一種基質(zhì)金屬蛋白酶酶切序列肽、表達(dá)載體、多核苷酸序列及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基質(zhì)金屬蛋白酶酶切序列肽的串聯(lián)多肽、編碼該串聯(lián)多肽的核苷酸序列、表達(dá)載體及所述多核苷酸序列在基因工程重組技術(shù)表達(dá)生產(chǎn)基質(zhì)金屬蛋白酶酶切序列中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一組含Zn2+的、參與降解細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的最重要的蛋白酶。目前研究已經(jīng)證實(shí)MMPs參與人體眾多的生理和病理過(guò)程，因其能對(duì)基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行分解從而造成腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移成為腫瘤學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn)。MMP2是MMPs超家族中的能降解明膠的膠原酶。在很多腫瘤細(xì)胞中，MMP2都出現(xiàn)過(guò)表達(dá)的現(xiàn)象，如在乳腺癌細(xì)胞中，MMP2就出現(xiàn)過(guò)量表達(dá)的情況。
[0003]MMP2降解明膠是通過(guò)切割明膠中的特異性的氨基酸序列，即MMP2酶切序列肽，故我們可以把MMP2蛋白作為治療腫瘤的靶蛋白，通過(guò)把抗腫瘤的化學(xué)小分子連接到MMP酶切序列肽上，可以定向的把抗腫瘤的小分子帶到腫瘤細(xì)胞周圍，MMP2蛋白切割MMP2酶切序列肽后，釋放抗腫瘤小分子藥物;一方面達(dá)到了抗腫瘤藥物在腫瘤細(xì)胞上面的富集，另一方面可以把小分子釋放出來(lái)更特異的作用于腫瘤細(xì)胞。但是現(xiàn)有技術(shù)中把MMP2酶切序列肽的基因克隆到工程載體上并把載體導(dǎo)入工程菌種，小分子肽在微生物工程菌中表達(dá)率低及易降解，原料生產(chǎn)復(fù)雜而且成本高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004](一)解決的技術(shù)問(wèn)題
[0005]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中小分子肽在微生物工程菌中表達(dá)率低及易降解的問(wèn)題，本發(fā)明提供一種MMP2酶切序列的串聯(lián)多肽，通過(guò)生物學(xué)的方法，把MMP2酶切序列肽的基因克隆到工程載體上并把載體導(dǎo)入工程菌種，最后生產(chǎn)MMP2蛋白酶切割序列肽單體，小分子肽表達(dá)率提高，且不易降解，為以后的藥物設(shè)計(jì)提供原料支持，也降低了成本。
[0006](二)技術(shù)方案
[0007]為實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn):
[0008]—種基質(zhì)金屬蛋白酶-MMP2酶切序列的串聯(lián)多肽，該串聯(lián)多肽是由2-15個(gè)MMP2酶切序列單體肽首尾串聯(lián)而成的氨基酸序列；所述單體肽序列為:Pro-Leu-Gly-Met-Thr-Ser-Glu，單體肽之間由甲酸的酶切割位點(diǎn)連接，所述切割位點(diǎn)為Glu-Pro。
[0009]優(yōu)選的，所述串聯(lián)多肽是由8個(gè)MMP2酶切序列單體肽通過(guò)甲酸的酶切位點(diǎn)首尾串聯(lián)而成的串聯(lián)多肽。
[0010]優(yōu)選的，所述單體肽的氨基酸序列為序列表中SEQID NO:1所述的氨基酸序列。
[0011]—種編碼上述串聯(lián)多肽的多核苷酸序列。
[0012]優(yōu)選的，所述多核苷酸序列為SEQID NO: 2。
[0013]—種所述的多核苷酸序列在基因工程重組技術(shù)表達(dá)生產(chǎn)MMP2酶切序列肽中的應(yīng)用。
[0014]優(yōu)選的，所述表達(dá)生產(chǎn)MMP2酶切序列肽的微生物為原核微生物。
[0015]—種重組載體，所述重組載體含有多核苷酸序列所述的任一種多核苷酸序列。
[0016](三)有益效果
[0017]本發(fā)明提供了一種基質(zhì)金屬蛋白酶酶切序列肽、表達(dá)載體、多核苷酸序列及應(yīng)用，本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，其有益效果如下:
[0018]本發(fā)明構(gòu)建了串聯(lián)多肽及編碼它的多核苷酸序列及重組載體，采用基因工程重組技術(shù)表達(dá)生產(chǎn)MMP2酶切序列肽，而且成功實(shí)現(xiàn)了小分子MMP2酶切序列肽在微生物工程菌中的高效表達(dá)，表達(dá)的融合蛋白經(jīng)過(guò)特異性的甲酸酶切和近一步的分離純化，制得了高產(chǎn)量的MMP2酶切序列肽單體。
[0019]本發(fā)明采用基因工程重組技術(shù)表達(dá)生產(chǎn)MMP2酶切序列肽，采用化學(xué)方法切割，SP甲酸切割，簡(jiǎn)化了分離純化工藝復(fù)雜，解決了產(chǎn)量低的問(wèn)題，而且生產(chǎn)不受原料限制，能進(jìn)行工廠化自動(dòng)化大規(guī)模生產(chǎn)，降低了生產(chǎn)成本，為MMP2酶切序列在科學(xué)研究相關(guān)產(chǎn)品及藥物等產(chǎn)品的市場(chǎng)化提供了技術(shù)支持。
