一種裸鼴鼠心肌細(xì)胞的培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，是一種裸鼴鼠心肌細(xì)胞的培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]裸驢鼠(Heterocephalusglaber ,Naked mole-rat)是一種極具研究?jī)r(jià)值的新型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，它具有耐低氧、抗衰老和抗腫瘤等諸多奇特的生物學(xué)特性，在老年病學(xué)、腫瘤學(xué)、免疫學(xué)等醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)研究領(lǐng)域中發(fā)揮著重大作用，具有不可替代的地位。尤其是在耐低氧研究方面，為缺氧相關(guān)的心血管疾病等研究提供了理想的研究載體和科研工具。心肌細(xì)胞是心臟的基本組成單位，是進(jìn)行生理、藥理、病理、毒理及能量代謝等方面研究的主要細(xì)胞來(lái)源，同時(shí)也是心肌組織工程種子細(xì)胞的主要來(lái)源之一。目前，由于裸鼴鼠動(dòng)物來(lái)源珍貴、稀有，且生物學(xué)特性獨(dú)特，國(guó)內(nèi)尚無(wú)針對(duì)裸鼴鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)方法的研究，這極大地影響和限制了新型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物裸鼴鼠在生命科學(xué)研究尤其是在心血管疾病研究中的推廣應(yīng)用。因此，亟需開展培養(yǎng)裸鼴鼠心肌細(xì)胞的相關(guān)技術(shù)研究。
[0003]中國(guó)專利文獻(xiàn)CN104087550A公開了一種大鼠心肌細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，其包括如下步驟:(I)將大鼠心肌組織浸于消化酶混合液中進(jìn)行分次消化至心肌組織松軟后棄去消化液，然后加入DMEM培養(yǎng)基，吹打松軟的心肌組織，取上清進(jìn)行離心收獲細(xì)胞沉淀，所述的消化酶混合液包括0.7?1.0g/L胰蛋白酶和0.5?0.8g/L II型膠原酶；(2)以DMEM培養(yǎng)基重懸步驟(I)所得的細(xì)胞沉淀，將細(xì)胞懸液過(guò)180?220目篩后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中進(jìn)行差速貼壁2?3次，每次40?50分鐘；(3)取差速貼壁后培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞懸液，將心肌細(xì)胞以1.5?2.5 X 15個(gè)/mL的密度接種于培養(yǎng)容器中，接種后將培養(yǎng)容器置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng);其中，步驟(I)和(2)中所述的DMEM培養(yǎng)基為含8?12 % FBS的DMEM培養(yǎng)基，所述的百分比為體積百分比。優(yōu)選步驟(I)消化在溫度為36.5?37.5°C的環(huán)境中進(jìn)行，步驟(2)FBS的濃度為10%，所述細(xì)胞懸液過(guò)200目篩后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中進(jìn)行差速貼壁，差速貼壁的次數(shù)為2次，所述差速貼壁的時(shí)間為每次45分鐘。優(yōu)選步驟(3)中，培養(yǎng)的條件為將培養(yǎng)容器置于37°C、CO2濃度為50mL/L的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0004]但是關(guān)于一種裸鼴鼠心肌細(xì)胞的培養(yǎng)方法目前還未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種裸鼴鼠心肌細(xì)胞的培養(yǎng)方法。該培養(yǎng)方法中，裸鼴鼠的心肌細(xì)胞分離、純化操作步驟簡(jiǎn)單，細(xì)胞貼壁快、存活率高，細(xì)胞培養(yǎng)體系穩(wěn)定性好，是一種較為理想的裸鼴鼠原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)方法，基本可以滿足醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、藥學(xué)和生命科學(xué)各研究領(lǐng)域?qū)β泯B鼠心肌細(xì)胞相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究的要求，適宜在一般實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行推廣應(yīng)用。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:一種裸鼴鼠心肌細(xì)胞的培養(yǎng)方法，包括以下步驟:
