紫白菜花色苷生物合成調(diào)控基因BrTT8在培育光誘導(dǎo)型紫色番茄的應(yīng)用及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于是生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及紫白菜花色巧生物合成調(diào)控基因化TT8在 培育光誘導(dǎo)型紫色番茄的應(yīng)用，還設(shè)及培育光誘導(dǎo)型紫色番茄的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 番茄作為世界范圍內(nèi)廣泛栽培的大宗蔬菜作物，其果實(shí)是廣受大眾所喜愛的蔬菜 和水果。類黃酬作為一種分布于高等植物體內(nèi)的色素，越來越多的研究該類物質(zhì)不僅在植 物應(yīng)對不良環(huán)境(紫外照射、低溫、干旱及病原菌入侵)時(shí)發(fā)揮積極作用，同時(shí)也對大量的人 類慢性疾?。ㄍ?、血管病和腫瘤）的治療和恢復(fù)有一定的幫助作用。大量資料證實(shí)，規(guī)律性的 食用富含類黃酬的食物對于人體的保健有著重要的價(jià)值。番茄作為一種日常食譜中出現(xiàn)頻 率較高的水果或蔬菜，自然栽培的番茄果實(shí)中的類黃酬含量相對偏低，尤其缺乏花色巧。通 過基因工程的方法，我們將控制紫白菜中花色巧生物合成的轉(zhuǎn)錄因子化TT8異源表達(dá)于與 番茄中，獲得了光誘導(dǎo)型的紫色番茄。番茄果實(shí)的色澤是育種工作者關(guān)注的重要問題，我們 通過異源表達(dá)外源基因的方法，不僅改變了整個(gè)番茄植株的顏色，同時(shí)還改變了果實(shí)表皮 的顏色。通過HPLC-MS/MS對果實(shí)中類黃酬成分的分析，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)中花色巧和黃 酬醇的含量都有明顯地提高。傳統(tǒng)的育種方法周期長且效果不確定。近年來，隨著基因工程 的迅速發(fā)展和技術(shù)的日臻完善，轉(zhuǎn)基因技術(shù)在培育優(yōu)良作物品種方面展示了巨大的潛力。 轉(zhuǎn)基因技術(shù)勢必會(huì)越來越廣泛的應(yīng)用于番茄品種的品質(zhì)改良和遺傳育種。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供紫白菜花色巧生物合成調(diào)控基因化TT8在 培育光誘導(dǎo)型紫色番茄品種中的應(yīng)用;本發(fā)明的目的之二在于提供紫白菜花色巧生物合成 調(diào)控基因化TT8在提高番茄果實(shí)中花色巧含量中的應(yīng)用；本發(fā)明的目的之Ξ在于提供紫白 菜花色巧生物合成調(diào)控基因化TT8培育光誘導(dǎo)型紫色番茄品種的方法。
[0004] 為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，經(jīng)大量研究，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0005] 1、紫白菜花色巧生物合成調(diào)控基因化TT8在培育光誘導(dǎo)型紫色番茄品種中的應(yīng) 用，所述紫白菜花色巧生物合成調(diào)控基因化TT8的核巧酸序列如SEQ ID No.3所示。
[0006] 2、紫白菜花色巧生物合成調(diào)控基因化TT8在提高番茄果實(shí)中花色巧含量中的應(yīng) 用，所述紫白菜花色巧生物合成調(diào)控基因化TT8的核巧酸序列如SEQ ID No.3所示。
[0007] 3、紫白菜花色巧生物合成調(diào)控基因化TT8培育光誘導(dǎo)型紫色番茄品種的方法，包 括如下步驟：
[000引a.構(gòu)建含如SEQ ID No. 3所示核巧酸序列的植物重組表達(dá)載體，然后轉(zhuǎn)化微生物 轉(zhuǎn)化體，制得工程菌；
[0009] b.將步驟a所得工程菌轉(zhuǎn)化番茄外植體，共培養(yǎng)后，誘導(dǎo)再生芽，然后將再生芽切 下進(jìn)行生根培養(yǎng)，即得光誘導(dǎo)型紫色番茄品種。
[0010] 優(yōu)選的，所述重組表達(dá)載體由沈Q ID No.4和沈Q ID No.5所示序列為引物克隆攜 帶酶切位點(diǎn)的紫白菜花色巧生物合成調(diào)控基因化TT8,然后經(jīng)Sac I和Xba I酶切后再與經(jīng) 同樣雙酶切的地1121載體連接制得。
[0011]優(yōu)選的，所述微生物轉(zhuǎn)化體的制備方法如下：將根癌農(nóng)桿菌LBA4404、含有游動(dòng)質(zhì) 粒Prk2013的大腸桿菌和含有重組表達(dá)載體的大腸桿菌DH5a單菌落依次重疊均勻涂在 pH7.2的Y邸固體培養(yǎng)基中央直徑為5mm的圓圈中，28±1°C黑暗條件下倒置培養(yǎng)至長出菌 團(tuán)，用接種環(huán)挑取菌團(tuán)，在含有50mg/L利福平、500mg/L鏈霉素和50mg/L卡那霉素、PH7.2的 Y邸固體培養(yǎng)基中劃線，然后在28±1°C黑暗條件下倒置培養(yǎng)2-3天至長出單菌落，挑取單菌 落，用含有50mg/L利福平、500mg/L鏈霉素、50mg/L卡那霉素、pH7.2的Y邸液體培養(yǎng)基在28 ± 1 °C、黑暗、200巧m條件下?lián)u床培養(yǎng)至菌液0D6日日為1.8-2.0，提取質(zhì)粒，用Sac I和Xba I進(jìn)行 雙酶切鑒定，陽性克隆為微生物轉(zhuǎn)化體。
