;其余部分為 VQR蛋白序列，改造位點(diǎn)計(jì)數(shù)從VQR蛋白編碼序列開(kāi)始。
[0051] 表1各片段的擴(kuò)增引物
[0052]
[0053] 實(shí)施例2、GL1-1基因 sgRNA的設(shè)計(jì)及重組質(zhì)粒構(gòu)建
[0054] 選擇化 1-1 基因序列"5 ' -ATCGCCCTCTACCTCTGCAGGA"為祀序列/'GGA"為PAM序列， 下劃線(xiàn)為PstI酶切識(shí)別位點(diǎn)。合成正負(fù)兩條寡核巧酸鏈，如表2所示。100μΜ的g++與g-引物 (即，表2中的寡核巧酸引物（5'-3'））各20化混合，100°C放置5分鐘后置于室溫，逐漸冷卻， 變性退火，形成帶有粘性末端的片段(即，g++/g-引物退火產(chǎn)物）。
[005引將SK-gRNA進(jìn)行Aarl酶切(酶及體系所用試劑均購(gòu)自化rment公司），形成帶有粘性 末端的載體，酶切反應(yīng)體系如下：
[0056]
[0057] 備注說(shuō)明：SK-gRNA可來(lái)自申請(qǐng)?zhí)?01510485573.2。
[005引 37°C酶切3小時(shí)，用Biomed膠回收試劑盒(Biomed，DR0103)按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行純 化;得線(xiàn)性載體SK-gRNA/Aarl。
[0059] 將載體和片段進(jìn)行T4酶(購(gòu)自肥B公司)連接，反應(yīng)如下：
[0060]
[0061] 室溫反應(yīng)1小時(shí)。連接產(chǎn)物扣L轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5a得到連接質(zhì)粒SK- 排NAGli-1。用引物T7:5 ' -TAATACGACTCACTATAGG-3 '，測(cè)序確定克隆構(gòu)建正確。即，含有VQR及 祀位點(diǎn)相關(guān)序列。
[0062] 將測(cè)序正確的SK-gRNAGLi-i質(zhì)粒用時(shí)η巧日Bgin雙酶切，用Biomed膠回收試劑盒 (Biomed，DR0103)按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行純化，得線(xiàn)性片段。將此線(xiàn)性片段連入PC1300-VQR雙元 載體（即，實(shí)施例1所得的重組質(zhì)粒PC1300-VQR)的BamH巧日ΚρηΙ識(shí)別位點(diǎn)間，得到最終敲除 水稻雙元表達(dá)載體目(：1300-VQR-gRNA*^LH。
[0063] KpnI、BglII、BamHI及體系內(nèi)其他試劑均購(gòu)自TAKARA公司，雙酶切體系如下：
[0064]
[0065] 37°C酶切3小時(shí)，用Biomed膠回收試劑盒(Biomed,DR0103)按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行純 化;得線(xiàn)性片段曲臟*=^-1/邱111+8肖1 II。
[0066]
[0067] 37°C酶切3小時(shí)，用Biomed膠回收試劑盒(Biomed，DR0103)按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行純 化;得線(xiàn)性載體 pCl 300-VQR/KpnI+BamHI。
[006引連接反應(yīng)如下：
[0069]
[0070] 室溫反應(yīng)1小時(shí)。取連接產(chǎn)物化L用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5,得到連接質(zhì) 粒。用引物PC1300-F: 5 ' -ACACTTTATGCTTCCGGCTC-3 '，測(cè)序確定克隆構(gòu)建正確。當(dāng)測(cè)序結(jié)果 與設(shè)計(jì)序列(包含祀位點(diǎn)序列）比對(duì)相符合時(shí)，判定構(gòu)建正確;反之，則為構(gòu)建不正確。
[00川表2化1-1的祀位點(diǎn)、寡核巧酸、引物
[0072]
[0073] 實(shí)施例3、轉(zhuǎn)基因植株的獲得
