豬圓環(huán)病毒2型Cap基因修飾改造重組抗原及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于獸用疫苗研究領(lǐng)域，涉及一種豬圓環(huán)病毒2型抗原及其應(yīng)用，尤其涉及 一種豬圓環(huán)病毒2型Cap基因修飾改造重組抗原及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬圓環(huán)病毒2型（porcine circovirus type 2，PCV2)是豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病 (porcine circovirus-associated disease，PCVAD)的主要病毒性病原體，主要感染豬的 免疫器官，導(dǎo)致豬的免疫抑制，造成各種病毒或細(xì)菌病的并發(fā)或繼發(fā)感染，導(dǎo)致豬的生長抑 制或死亡。常見混合感染的病毒病如:PRDC(育肥豬的慢性呼吸道病綜合征）、PRRSV、PPV等， 常見的細(xì)菌混合感染病原如：多殺性巴氏桿菌、肺炎支原體等。PCVAD主要包括豬斷奶后多 系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)、豬皮炎腎病綜合征、仔豬先天性震顫、增生性壞死性肺炎、豬呼道 疾病綜合征、母豬繁殖障礙(后期流產(chǎn))等，其中以PMWS的危害最為嚴(yán)重。這些免疫抑制性疾 病嚴(yán)重影響豬體的健康及生產(chǎn)性能，給我國及世界各國的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失， 被世界公認(rèn)為重要的豬傳染病之一。
[0003] 由于圓環(huán)病毒對各種消毒劑都有很強(qiáng)的抵抗力，生產(chǎn)中很難將其凈化，預(yù)防該病 的首要措施是采用疫苗進(jìn)行預(yù)防接種。迄今為止，國外有5種商品化的疫苗上市，其中3種為 亞單位疫苗，其中進(jìn)入國內(nèi)的主要為勃林格殷格翰動物保健公司的桿狀病毒載體VP2Cap亞 單位疫苗，具有明顯預(yù)防效果，但其價格昂貴。截至目前國內(nèi)注冊生產(chǎn)的均為豬圓環(huán)病毒2 型滅活疫苗，亞單位疫苗尚無注冊記錄，但已采用不同的表達(dá)載體廣泛開展亞單位疫苗的 研究。雖然，商品化的PCV2疫苗已經(jīng)推廣應(yīng)用，且生產(chǎn)實(shí)踐表明，這些疫苗都能夠有效降低 PCVAD的臨床癥狀，但是這些疫苗并不能完全阻止PCV2的感染和傳播?；谀壳吧唐坊瘉唵?位疫苗價格昂貴且圓環(huán)病毒毒力弱，全病毒培養(yǎng)獲得高滴度病毒難度大，免疫保護(hù)效果不 甚理想，以及在國內(nèi)使用率還不高的現(xiàn)狀，研究一種更為安全、高效、廣譜、低廉的疫苗十分 必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種豬圓環(huán)病毒2 型Cap基因修飾改造重組抗原。該抗原含有篩選確定的具有顯著免疫增強(qiáng)作用的基因序列。
[0005] 本發(fā)明的另一目的在于提供所述的豬圓環(huán)病毒2型Cap基因修飾改造重組抗原的 應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的再一目的在于提供一種豬圓環(huán)病毒2型Cap基因修飾改造亞單位疫苗。該 疫苗含有上述所述的豬圓環(huán)病毒2型Cap基因修飾改造重組抗原。
[0007] 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0008] 本發(fā)明的一種豬圓環(huán)病毒2型Cap基因修飾改造重組抗原，所述的改造重組抗原是 將目前在我國豬群中廣泛流行的豬圓環(huán)病毒2型代表毒株豬圓環(huán)病毒2型LG株的主要免疫 保護(hù)性抗原Cap蛋白去核定位序列(NLS)后的Cap基因進(jìn)行修飾改造后構(gòu)建得到。PCV2Cap蛋 白N端前41個氨基酸是其核定位序列(NLS)含有較多的精氨酸，蛋白疏水性較強(qiáng)，全長序列 很難在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，所以本發(fā)明使用去核定位序列(NLS)的Cap基因。所述的改造 重組抗原含有以下(a)或(b)所示的氨基酸序列：
[0009] (a)SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；或
