懸液;使用Biolog濁度儀調(diào)濁度至指定范圍(GP板透光率:28% ±3%，GN板 透光率:52% ±3% );再用移液槍將菌懸液加入Biolog鑒定板中，每孔150yL;然后在28°C培 養(yǎng)16-24h取出Biolog鑒定板，用BiologMicroStation分析儀對Biolog鑒定板進(jìn)行數(shù)據(jù)讀取 和分析，具體結(jié)果見表1。
[0039]表1:自動鑒定結(jié)果
[0040]
[0041]
[0042]
[0043]
[0044] 將得到的粘質(zhì)沙雷氏菌XA07進(jìn)行16S rRNA基因序列分析，并得出其16S rRNA的基 因核苷酸序列如序列表中的SEQ ID N0:1所示，通過http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ BLAST/網(wǎng)頁中的比對程序進(jìn)行同源性分析，得出該菌種屬于沙雷氏菌屬，發(fā)明人將其命名 為XA07。
[0045] 具體地，將粘質(zhì)沙雷氏菌XA07的16S rRNA基因序列分析，具體方法包括：
[0046] (1)染色體DNA(小量)的提取
[0047] 1 ·取1 ·5mL粘質(zhì)沙雷氏菌XA07菌液加入1 ·5mL Eppendorf(EP)管(微量離心管）中， 12000r/min 離心 5min。
[0048] 2.靜置棄上清，得到沉淀，向該沉淀中加入900yL磷酸緩沖液(PBS)重懸沉淀，于4 °C12000r/min 離心 5min。
[0049] 3.再靜置棄上清，得到沉淀，向該沉淀中加入300TE(Tris-EDTA緩沖液）和200yL 10mg/mL溶菌酶，通過吹吸混勻，于37°C溫育lh，在溫育期間每隔15min顛倒混勻一次。
[0050] 4·向EP管中加入600TENS裂解液（200mmol/LNaCl，100mmol/LTril-HClpH8·0， 2.0%SDS，50mmol/L EDTA，0.5%Triton X-100)和20mg/mL蛋白酶K 10yL，顛倒混勻，于55 °C溫育lh，在溫育期間每隔15min顛倒混勻一次。
[0051 ] 5.將EP管于 4°C12000r/min 離心 5min，取上清液。
[0052] 6 .向上清液中加入體積比為25 : 24 :1的苯酚：氯仿：異丙醇并充分混勻，于4°C 12000r/min離心 lOmin。
[0053] 7 ·重復(fù)步驟6。
[0054] 8 .將上清液轉(zhuǎn)入新的EP管中，向新的EP管中加入1 /10上清液體積的3mo 1 /L醋酸 鈉，2倍上清液體積的無水乙醇，混勻，于-20°C下放置60min后，于4°C12000r/min離心 10min〇
[0055] 9.棄上清，得到沉淀，將裝有沉淀的EP管倒扣在吸水紙上，吸水紙吸干液體后將EP 管中的沉淀風(fēng)干，風(fēng)干后得到粘質(zhì)沙雷氏菌XA07的染色體DNA，向染色體DNA中加入30yL無 菌水和 10mg/mL RNase A 0.5yL，于_20°C保存。
[0056] (2)PCR 擴(kuò)增
[0057] 以剛提取的染色體DNA為模板，利用由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成的引物(上 游引物27F，5 ' -AGAGTTTGATCTGGCTCAG-3 '，下游引物 1527R，5 ' -AAGGAGGTGATCCAGCC-3 '）進(jìn) 行16S rRNA基因序列的PCR擴(kuò)增，具體PCR擴(kuò)增體系見表2。
[0058] 表2:PCR擴(kuò)增體系
[0059]
[0060] PCR擴(kuò)增條件：
[0061] Step 1，預(yù)變性94°C lOmin;
[0062] Step 2,變性 95°C 30s，
[0063] 復(fù)性 60°Clmin，
[0064] 延伸72°Clmin;共30個循環(huán)。
[0065] Step 3延伸72°C lOmin。得到粘質(zhì)沙雷氏菌XA07的16S rRNA基因的PCR產(chǎn)物。
