2000巧m、4°C離屯、lOmin，取上清液移入離屯、管中； ④ 在上述離屯、管中加入體積比為24:1的氯仿和異戊醇混合液，輕輕混勻lOmin， 1200化pm、4°C離屯、lOmin，取上清液移入另一離屯、管中； @在上述離屯、管中加入2/^3體積(相對于步驟(4)中的上清液)的-20°〇預(yù)冷的異丙醇， 輕輕搖動(dòng)5min，8000巧m、4°C離屯、lOmin，去上清； ⑥ 將得到的沉淀用75vol%乙醇和lOmmol/L醋酸鐘洗涂2~3次，每次8000巧m，室溫離屯、 5min； ⑦ 加入預(yù)冷的95vol%乙醇，輕輕上下顛倒，80(K)rpm室溫離屯、lOmin，棄乙醇，真空抽干 或自然驚干； ⑧ 加入10化L 10 X TE(Tris/邸TA)緩沖液，輕輕敲打使沉淀溶解； ⑨ 加入化L lOmg/mL的RNaseA于37°C水浴比，去除RNA; ⑩ 將得到的DNA提取物于-20°C冰箱膽藏備用； (3 ) SSR分子標(biāo)記的檢測:對上述提取的DNA進(jìn)行基因 SSR標(biāo)記的PCR擴(kuò)增； PCR擴(kuò)增體系為：總體積20化，包括：10 25mmol/LMgC12化L，lOmmol/L dNTP 0.4yL，抓/μL Taq DNA酶0.化L，10皿ol/L SSR標(biāo)記正向引物和反向引物總體積各 1.化L，濃度20ng~30ngAiL提取的模板DNA化L，dd肥0 10.化1^; PCR反應(yīng)條件:94°C5min; 94°C30second，W 引物的退火溫度30second，72°C30second， 30 個(gè)循環(huán);72°C5min (4)電泳檢測：將上述PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物與化L加樣緩沖液混勻，點(diǎn)樣3.扣L于非變性 聚丙締酷胺凝膠上電泳，非變性聚丙締酷胺凝膠的體積百分比濃度為10%，電泳緩沖液為1 X TBE，電壓150v，電流200mA，功率200W，電泳45min，銀染，顯色，拍照，分析結(jié)果。
[0024] 銀染的具體工藝為電泳完成后卸下并拆開玻璃板，膠板卸下后，用去離子水水洗 5-8秒，漸干水分后，在銀染液（1.5克硝酸銀和1500ml水）中避光銀染8分鐘，銀染后，用去 離子水水洗5-8秒，漸干水分，放入顯影液（16克氨氧化鋼、1000ml水和8ml甲醒）中，至顯影 后取出水洗后即可讀數(shù)。
[0025] 巧)菌種鑒定:采用6對SSR引物對金針茹菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過對照markerl可確 定各SSR引物擴(kuò)增的等位片段的數(shù)量和相對分子量，找到符合編號組合為：（1+化3)(1+2+ 3)(1+2)(1+2)1(1+2)的菌種，即可確定該菌種為金針茹菌種，如圖1中箭頭標(biāo)注所示。為保 證鑒定的準(zhǔn)確性，建議進(jìn)行Ξ次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
[0026] 本發(fā)明的一種金針茹F101菌種的SSR標(biāo)記指紋圖譜，該指紋圖譜由6對SSR標(biāo)記組 成，是基于金針茹基因組簡單重復(fù)序列片段開發(fā)SSR引物，擴(kuò)增帶型好，重復(fù)性高的SSR引 物，標(biāo)記引物詳細(xì)信息如表1。
[0027] 表1 SSR標(biāo)記詳細(xì)信息列表
本發(fā)明的一種金針茹FlOl菌種的SS財(cái)示記指紋圖譜的應(yīng)用，是利用香茹基因組簡單重 復(fù)序列片段開發(fā)的6對SSR引物，通過對收集的25份金針茹栽培品種的SSR引物帶型擴(kuò)增，本 發(fā)明確定了 6對SSR引物在金針茹F101菌種中擴(kuò)增出的等位片段的數(shù)量并編號(表2)，通過 不同SSR等位片段的編號組合可有效識別F101菌種（圖2-7)。通過對照天根Marked可確定 各SSR引物擴(kuò)增的等位片段的相對分子量，存在F101菌種特異SSR等位片段組合的菌種，即 是金針茹F101菌種，該菌種的編號組合為：（1+化3)(1+2+3)(1+2)(1+2)1(1+2)。
[0028]表2 SSR引物擴(kuò)增的等位片段信息匯總表。
[0029]本發(fā)明雖然W較佳實(shí)施例公開如上，但其并不是用來限定本發(fā)明，任何本領(lǐng)域技 術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可W做出可能的變動(dòng)和修改，因此本發(fā)明的保 護(hù)范圍應(yīng)當(dāng)W本發(fā)明權(quán)利要求所界定的范圍為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 金針菇F101菌種的SSR標(biāo)記引物，其特征在于，所述標(biāo)記引物由名稱為Fvml，F(xiàn)vm2、 Fvm3、Fvm4、Fvm5、Fvm6的6對SSR引物中至少一對構(gòu)成;所述6對引物的正反核苷酸序列如 下： Fvml：GAGGCGTCACCAAGGGATG,CTCAAAGGAATGCGCTGCA； Fvm2：TTTCGCGCAGGTTTGG,TTGTGAGGGGACGGGTATG； Fvm3：GTGAAGAAGAATAAGAGGGAGC,TGAGACTAGTGATGACGATGAAG； Fvm4：TCATCTGTCCATTCATCATCA,GTTCAACACATTCACGCAA； Fvm5：CAGCCCATTTTTCCACCC,CGAAGATTCCATTGACGATTTC； Fvm6:CATTGTTCCTTCAGTCCGAGA，TTCCATCCGAATCCGTAGC。2. 如權(quán)利要求1所述的金針菇F101菌種的SSR標(biāo)記引物通過指紋圖譜在菌種檢測鑒定 中的應(yīng)用。3. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟如下： (1)菌絲培養(yǎng):將金針菇菌種轉(zhuǎn)接到馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基中，18°C~20°C下避光搖瓶培 養(yǎng)，5d_7d后收集菌絲； (2 )基因組D N A的提取：用C T A B (十六烷基三甲基溴化銨）法提取上述菌絲的基因組 DNA，紫外分光光度法檢測總基因組DNA濃度和純度，調(diào)整樣品DNA的濃度一致； (3) SSR分子標(biāo)記的檢測:對上述提取的DNA進(jìn)行基因 SSR標(biāo)記的PCR擴(kuò)增； PCR 擴(kuò)增體系為：總體積 20yL，包括：10XPCR buffer 2yL，25mmol/L MgC122yL， lOmmol/L dNTP 0.4yL，5U/yL Taq DNA酶0.2yL，10ymol/L SSR標(biāo)記正向引物和反向引物總 體積各 1.5yL，濃度20ng~30ng/yL提取的模板DNA 2yL，ddH20 10.4yL; PCR反應(yīng)條件：94°C5min; 94°C30second，以引物的退火溫度30second，72°C30second， 30 個(gè)循環(huán)；72°C5min; (4) 電泳檢測：將上述PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物與5yL加樣緩沖液混勻，點(diǎn)樣3.5yL于非變性 聚丙烯酰胺凝膠上電泳，非變性聚丙烯酰胺凝膠的體積百分比濃度為10%，電泳緩沖液為1 X TBE，電壓150v，電流200mA，功率200W，電泳45min，銀染，顯色，拍照，分析結(jié)果； (5 )菌種鑒定:采用6對SSR引物對金針燕菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過對照marker I可確定各 SSR引物擴(kuò)增的等位片段的數(shù)量和相對分子量，找到符合編號組合為：（1+2+3)(1+2+3) (1+ 2) (1+2) 1(1+2)的菌種，即可確定該菌種為金針菇菌種。4. 如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟(2)中CTAB法提取菌絲的基因組DNA工藝 包括： ① 將液氮冷凍干燥的金針菇菌絲研磨成粉末，加入65°C預(yù)熱的2XCTAB抽提液，于65°C 保溫45~60min，間或輕搖混勻； ② 12000rpm、4°C離心20min，取上清液； ③ 在上述上清液中加入體積比為2 5 : 2 4 :1的酚、氯仿和異戊醇的混合液，輕輕混勻 lOmin，12000rpm、4°C離心10min，取上清液移入離心管中； ④ 在上述離心管中加入體積比為2 4 : 1的氯仿和異戊醇混合液，輕輕混勻10 m i η， 12000rpm、4°C離心10min，取上清液移入另一離心管中； ⑤ 在上述離心管中加入2/3體積(相對于步驟(4)中的上清液）的-20°C預(yù)冷的異丙醇， 輕輕搖動(dòng)5min，8000rpm、4°C離心10min，去上清； ⑥ 將得到的沉淀用75vol%乙醇和lOmmol/L醋酸鉀洗滌2~3次，每次8000rpm，室溫離心 5min； ⑦ 加入預(yù)冷的95vol%乙醇，輕輕上下顛倒，8000rpm室溫離心10min，棄乙醇，真空抽干 或自然晾干； ⑧ 加入l〇〇yL 10 X TE(Tris/EDTA)緩沖液，輕輕敲打使沉淀溶解； ⑨ 加入lyL 10mg/mL的RNaseA于37°C水浴lh，去除RNA; ⑩ 將得到的DNA提取物于-20°C冰箱貯藏備用。5. 如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，重復(fù)實(shí)施步驟1-4三次，驗(yàn)證準(zhǔn)確率。6. 如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟(4)中銀染的具體工藝為銀染的具體工 藝為電泳完成后卸下并拆開玻璃板，膠板卸下后，用去離子水水洗5-8秒，瀝干水分后，在 銀染液(1.5克硝酸銀和1500ml水）中避光銀染8分鐘，銀染后，用去離子水水洗5-8秒，瀝干 水分，放入顯影液（16克氫氧化鈉、1000ml水和8ml甲醛）中，至顯影后取出水洗后即可讀 數(shù)。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種金針菇F101菌種的SSR標(biāo)記引物及其指紋圖譜應(yīng)用，所述標(biāo)記引物由引物名稱為Fvm1，F(xiàn)vm2、Fvm3、Fvm4、Fvm5、Fvm6中的6對SSR引物中至少一對構(gòu)成，其步驟如下：（1）菌絲固體培養(yǎng)、（2）基因組DNA的提取、（3）SSR分子標(biāo)記的檢測、（4）電泳檢測、（5）菌種鑒定。本發(fā)明提供的SSR標(biāo)記與常規(guī)形態(tài)學(xué)檢測、拮抗試驗(yàn)、出菇試驗(yàn)相比，具有檢測時(shí)間短，準(zhǔn)確性高，重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)。
【IPC分類】C12N15/11, C12Q1/68, C12Q1/04
【公開號】CN105506124
【申請?zhí)枴緾N201610017183
【發(fā)明人】沈穎越, 金群力, 蔡為明, 宋婷婷, 范麗軍, 馮偉林, 李良英, 田芳芳
【申請人】浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【公開日】2016年4月20日
【申請日】2016年1月12日