[0010] (b)將SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列通過一個或多個氨基酸殘基的替換、缺失或 插入而獲得的仍具有抗原功能的蛋白衍生物。
[0011]在本發(fā)明的一個具體實(shí)施例中，所述的改造重組抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
[0012] 所述的SEQ ID NO:2如下：
[0013] NGIFNTRLSCTFGYTVKATTVRTPSWAVDMMRFNINDFVPPGGGTNEISIPFEYYRIRKVKVEFWPCSPITQGDRGV GSTAVILDDNFVTRATALTYGPYVNYSSRHTIPQPFSYHSRYFTPKPVLDSTIDYFQPNNKRNQLWLRLQTSANVDH VGLGIAFENSTYDQDYNIRVTMYVQFREFNLKDPPLKPQACTFGYTVKATTVRTPSffAVDMMRFNINDFVP〇
[0014] 編碼所述的改造重組抗原的核苷酸序列，具有以下(a)、（b)或(c)所示的核苷酸序 列：
[0015] (a)SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列;或
[0016] (b)編碼SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列的核苷酸序列;或
[0017] (c)編碼具有抗原功能的蛋白衍生物的核苷酸序列，該蛋白衍生物通過將SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列的一個或多個氨基酸殘基的替換、缺失或插入而獲得。
[0018]在本發(fā)明的一個具體實(shí)施例中，所述的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0019]所述的SEQ ID NO: 1 如下：
[0020] AATGGCATCTTCAACACCCGCCTCTCCTGCACCTTCGGATATACTGTCAAGGCTACCACAGTCAGAACGCCCTCCTG GGCGGTGGACATGATGAGATTTAATATTAACGACTTTGTTCCCCCGGGAGGGGGGACCAACGAAATCTCTATACCCT TTGAATACTACAGAATAAGAAAGGTTAAGGTTGAATTCTGGCCCTGCTCCCCAATCACCCAGGGTGACAGGGGAGTG GGCTCCACTGCTGTTATTCTAGATGATAACTTTGTAACTAGGGCCACAGCCCTAACCTATGGCCCCTATGTAAACTA CTCCTCCCGCCATACAATCCCCCAACCCTTCTCCTACCACTCCCGGTACTTTACCCCCAAACCTGTCCTTGATTCCA CTATTGATTACTTCCAACCAAACAACAAAAGGAATCAGCTTTGGCTGAGACTACAAACCTCGGCAAATGTGGACCAC GTAGGCCTCGGCATTGCGTTCGAAAACAGTACATACGACCAGGACTACAATATCCGGGTAACTATGTATGTACAATT CAGAGAATTTAATCTTAAAGACCCCCCACTTAAACCCCAAGCTTGCACCTTCGGATATACTGTCAAGGCTACCACAG TCAGAACGCCCTCCTGGGCGGTGGACATGATGAGATTTAATATTAACGACTTTGTTCCCo
[0021] 含有本發(fā)明所述的核苷酸序列的重組表達(dá)載體以及含有該載體的宿主細(xì)胞也在 本發(fā)明所保護(hù)的范圍之內(nèi)。
[0022] 進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了本發(fā)明所述的改造重組抗原在制備預(yù)防豬圓環(huán)病毒病 疫苗中的應(yīng)用。
[0023] 所述的核苷酸序列在制備預(yù)防豬圓環(huán)病毒病疫苗中的應(yīng)用。
[0024] -種豬圓環(huán)病毒2型Cap基因修飾改造亞單位疫苗，含有本發(fā)明所述的改造重組抗 原。