[0066] (3) 16S rRNA基因 PCR產(chǎn)物的純化
[0067](參照Omega Bio-tek公司PCR產(chǎn)物純化試劑盒說明書）
[0068] 1.將上述PCR產(chǎn)物從瓊脂糖膠上相應(yīng)的位置切下回收至EP管中，向EP管中加人 Binding buffer(lg/mL)，在65°C水浴7min直到瓊脂糖膠完全溶解。
[0069] 2.將溶液轉(zhuǎn)移至吸附柱中，10000r/min離心lmin，棄收集管中廢液。
[0070] 3.向吸附柱中加入300yL的Binding buffer，10000r/min離心lmin，棄收集管中廢 液。
[0071 ] 4.向吸附柱中加入700yL的SPW buffer，室溫下放置2_3min，10000r/min離心 lmin，棄收集管中廢液。重復(fù)一次。
[0072] 5.于10000r/min空柱離心2min，棄收集管中廢液。
[0073] 6 ·將吸附柱放入一個干凈的EP管中，加入30_50yL的Elution buffer，12000r/min 離心2min收集產(chǎn)物，該產(chǎn)物用于基因序列。
[0074] (4) 16S rRNA基因的測序
[0075] 16S rRNA基因序列測定由上海英駿公司完成，測序結(jié)果見序列表中的序列1。
[0076] (5) 16S rRNA基因序列相似度分析
[0077] 將測序后的 16S rRNA基因序列通過http : //www · ncbi · nlm · nih · gov/BLAST/和 http: //eztaxon-e. ezbiocloud. net/網(wǎng)頁中的比對程序進(jìn)行同源性分析。
[0078] (6)基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析
[0079] 利用Clustalxl · 8，MEGA5 · 0軟件，根據(jù)16S rRNA基因序列相似度分析的結(jié)果，選取 相關(guān)模式菌株的16S rRNA基因序列，分別采用neigbor-joining(NJ，鄰位相接法)算法得到 相應(yīng)的系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖1。
[0080] 通過http: //www.ncbi . nlm. nih. gov/BLAST/網(wǎng)頁中的比對程序進(jìn)行同源性分析， 得出同源性排名前十的菌種如下表3。
[0081 ] 表3同源性比對分析
[0082]
[0084]由表3可知，本發(fā)明實(shí)施例提供的粘質(zhì)沙雷氏菌屬于沙雷氏菌屬粘質(zhì)沙雷菌，將其 命名為XA07。
[0085]將粘質(zhì)沙雷氏菌XA07進(jìn)行脂肪酸自動鑒定分析，具體方法包括：
[0086] 1.獲取菌體
[0087]采用4區(qū)劃線將粘質(zhì)沙雷氏菌XA07的菌株接種在TSB(胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基)平 板上。刮取第3區(qū)約40mg的菌量，涂抹在帶有特氟龍螺旋蓋的試管底部，同時做好標(biāo)記。
[0088] 2.皂化
[0089] (1)吸取1.0( ±0.1 )mL的皂化試劑，注入試管內(nèi)，將含內(nèi)墊的螺旋蓋旋緊，Vortex 振蕩5~10s;
[0090] (2)將試管浸入95~100°C的水浴鍋中5min;
[0091 ] (3)取出試管，不要抒開螺旋蓋，用Vortex振蕩5~10s;
[0092] (4)放回95~100°C的水浴鍋中反應(yīng)25min，注意螺旋蓋是否旋緊；
[0093] (5)取出試管，放入冷水中冷卻。
[0094] 3.甲基化
[0095] (1)擰開螺旋蓋，加入2 · 0( ±0 · 1 )mL的甲基化試劑；
[0096] (2)擰緊螺旋蓋，用Vortex振蕩5~10s;
[0097] (3)放入80±1°C的水浴鍋中反應(yīng)10( ±l)min;
[0098] (4)取出試管，放入冷水中冷卻。
[0099]