[0012]優(yōu)選的，所述共培養(yǎng)為在含30g/L的薦糖、Img/L嗎隙乙酸、1.75mg/L玉米素、pH為 5.8的MS固體培養(yǎng)基中于28 ± 2°C、黑暗下培養(yǎng)48小時(shí)。
[0013] 優(yōu)選的，所述誘導(dǎo)再生芽的方法為在含有30g/L的薦糖、l.Omg/L嗎I噪乙酸、 1.75mg/L玉米素、500mg/L簇節(jié)青霉素和lOOmg/L卡那霉素、抑為5.8的MS固體培養(yǎng)基中，在 26±2°C、光周期16h/d、光照強(qiáng)度3000-50001X條件下培養(yǎng)至長出再生芽。
[0014] 優(yōu)選的，所述生根培養(yǎng)為將芽長為2-3cm的再生芽切下，轉(zhuǎn)入含有30g/L的薦糖、 250mg/L簇節(jié)青霉素和50mg/L卡那霉素、pH為5.8的15固體培養(yǎng)基中，在26±2°0、光周期 16h/d、光照強(qiáng)度3000-50001X條件下培養(yǎng)至生根。
[0015] 本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明通過克隆紫白菜花色巧生物合成調(diào)控基因化TT8， 并構(gòu)建含紫白菜花色巧生物合成調(diào)控基因化TT8的植物重組表達(dá)載體，將該載體轉(zhuǎn)入番茄 后所得轉(zhuǎn)基因番茄陽性植株中化TT8基因較非轉(zhuǎn)基因植株有顯著的表達(dá)。在強(qiáng)光栽培條件 下，轉(zhuǎn)基因番茄葉、莖、花瓣和果實(shí)的上端均有顯著地花色巧積累，而野生型番茄則無明顯 地花色巧積累。此外，在弱光條件下栽培的野生型與轉(zhuǎn)基因番茄均無可見的花色巧積累。與 傳統(tǒng)育種方法相比，本發(fā)明采用基因工程技術(shù)，高效并可穩(wěn)定遺傳地增加了番茄植株的花 色巧含量，為番茄的品種改良作出了積極的探索，也為觀賞植物的花色育種提供了參考和 借鑒，具有良好的市場前景和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
【附圖說明】
[0016] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖：
[0017] 圖1紫白菜花色巧生物合成調(diào)控基因化TT8表達(dá)載體地1121::化TT8酶切驗(yàn)證的瓊 脂糖凝膠電泳分析圖（M為Maker，1表示地1121::化TT8載體酶切結(jié)果，2表示地1121::化TT8 質(zhì)粒)。
[0018] 圖2為番茄轉(zhuǎn)基因組織培養(yǎng)過程(A:番茄愈傷組織分化;B:番茄抗性植株的產(chǎn)生）。 [0019]圖3為PCR檢測ΝΡΤΠ 報(bào)告基因在轉(zhuǎn)基因番茄植株中的表達(dá)(M為Maker，CK-為陰性 對照，CK+為陽性對照，CK-為空白對照，1#，2#和3#為不同的轉(zhuǎn)基因番茄株系）。
[0020] 圖4為化TT8基因在轉(zhuǎn)基因番茄陽性植株中的表達(dá)量(WT為非轉(zhuǎn)基因番茄，1#，2#和 3#為不同的轉(zhuǎn)基因番茄株系）。
[0021] 圖5為強(qiáng)光照栽培條件下轉(zhuǎn)基因番茄與非轉(zhuǎn)基因番茄表型（左側(cè)圖片為轉(zhuǎn)基因番 茄，右側(cè)圖片為非轉(zhuǎn)基因番茄）。
[0022] 圖6為轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因番茄成熟果實(shí)中黃酬醇的含量(WT為非轉(zhuǎn)基因番茄，1#， 2#和3#為不同的轉(zhuǎn)基因番茄株系）。
[0023] 圖7為轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因番茄成熟果實(shí)中花色巧的含量(WT為非轉(zhuǎn)基因番茄，1#， 2#和3#為不同的轉(zhuǎn)基因番茄株系）。
[0024] 圖8為不同光照強(qiáng)度下轉(zhuǎn)基因番茄與非轉(zhuǎn)基因番茄植株色素積累變化。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面將結(jié)合附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。實(shí)施例中未注明具體 條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第Ξ版，J.薩姆布魯克等著） 中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[00%] 本發(fā)明實(shí)施例中使用的番茄品種為"Solanum lycopersicon Mil 1. CV. Ailsa 化aig"，為本實(shí)驗(yàn)室留種。pMD 19-Τ載體為寶生物公司產(chǎn)品，pBI 121載體、大腸桿菌D冊α、含 有游動(dòng)質(zhì)粒Ρ服2013的大腸桿菌"協(xié)助"菌(簡稱helper)和根癌農(nóng)桿菌LBA4404由本實(shí)驗(yàn)室 保存；RNA提取試劑盒、RNA PCR Kit (AMV)Ver. 3.0試劑盒、DNA提取試劑盒Universal Genomic DNA Exhaction Kit Ver.3.0、連接試劑盒DNA Ligat