[0007](A)向裸鼴鼠心肌組織中加入胰蛋白酶進(jìn)行消化1-2次，棄去上清液；
[0008](B)在步驟(A)中所得的細(xì)胞沉淀中，加入混合消化液，輕輕吹打心肌組織懸液進(jìn)行消化后，靜置；
[0009](C)收集步驟(B)中的上清液，用200目細(xì)胞篩過(guò)濾后，立即加入等量終止液終止消化，并于冷凍離心機(jī)中4°C、1000rpm、離心5min;
[0010](D)步驟(C)中所得的細(xì)胞沉淀，依次重復(fù)操作步驟B、步驟C兩次以上(盡量通過(guò)過(guò)濾篩篩選消化充分的組織懸液)；
[0011](E)收集所有細(xì)胞于同一離心管中，用適量終止液重懸細(xì)胞，并于冷凍離心機(jī)中40C、lOOOrpm、離心5min，棄去上清液，于細(xì)胞沉淀中加入適量終止液重懸細(xì)胞，再次于冷凍離心機(jī)中4°C、lOOOrpm、離心5min，棄去上清液，于細(xì)胞沉淀中加入適量終止液重懸、混勾細(xì)胞；
[0012](F)將步驟(E)中所得細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)容器中，置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，通過(guò)差速貼壁法分離心臟成纖維細(xì)胞與心肌細(xì)胞；
[0013](G)收集步驟(F)中未貼壁的心肌細(xì)胞懸液，于冷凍離心機(jī)中4°C、lOOOrpm、離心5min，所得細(xì)胞沉淀用培養(yǎng)基混懸后，置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
[0014]其中，步驟(A)所述的裸鼴鼠優(yōu)選裸鼴鼠乳鼠(以下簡(jiǎn)稱乳鼠)，所述的乳鼠選擇1-3日齡的新生乳鼠，出生日齡越小越好，并且動(dòng)物雌雄不限。
[0015]步驟(A)所述的裸鼴鼠心肌組織可通過(guò)以下步驟制備得到:
[0016](I)取新生裸鼴鼠乳鼠，用75%酒精消毒后，移入超凈工作臺(tái)內(nèi)；
[0017](2)將乳鼠仰臥位放置，用眼科剪于靠近乳鼠劍突稍偏左上方向，剪開胸腔部位皮膚，剪斷胸骨和肋骨，心臟自然躍出；
[0018](3)用另一眼科剪剪取心尖組織后，置于4°C預(yù)冷的D-hank’s溶液中，充分洗滌3次，洗凈組織中殘留的積血；
[0019](4)將心尖組織移入青霉素小瓶?jī)?nèi)，用眼科剪將其剪成約ImmX ImmX Imm大小的心肌組織塊。所述的青霉素小瓶，首次使用前，先用強(qiáng)酸氧化劑洗液(12%重鉻酸鉀(K2Cr2O7)的濃硫酸(濃H2SO4)混合液)浸泡過(guò)夜，然后自來(lái)水沖洗15-20遍，每遍都要把瓶?jī)?nèi)壁的水盡力甩出去，烘干后，再用雙蒸水沖洗3遍，最后錫箔紙封口，180°C滅菌2h后烘干備用。
[0020]其中，步驟(A)所述的胰蛋白酶濃度為0.08% (w/v)，采用0.25%(w/v)胰蛋白酶和D-hank’s溶液按照體積比1:2混合均勻配制而成。本發(fā)明中胰蛋白酶的用量需依據(jù)待消化的心肌組織的量進(jìn)行確定，原則上需要完全浸沒心肌組織并有適量多余。胰蛋白酶濃度過(guò)高，容易引起消化過(guò)度而導(dǎo)致?lián)p傷組織，后續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)中，細(xì)胞貼壁數(shù)量少，功能性細(xì)胞數(shù)量也會(huì)減少，具體可參照對(duì)比例I。
[0021]步驟(A)中消化次數(shù)不宜超過(guò)2次，否則可能消化過(guò)度容易損傷心肌組織;每次消化時(shí)間5?1min，優(yōu)選8min ；消化的溫度35?37°C，優(yōu)選35°C。
[0022]其中，步驟(B)中混合消化液為0.125% (w/v)胰蛋白酶和0.3%(w/v) Π型膠原酶按照體積比2:1混合均勻配制而成，混合消化液中胰蛋白酶終濃度為0.08% (w/v)，Π型膠原酶終濃度為0.1 % (w/V)。步驟(B)中每次消化時(shí)間5?1min，優(yōu)選8min ；消化的溫度35?37°C，優(yōu)選35°C ο與現(xiàn)有技術(shù)中混合消化液濃度的對(duì)比試驗(yàn)參見對(duì)比例2。
