一株高效發(fā)酵木糖的突變株及利用其發(fā)酵產(chǎn)乙醇的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域和纖維物質(zhì)生物轉(zhuǎn)化技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株經(jīng) 過(guò)誘變、篩選獲得的可高效發(fā)酵木糖產(chǎn)乙醇的Spathaspora passalidarum U1-58突變株及 利用U1-58突變株進(jìn)行高固木質(zhì)纖維素乙醇發(fā)酵的方法。
【背景技術(shù)】：
[0002] 能源、環(huán)保是制約我國(guó)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的兩座大山，尋找可持續(xù)、可再生的清潔能源已成 為我國(guó)重要的發(fā)展戰(zhàn)略。乙醇是生物質(zhì)液體能源的主要存在形式，清潔可再生，是化石燃料 的理想替代品。更重要的是，乙醇還可以為一些化工原料如乙烯等提供原料。木質(zhì)纖維素因 其來(lái)源廣泛、不存在與人爭(zhēng)糧等風(fēng)險(xiǎn)被認(rèn)為是最具有發(fā)展?jié)摿Φ囊掖忌a(chǎn)原料。近年來(lái)，越 來(lái)越多的研究者致力于研究以木質(zhì)纖維素類(lèi)物質(zhì)為原料進(jìn)行乙醇生產(chǎn)。
[0003] 但以木質(zhì)纖維素類(lèi)物質(zhì)為原料生產(chǎn)乙醇依然存在一些挑戰(zhàn)，其中最重要的就是如 何提高乙醇的濃度以此來(lái)減小生產(chǎn)過(guò)程中的能耗。從經(jīng)濟(jì)角度來(lái)講，工業(yè)上對(duì)乙醇濃度的 最低要求為4% (w/v)。對(duì)于纖維素乙醇來(lái)說(shuō)，提高乙醇濃度最常用的辦法就是提高發(fā)酵液 中的固形物含量。提高固形物含量還可以減少發(fā)酵設(shè)備的使用，從而降低生產(chǎn)成本等優(yōu)點(diǎn)。 同步糖化發(fā)酵是高固形物發(fā)酵的基本方法。但高固形物發(fā)酵存在攪拌、傳熱不均勻等難題。 為解決這個(gè)難題，研究者們提出了分步糖化發(fā)酵、預(yù)酶解、分批補(bǔ)料等策略。雖然這些措施 可以有效地得以實(shí)施，但由于木糖發(fā)酵的局限性，在這些策略中高濃度的乙醇主要產(chǎn)自纖 維素組份，木質(zhì)纖維素中大部分的半纖維素被浪費(fèi)。
[0004] 木質(zhì)纖維素類(lèi)物質(zhì)中含有30 %~50 %的纖維素和20 %~40 %的半纖維素，而傳統(tǒng) 的釀酒酵母只能發(fā)酵由纖維素酶解而來(lái)的六碳糖(葡萄糖），無(wú)法發(fā)酵由半纖維素酶解而來(lái) 的五碳糖(大部分為木糖）。而天然木糖發(fā)酵酵母又存在乙醇耐受性、抑制物耐受性低等缺 陷。通過(guò)代謝工程改造，可使高效發(fā)酵葡萄糖的菌種具有一定的木糖發(fā)酵能力，且此方法在 纖維素乙醇方面也取得了較好的進(jìn)展，但在葡萄糖存在的情況下，大多數(shù)基因工程菌株的 木糖發(fā)酵速率仍然比葡萄糖低，若想增加木糖利用率，則需要大大延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間，發(fā)酵時(shí)間 的延長(zhǎng)必然導(dǎo)致發(fā)酵效率的降低和成本的增加。所以，我們需要尋找更加適合于木質(zhì)纖維 素發(fā)酵產(chǎn)乙醇的菌株。