[0025]本發(fā)明采用基因修飾改造技術(shù)和策略，將豬圓環(huán)病毒2型LG株(購于哈爾濱維科生 物技術(shù)開發(fā)公司）去核定位信號后的Cap基因進(jìn)行修飾改造，克隆入原核表達(dá)質(zhì)粒如pET-32a( + )構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(BL21、BL21(DE3)或BL21(DE3)pLys系 列等)表達(dá)改造重組抗原，采用內(nèi)毒素去除技術(shù)去除重組抗原內(nèi)毒素后，經(jīng)BCA蛋白定量分 析試劑盒定量后制備疫苗，小鼠免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該改造重組蛋白制備的疫苗能夠刺激 機(jī)體產(chǎn)生高水平的中和抗體，并且均高于商品化的全病毒滅活疫苗組和單獨(dú)的去核定位序 列后的Cap蛋白免疫組，具有最高的抗體水平，并具有價廉、安全、穩(wěn)定、高產(chǎn)、容易保存和應(yīng) 用的優(yōu)點(diǎn)，因而本發(fā)明具有良好的應(yīng)用前景。
[0026]本發(fā)明的原理是:本發(fā)明結(jié)合先進(jìn)的設(shè)計(jì)理念采用基因修飾改造技術(shù)，針對基因 工程疫苗設(shè)計(jì)首選的最佳目的抗原即病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白Cap，該蛋白是病毒的主要免疫 保護(hù)性抗原，能夠誘導(dǎo)動物機(jī)體產(chǎn)生特異的免疫以及包含有病毒特異類型的抗原表位。篩 選具有免疫增強(qiáng)作用的基因，研制豬圓環(huán)病毒2型Cap基因修飾改造亞單位疫苗，以期從根 本上解決目前疫苗免疫價格昂貴、獲得高滴度病毒難度大、抗原性不高以及保護(hù)力不完全 等缺陷，該研究成果對防控我國豬圓環(huán)病毒2型感染引起的相關(guān)疾病具有重要的意義。
[0027] 本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：
[0028] 采用分子生物學(xué)，蛋白組學(xué)以及反向疫苗學(xué)等相關(guān)技術(shù)研發(fā)高效的PCV2新型疫苗 已經(jīng)成為未來疫苗的發(fā)展趨勢。目前已經(jīng)有重慶理工大學(xué)和南京農(nóng)業(yè)大學(xué)成功研制的豬圓 環(huán)病毒表位肽疫苗，并申獲了專利。但選定一段具有免疫增強(qiáng)作用的基因研究其對Cap蛋白 免疫原性的影響尚無報道。傳統(tǒng)滅活疫苗全病毒培養(yǎng)獲得高滴度病毒難度大，商品化亞單 位疫苗制作成本的高居不下，以及免疫保護(hù)效果的不理想等現(xiàn)狀加速了研究豬圓環(huán)病毒新 型疫苗的進(jìn)程。本發(fā)明采用基因修飾改造技術(shù)，通過篩選具有免疫增強(qiáng)作用的基因，并將之 與去核定位信號后的Cap基因一起進(jìn)行人工合成獲得改造后的重組基因，利用原核表達(dá)系 統(tǒng)獲得高產(chǎn)量、低成本、穩(wěn)定性好的重組蛋白并采用內(nèi)毒素去除技術(shù)獲得安全性更高的疫 苗。由于對表達(dá)蛋白進(jìn)行了內(nèi)毒素的去除處理，免疫動物注射部位沒有出現(xiàn)紅腫、發(fā)熱等現(xiàn) 象，也沒有出現(xiàn)接種不良反應(yīng)，食欲正常，精神狀態(tài)良好，提示我們制備的疫苗具有良好的 抗原性，免疫BALB/c小鼠能夠產(chǎn)生高水平的抗體，接種后對免疫動物安全無害，是一種具有 廣闊前景的新型疫苗，將對我國豬圓環(huán)病毒防控提供物質(zhì)儲備和技術(shù)支撐，具有重要的意 義。
【附圖說明】
[0029]圖1是改造重組抗原免疫BALB/c小鼠效力實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0030]下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此。
[0031 ]下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件。
[0032]實(shí)施例1豬圓環(huán)病毒2型改造重組抗原的制備 [0033] 1、具有顯著免疫增強(qiáng)作用的一段基因的篩選：
[0034]豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白是病毒的主要的結(jié)構(gòu)蛋白，構(gòu)成病毒的核衣殼，并且編碼 的該蛋白能與宿主細(xì)胞受體結(jié)合，是病毒主要的免疫原性蛋白，能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，明顯 降低免疫豬的發(fā)病率，但實(shí)際應(yīng)用中無論是Cap蛋白的原核表達(dá)與真核表達(dá)都存在成本高， 且表達(dá)產(chǎn)量有限，對于