[0074] 將上述最終敲除水稻雙元表達(dá)載體9(：1300-￥91?-邑1?酷*=^-1通過(guò)電擊的方法轉(zhuǎn)入農(nóng) 桿菌(Agrobacterium)株系EHA105中，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將此雙元表達(dá)載體轉(zhuǎn)入水稻日本 晴的成熟胚愈傷組織。轉(zhuǎn)化的具體方法是將日本晴種子的成熟胚滅菌后切出，接種到誘導(dǎo) 愈傷組織的培養(yǎng)基中。培養(yǎng)1周后，挑選生長(zhǎng)旺盛，顏色淺黃，比較松散的胚性愈傷組織，用 作轉(zhuǎn)化的受體。用含有9(：1300-￥91?-邑1?酷*=^-1質(zhì)粒的6齡105菌株侵染水稻愈傷組織，在黑暗 處25°C培養(yǎng)3天后，在含有50mg/L潮霉素的選擇培養(yǎng)基上篩選抗性愈傷組織和轉(zhuǎn)基因植株。 挑選在潮霉素選擇培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因植株，進(jìn)行鑒定。
[0075] 實(shí)施例4、轉(zhuǎn)基因植株的鑒定
[0076] 1.酶切鑒定
[OOW]利用分子生物學(xué)手段鑒定目的基因突變情況。CTAB法單株提取野生型對(duì)照及實(shí)施 例3所得的轉(zhuǎn)基因植物基因組DNA，使用表2所述引物及K0D FX DNA聚合酶(購(gòu)自東洋紡生物 科技有限公司)PCR擴(kuò)增目的條帶，反應(yīng)條件如下：
[007 引
[0079]
[0080] 反應(yīng)程序:94°C，變性2分鐘;然后98°C變性10秒，58°C退火30秒，68°C延伸40秒，擴(kuò) 增34個(gè)循環(huán);最后在68°C下延伸5分鐘。
[0081 ] 得到的PCR產(chǎn)物，約602bp，使用Pstl(購(gòu)自肥B公司）進(jìn)行酶切檢測(cè)，體系如下：
[0082]
[0083] 37°C酶切3小時(shí)，2%的瓊脂糖凝膠電泳（145V)25min，結(jié)果如圖2所示，被完全降解 為35869和24469兩個(gè)較小條帶的樣品為野生型和敲除陰性(如巧*和1~5,7~9，11~14，16， 18~20);完全未被降解的樣品為敲除純合體(結(jié)果圖中無(wú)明顯敲除純合體，敲除純合體理 論上應(yīng)與最后一個(gè)泳道帶型一致）；含有兩種帶型的樣品為敲除雜合體(如6、10、15、17)。 [0084] 2.測(cè)序
[008引將上述PCR產(chǎn)物送測(cè)序公司（杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司），W表2中F為引物 測(cè)序。所得結(jié)果與野生型序列進(jìn)行比對(duì)。測(cè)序結(jié)果為雙峰的，用簡(jiǎn)并密碼子策略分析 化ttp://dsdecode. scgene. com/進(jìn)行峰圖分析），可直接獲得雜合突變信息。結(jié)果如圖3所 示，均有不同程度的敲除純合體、雜合體檢出。
[0086] 3.表型鑒定
[0087] 如圖4所示，將清水滴至葉片表面，若水能維持水滴性狀，可說(shuō)明水稻葉面具有蠟 質(zhì)合成，即為野生型。反之(即不能維持水滴狀），則說(shuō)明蠟質(zhì)基因被破壞，為敲除陽(yáng)性植株。 [008引結(jié)論；
[0089]原始的Cas9基因所表達(dá)的化s9蛋白只能在PAM區(qū)為5'-NGG-3'的情況下實(shí)現(xiàn)基因 組編輯功能。而相比于原始的化s9蛋白，VQR(變體化s9蛋白）能夠在PAM區(qū)為5'-NGA-3'的情 況下實(shí)現(xiàn)基因組編輯功能，而普通Cas9蛋白則無(wú)法在該情況下實(shí)現(xiàn)編輯。備注說(shuō)明：N代表 為A，T，C，G任意一種核巧酸，本案例中（圖3)，N則為G。
[0090] 實(shí)施例5、將實(shí)施例2~4中的基因化1-1改成NAL1 (包含上標(biāo)中所含有的化1-1，均 0?^ΝΑ11) ,)lt"5'-ATCGCCCTCTACCT CTGCAG G A " 改為"5 > - GCTATTGAGCGGACACTGCAGA" /屯GA"改為"AGA";所使用的體系、方法均不變，使用到的寡核巧 酸引物g++/g-改為 "g++: GGCAGCTATTGAGCGGACACTGC; g-: AAACGCAGTGTCCGCTCAATAGC' ；引 物 F/R 改為 "F: TCATATTAATGCCGGATTGC; R: CAAGTTCCAGACGGTCGA 護(hù)。