[0023]其中，步驟(C)和步驟(E)所述的終止液為含8?12% (v/v)胎牛血清(FetalBovine Serum，F(xiàn)BS)的DMEM培養(yǎng)基，優(yōu)選含8?12%(v/v)胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基。用DMEM低糖培養(yǎng)基，細(xì)胞狀態(tài)會(huì)更好，且生長(zhǎng)速度更佳，而DMEM高糖培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果則差一些。與采用DMEM高糖培養(yǎng)基的對(duì)比試驗(yàn)參見對(duì)比例3。所述的DMEM低糖培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為1000ml/L，DMEM高糖培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為4500ml/L。
[0024]其中，步驟(D)所述的重復(fù)操作次數(shù)需依據(jù)待消化的心肌組織的量進(jìn)行確定，分次消化直至心肌組織松軟，完全看不見組織呈顆粒狀，重復(fù)消化次數(shù)為6?10次，優(yōu)選8次。
[0025]其中，步驟(F)所述的差速貼壁法細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間為60?90min，優(yōu)選70min。利用差速貼壁法進(jìn)行純化細(xì)胞，其基本原理是利用成纖維細(xì)胞比心肌細(xì)胞更容易貼附于培養(yǎng)皿表面的特性，將細(xì)胞懸液預(yù)接種于培養(yǎng)瓶孵育，這樣，絕大多數(shù)成纖維細(xì)胞均已貼壁，剩余在懸液中的主要就是心肌細(xì)胞(劉嘉祺，孫云云.乳鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)方法[J].微量元素與健康研究，2012,29(4):7-9.)。培養(yǎng)60?90min后，容易貼壁的是心臟成纖維細(xì)胞，沒有貼壁的多為心肌細(xì)胞，在細(xì)胞懸液中收集后，用于后續(xù)細(xì)胞的培養(yǎng);而貼壁的心臟成纖維細(xì)胞被丟棄處理。
[0026]所述的步驟(F)和步驟(G)中培養(yǎng)箱的環(huán)境溫度為35?37°C，02體積濃度為5%、C02體積濃度為5%。
[0027]普通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)溫度一般在37°C左右，而本發(fā)明經(jīng)過(guò)摸索發(fā)現(xiàn)，裸鼴鼠所有細(xì)胞消化和培養(yǎng)溫度設(shè)定在35-37°C較佳，優(yōu)選35°C，過(guò)高或過(guò)低則細(xì)胞不易增殖，或延緩細(xì)胞生長(zhǎng)周期。對(duì)比試驗(yàn)參見對(duì)比例4。
[0028]培養(yǎng)箱⑶2濃度與其他動(dòng)物是一樣的，不同之處在于通過(guò)三氣培養(yǎng)箱控制了O2濃度，O2濃度設(shè)置在體積濃度為5%，這對(duì)其他動(dòng)物來(lái)講，已經(jīng)是低氧環(huán)境，因?yàn)榇髿獾难鯕怏w積濃度約為20%，一般動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)環(huán)境氧氣濃度也約為20%。對(duì)比試驗(yàn)參見對(duì)比例5。
[0029]其中，步驟(G)所述的培養(yǎng)基為含8?12%(V/V)FBS、1%(V/V)青、鏈霉素雙抗抗菌液、0.1mmoI/L 5-Brdu(5-Bromo-2_deoxyUridine)的DMEM低糖培養(yǎng)基。用DMEM低糖培養(yǎng)基，細(xì)胞狀態(tài)會(huì)更好，且生長(zhǎng)速度更佳，而DMEM高糖培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果則差一些。與采用DMEM高糖培養(yǎng)基的對(duì)比試驗(yàn)參見對(duì)比例3。
[0030]心肌細(xì)胞是一種功能性細(xì)胞，具有自發(fā)搏動(dòng)的特征，以此判定是否為心肌細(xì)胞，但是這一步驟中，仍可能殘存心臟成纖維細(xì)胞，只是數(shù)量大大減少，故而在培養(yǎng)液中加入抑制心臟成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的5-Brdu，以達(dá)到給心肌細(xì)胞提供最好的培養(yǎng)體液環(huán)境。
[0031]本發(fā)明所用試劑和耗材均可市售獲得。