【附圖說(shuō)明】
[0020]為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
[0021 ]圖1為本發(fā)明實(shí)施例中重組表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0022]為使本發(fā)明實(shí)施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0023]將本發(fā)明的串聯(lián)多肽的氨基酸序列按照偏愛(ài)密碼子翻譯成的多核苷酸序列定義為ACS-N，兩個(gè)麗P2酶切序列肽單體串聯(lián)的N為2，三個(gè)MMP2酶切序列單體串聯(lián)的N為3，其余的依次類推。
[0024]將本發(fā)明的多核苷酸序列通過(guò)本領(lǐng)域熟知的基因工程技術(shù)，來(lái)表達(dá)生產(chǎn)MMP2酶切序列肽。
[0025]將本發(fā)明的串聯(lián)多肽的氨基酸序列，按照偏愛(ài)密碼子如大腸桿菌偏愛(ài)密碼子、酵母菌偏愛(ài)密碼子等翻譯成多核苷酸序列?；瘜W(xué)合成該多核苷酸序列后，通過(guò)本領(lǐng)域熟知的基因工程技術(shù)，可構(gòu)建各種原核表達(dá)載體、真核表達(dá)載體和穿梭質(zhì)粒載體，并轉(zhuǎn)化原核、真核生物以得到表達(dá)。具體過(guò)程可如下所述:
[0026]化學(xué)合成雙鏈目的基因ACS-N片段，根據(jù)選定的表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)，合成時(shí)在ACS-N序列的5 ’端和3 ’端加上可連接到載體上的限制性酶切位點(diǎn)和終止密碼子，例如，在5 ’端加上BamHl位點(diǎn)，在3’端加上Hind III位點(diǎn)，并克隆至高拷貝質(zhì)粒例如pMD19_T質(zhì)粒中。轉(zhuǎn)入宿主菌例如大腸桿菌DH5a中保存。
[0027]擴(kuò)增培養(yǎng)并提取含目的基因的高拷貝質(zhì)粒，同時(shí)擴(kuò)增培養(yǎng)并提取表達(dá)載體;克隆質(zhì)粒和表達(dá)載體分別經(jīng)過(guò)雙酶切，割膠分別回收目的基因片段和表達(dá)載體片段，將目的基因片段和表達(dá)載體片段用Solut1n I快速連接酶連接，即構(gòu)建了含有DNA序列ACS-N的重組載體，例如圖1所示的重組質(zhì)粒pET28a-his-sum0::ACS-N。把獲得的重組載體轉(zhuǎn)化宿主菌，例如大腸桿菌BL21，獲得用來(lái)表達(dá)ACS-N多肽的轉(zhuǎn)化子。
[0028]將擴(kuò)繁后的工程菌誘導(dǎo)，誘導(dǎo)產(chǎn)物用甲酸酸切割后，用反向高效液相色譜(RP-HPLC)純化，純化得到的MMP2酶切序列肽單體經(jīng)過(guò)氨基酸序列分析，其序列為Pro-Leu-Gly-Met-Thr-Ser-Glu，表明利用基因工程方法成功制備MMP2酶切序列肽。甲酸切割的最佳條件是50 %甲酸終濃度70攝氏度切割30小時(shí)。RP-HPLC純化MMP2酶切序列肽的最佳條件為:乙腈濃度15%，三氟乙酸濃度I %，洗脫速度1.5mL/min，發(fā)明人分別將2?11個(gè)MMP2酶切序列肽單體用甲酸的酶切位點(diǎn)Glu-Pro串聯(lián)起來(lái)構(gòu)成系列氨基酸序列，并全部化學(xué)合成了對(duì)應(yīng)于這些串聯(lián)多肽的系列多核苷酸序列，并依次構(gòu)建了含有不同MMP2酶切序列肽串聯(lián)數(shù)的系列工程菌BL21/pET-28a::ACS-N，分別擴(kuò)增這些工程菌后，用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)，誘導(dǎo)產(chǎn)物用甲酸酶切后，用RP-HPLC純化測(cè)定單體肽ACS-1含量，結(jié)果表明8個(gè)MMP2酶切序列肽單體串聯(lián)起來(lái)表達(dá)，表達(dá)量最大，達(dá)到500mg/L。
[0029]實(shí)施例1:2個(gè)MMP2酶切序列肽單體串聯(lián)的ACS-2多肽大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建及表達(dá)。
[0030]將兩個(gè)MMP2單體Pro-Leu-Gly-Met-Thr-Ser-Glu用甲酸切割位點(diǎn)Glu-Pro連接構(gòu)成2拷貝的串聯(lián)多肽(14肽)，該串聯(lián)多肽的氨基酸序列如序列表中SEQ ID N0:3所述，具體如下:
[0031 ] Pro-Leu-Gly-Met-Thr-Ser-Glu-Pro-Leu-Gly-Met-Thr-Ser-Glu
[0032]I714
[0033]選擇pET28a-his_sumo(pET28a構(gòu)自Novagen公司)，并自行改造成pET28a_his-sumo載體作為該串聯(lián)十四肽的融合表達(dá)載體，根據(jù)大腸桿菌偏愛(ài)密碼子，將十四肽的氨基酸序列轉(zhuǎn)化成如序列表中SEQ ID NO:4所述的多核苷酸序列，S卩ACS-2:
[0034]CCGCTTGGTATGACTTCAGATCCGCTTGGTATGACTTCAGAT
[0035]并在該多核苷酸序列的5’端加上BamHI酶切位點(diǎn)GGATCC，在3’端加上終止密碼子TGA和Hind ΙΠ酶切位點(diǎn)AAGCTT，最終設(shè)計(jì)成如下多核苷酸序列:
[0036]GGATCCCCGCTTGGTATGACTTCAGATCCGCTTGGTATGACTTCAGATA