[0005] 在木糖發(fā)酵酵母中，新型酵母菌株Spathaspora passalidarum NRRL Y-27907與 其他菌株(Pichia pastoris)相比具有較高的乙醇耐受性、溫度耐受性、滲透壓耐受性等優(yōu) 點(diǎn)。更為重要的是，S. passalidarum在厭氧條件下可進(jìn)行葡萄糖木糖共發(fā)酵。這些特點(diǎn)使得 S . passalidarum在木質(zhì)纖維素-生物乙醇轉(zhuǎn)化方面具有很好的應(yīng)用潛力。中國(guó)專(zhuān)利 201410709989.3公布了一株耐高溫的Spathaspora passalidarum突變株，該突變株在37°C 下?lián)u瓶發(fā)酵的乙醇產(chǎn)量達(dá)到為16.45g/L，30°C，搖瓶發(fā)酵條件下發(fā)酵5天，乙醇濃度達(dá)到 39.04g/L，其溫度耐受性提高到41°C，乙醇耐受性提高到12%。但在溫度耐受性及發(fā)酵木糖 產(chǎn)乙醇性能方面仍有待提升。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0006] 為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明在Spathaspora passalidarum NRRL Y-27907的基礎(chǔ) 上，提供一株高效發(fā)酵木糖產(chǎn)乙醇的突變株，以及利用該突變菌株進(jìn)行高固液比木質(zhì)纖維 素發(fā)酵產(chǎn)乙醇的方法。
[0007] 所述高效發(fā)酵木糖產(chǎn)乙醇的突變株，具體為Spathaspora passalidarum U1-58， 該菌株已于2015年12月11日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地 址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101，保藏編號(hào)為 CGMCC No.11867。
[0008] 所述突變株U1-58是以S.passalidarum NRRL Y-27907為出發(fā)菌株，通過(guò)等離子誘 變、平板初篩、發(fā)酵復(fù)篩，篩選獲得的，該突變株在對(duì)溫度的耐受性、發(fā)酵木糖產(chǎn)乙醇的能 力、葡萄糖木糖共發(fā)酵的能力及高固木質(zhì)纖維素乙醇發(fā)酵的能力等方面較出發(fā)菌株均有顯 者提尚。
[0009] 利用所述的突變株U1-58進(jìn)行高固液比木質(zhì)纖維素酶解液發(fā)酵產(chǎn)乙醇即利用葡萄 糖、木糖共發(fā)酵產(chǎn)乙醇的方法，具體步驟如下：
[0010] (1)按固液質(zhì)量比1:4~1:6將木質(zhì)纖維素原料投入pH4 · 5~5 · 5的檸檬酸緩沖溶液 中，添加纖維素酶和木聚糖酶，在45°C~55°C、150~180rpm條件下，酶解36h~72h，酶解結(jié) 束，對(duì)酶解體系進(jìn)行過(guò)濾，除去濾渣，得到酶解液；
[0011] 所述纖維素酶添加量為20~40FPU/g木質(zhì)纖維素原料，木聚糖酶10000~14000U/g 木質(zhì)纖維素原料；
[0012] 所述木質(zhì)纖維素原料為玉米芯、玉米秸桿或甜高粱中的一種；
[0013] (2)以步驟（1)得到的酶解液為發(fā)酵碳源，添加適量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)后得發(fā)酵培養(yǎng)基，所 述營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)為:酵母浸粉18~26g/L，K 2HP〇4l · 5~3 · 5g/L，MgS〇4〇 · 05~0 · 2g/L;
[0014] 發(fā)酵條件:菌種初始0D6Q()3.0~6.0，溫度30~33°C、搖床轉(zhuǎn)速100~150rpm，發(fā)酵72 ~120小時(shí)。
[0015] 利用所述突變株U1-58進(jìn)行高固木質(zhì)纖維素同步糖化共發(fā)酵產(chǎn)乙醇的方法，具體 步驟如下：