[0091] 其結(jié)果如下:CTAB法單株提取野生型對(duì)照及所得的轉(zhuǎn)基因植物基因組DNA，使用上 述引物及K0D FX DNA聚合酶(購(gòu)自東洋紡生物科技有限公司）PCR擴(kuò)增目的條帶，反應(yīng)條件 如下：
[0092]
[0093] 反應(yīng)程序:94°C，變性2分鐘;然后98°C變性10秒，58°C退火30秒，68°C延伸40秒，擴(kuò) 增34個(gè)循環(huán);最后在68°C下延伸5分鐘。
[0094] 得PCR產(chǎn)物，約663bp，W上述F為引物測(cè)序。所得結(jié)果與野生型序列進(jìn)行比對(duì)。測(cè)序 結(jié)果為雙峰的，用簡(jiǎn)并密碼子策略分析化ttp: //dsdecode. scgene. com/進(jìn)行峰圖分析），可 直接獲得雜合突變信息。結(jié)果如圖5所示，均有不同程度的敲除純合體、雜合體檢出。
[0095] 最后，還需要注意的是，W上列舉的僅是本發(fā)明的若干個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā) 明不限于W上實(shí)施例，還可W有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容 直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 植物Cas9變體蛋白VQR，其特征是:該蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID N〇:2所示。2. 植物Cas9變體蛋白VQR，其特征是:所述蛋白質(zhì)還包括在SEQ ID NO:2所示的氨基酸 序列中添加、取代、插入和缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸生成的衍生物。3. 植物Cas9變體基因 VQR，其特征是:該基因編碼植物Cas9變體蛋白VQR，所述基因的核 苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。4. 植物Cas9變體基因 VQR，其特征是:所述基因還包括在SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序 列中添加、取代、插入和缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸生成的突變體、等位基因和衍生物。5. 重組表達(dá)載體，其特征是:包含權(quán)利要求3或4所述的基因。6. 如權(quán)利要求1或2所述的植物Cas9變體蛋白VQR的用途，其特征是:能夠在PAM區(qū)為5 ' -NGA-3'的情況下實(shí)現(xiàn)基因組編輯功能。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種植物Cas9變體蛋白VQR，該蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ？ID？No：2所示。本發(fā)明還同時(shí)公開(kāi)了植物Cas9變體基因VQR，該基因編碼植物Cas9變體蛋白VQR，所述基因的核苷酸序列如SEQ？ID？NO：1所示。本發(fā)明還同時(shí)公開(kāi)了包含上述基因的重組表達(dá)載體。本發(fā)明的植物Cas9變體蛋白VQR的用途是：能夠在PAM區(qū)為5’-NGA-3’的情況下實(shí)現(xiàn)基因組編輯功能。
【IPC分類(lèi)】C12N15/55, C12N15/10, C12N9/22, C12N15/63
【公開(kāi)號(hào)】CN105543195
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610113183
【發(fā)明人】王克劍, 胡熙璕, 王春, 付亞萍, 劉慶, 焦曉真
【申請(qǐng)人】中國(guó)水稻研究所
【公開(kāi)日】2016年5月4日
【申請(qǐng)日】2016年3月1日