[0016] 將木質(zhì)纖維素原料、檸檬酸緩沖液、纖維素酶、木聚糖酶、菌種、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)同時(shí)加入 生物反應(yīng)器中，在溫度33~35°C，搖床轉(zhuǎn)速100~150rpm條件下，發(fā)酵72~96小時(shí)；
[0017] 所述木質(zhì)纖維素原料按固液質(zhì)量比1:4~1:6投入pH4.5~5.5的梓檬酸緩沖溶液 中；
[0018] 所述纖維素酶添加量為10~30FPU/g原料，木聚糖酶8000~12000U/g原料；
[0019] 所述菌種初始0D6QQ5.0~8.0;
[0020]所述營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)為:NH4C1 2.87~3.82g/L、KH2P〇4 2.5~4.0g/L、MgS〇4 0.1 ~0.3g/ L〇
[0021 ] 有益效果：
[0022] l、Ul-58突變株的溫度耐受性明顯優(yōu)于U1出發(fā)菌株，在溫度在30°C_41°C之間，U1- 58突變株的生長(zhǎng)性能與出發(fā)菌株相比均有一定程度的提高。
[0023] 2、U1_58突變株發(fā)酵木糖產(chǎn)乙醇性能較U1出發(fā)菌株顯著提高。該突變菌株在41°C 下?lián)u瓶發(fā)酵5天，乙醇濃度、糖醇轉(zhuǎn)化率分別達(dá)到28.50g/L、0.41，分別較U1出發(fā)菌株提高 166.31 %、21.66% ; 37°C下，該突變菌株乙醇濃度、糖醇轉(zhuǎn)化率分別達(dá)到35.41 g/L、0.42，分 別較U1出發(fā)菌株提高72.05%、21.22% ; 33°C下，乙醇濃度及糖醇轉(zhuǎn)化率分別達(dá)到44.19g/ L、0 · 45，分別較U1出發(fā)菌株提高27 · 06%、14 · 25%。
[0024] 3、U1_58突變株進(jìn)行葡萄糖、木糖共發(fā)酵的能力優(yōu)于U1出發(fā)菌株。該突變菌株利用 木質(zhì)纖維素水解液進(jìn)行葡萄糖木糖共發(fā)酵，乙醇濃度可達(dá)到43.26g/L，較出發(fā)菌株高出 38.39%。且在葡萄糖存在條件下，U1-58突變株木糖利用速度和木糖利用率顯著提高，木糖 利用率可達(dá)到97.12%，較出發(fā)菌株高出57.37%。
[0025] 4、U1_58突變株進(jìn)行高固木質(zhì)纖維素乙醇發(fā)酵的能力優(yōu)于U1出發(fā)菌株。33°C下，利 用該突變株和本發(fā)明提供的方法，進(jìn)行高固木質(zhì)纖維素同步糖化共發(fā)酵，乙醇濃度可達(dá)到 49.92g/L，較U1出發(fā)菌株提高23.41 % ;總糖（纖維素+半纖維素）對(duì)乙醇的總轉(zhuǎn)化率為 0.42g/g，較U1出發(fā)菌株總轉(zhuǎn)化率高出22.71 % ;纖維素和半纖維素利用率分別達(dá)到 86.12%、86·86%，較U1 出發(fā)菌株分別高出4.72%、12.44%。
【附圖說(shuō)明】：
[0026]圖1 U1-58突變株與U1出發(fā)菌株37°C下木糖發(fā)酵結(jié)果；
[0027]圖2 U1-58突變株與U1出發(fā)菌株各溫度下生長(zhǎng)曲線 [0028] 其中，代表U1出發(fā)菌株；□代表U1-58突變株；
[0029] 圖3 U1-58突變株與U1出發(fā)菌株各溫度下發(fā)酵性能對(duì)比；
[0030] 其中，A為乙醇濃度對(duì)比圖，B為木糖濃度對(duì)比圖，C為糖醇轉(zhuǎn)化率對(duì)比圖；
[0031 ]圖4 U1-58突變株與U1出發(fā)菌株玉米芯酶解液發(fā)酵結(jié)果
[0032] 其中，A為U1出發(fā)菌株，B為U1-58突變株；
[0033]圖5 U1-58突變株與U1出發(fā)菌株玉米芯同步糖化共發(fā)酵發(fā)酵結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】：
[0034]下面通過(guò)具體的實(shí)施方案敘述本發(fā)明。除非特別說(shuō)明，本發(fā)明中所用的技術(shù)手段 均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法。另外，實(shí)施方案應(yīng)理解為說(shuō)明性的，而非限制本發(fā)明的 范圍，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍僅由權(quán)利要求書(shū)所限定。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離本 發(fā)明實(shí)質(zhì)和范圍的前提下，對(duì)這些實(shí)施方案中的物料成分和用量進(jìn)行的各種改變或改動(dòng)也 屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0035] 實(shí)施例l:Ul-58突變菌株誘變篩選
[0036] (1)、誘變和初篩以S.passalidarum NRRL Y-27907為出發(fā)菌株（以下簡(jiǎn)稱(chēng)U1菌 株），等離子誘變25s，將誘變后的菌液稀釋至適當(dāng)濃度，涂布于初篩平板上，37°C倒置培養(yǎng) l-2d后挑取長(zhǎng)勢(shì)較好、表面光滑的突變株用于復(fù)篩。
[0037]初篩平板:木糖50g/L，蛋白胨20g/L，酵母浸粉10g/L，瓊脂20g/L，pH自然。
[0038] (2)、復(fù)篩對(duì)(1)中所得的突變菌株進(jìn)行木糖培養(yǎng)基搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，發(fā)酵培養(yǎng)基為： 木糖100g/L，酵母浸粉22g/L，K2HP〇4 2.5g/L，MgS〇4 0.1g/L。
[0039] 發(fā)酵條件為：裝液量100mL/250mL，菌株初始0D6Q() 1·0，ρΗ 5.5,溫度37°C，轉(zhuǎn)速 120rpm，發(fā)酵5天。發(fā)酵結(jié)束后，高效液相色譜測(cè)定發(fā)酵液中木糖、乙醇的含量，并測(cè)定發(fā)酵 過(guò)程中生物量(菌干重g DCW/L)。篩選出發(fā)酵性能較好的U1-58突變株。U1-58突變株與U1出 發(fā)菌株發(fā)酵過(guò)程中各物質(zhì)變化情況如圖1所示。
[0040] 如圖1可看出，U1-58突變株比出發(fā)菌株對(duì)木糖的利用速率快，乙醇產(chǎn)量高，同時(shí)菌 株生長(zhǎng)速率稍快。U1-58突變株的最大比生長(zhǎng)速率為0.081Γ 1，較U1出發(fā)菌株提高33.33%。 U1-58突變株的木糖在84h時(shí)基本發(fā)酵完全，乙醇濃度達(dá)到35.5g/L，較出發(fā)菌株高出 72.05% ;殘?zhí)橇繛?.5g/L，較出發(fā)菌株低273.33% ;糖醇轉(zhuǎn)化率達(dá)到0.42，較出發(fā)菌株高出 38.82%。其中12h至60h時(shí)間段，U1-58突變株乙醇生成速率、木糖消耗速率分別達(dá)到達(dá)到 0.57g/(L · h)、1.48g/(L · h)，分別較U1 出發(fā)菌株提高67.65%、27.59%·此結(jié)果表明，U1-58突變株單位菌體發(fā)酵木糖產(chǎn)乙醇性能優(yōu)于U1出發(fā)菌株單位菌體發(fā)酵木糖產(chǎn)乙醇性能。
[0041] 實(shí)施例2:不同溫度下U1-58突變株與U1出發(fā)菌株生長(zhǎng)性能的測(cè)定
[0042] 以U1-58突變株和U1出發(fā)菌株互為對(duì)照，在30°(3、33°(3、35°(3、37°(3、39°(3和41°(3