一種提高金藻油脂含量與多不飽和脂肪酸產(chǎn)量的培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于海洋生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及海洋單細(xì)胞微藻金藻及細(xì)胞內(nèi)多不飽和 脂肪酸。
【背景技術(shù)】
[0002] 多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids,PUFAs)是指含有兩個(gè)或更多個(gè) 不飽和雙鍵結(jié)構(gòu)的直鏈脂肪酸，又稱多帰脂肪酸。根據(jù)第一個(gè)不飽和鍵位置不同，PUFAs通 常分為ω -3、ω -6在多不飽和脂肪酸分子中。ω -3和ω -6系列PUFAs具有重要生物學(xué)意 義并與人類健康密切相關(guān)，其中ω-3PUFA還具有防治人類必血管疾病，促進(jìn)嬰幼兒大腦發(fā) 育和改善視力的功效。
[0003] 海洋微藻是海洋生態(tài)系統(tǒng)中食物鏈的最初生產(chǎn)者，其種類多、數(shù)量大、生長(zhǎng)繁殖 快，因其體內(nèi)含有豐富的PUFAs而受到人們的廣泛關(guān)注。利用海洋微藻生產(chǎn)多不飽和脂肪 酸比直接從魚類中提取具有較大的優(yōu)勢(shì)，研究表明，魚類本身不能合成PUFAs,它是通過吞 食富含PUFAs的海洋微藻后在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)PUFAs的積累，可見微藻才是PUFAs的真正生產(chǎn)者。 通過培養(yǎng)海洋微藻生產(chǎn)多不飽和脂肪酸理論上是一條相對(duì)更直接的途徑。利用微藻生產(chǎn) PUFAs具有W下優(yōu)點(diǎn)；（1)微藻生長(zhǎng)速度快、細(xì)胞PUFAs含量高，某些藻體內(nèi)PUFAs的相對(duì)含 量高達(dá)5%~6%細(xì)胞干重。（2)微藻藻體細(xì)胞結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，其生長(zhǎng)和代謝易受外界條件的影 響，可W通過改變培養(yǎng)條件，如溫度、光強(qiáng)、培養(yǎng)基組成等促進(jìn)PUFAs的合成，還可利用基因 工程篩選出高產(chǎn)PUFAs的藻株。（3)容易利用戶外大型水池、光生物反應(yīng)器等進(jìn)行微藻的大 規(guī)模生產(chǎn)，并人為控制生產(chǎn)條件，容易高效獲得穩(wěn)定的代謝產(chǎn)物。（4)從微藻中提取PUFAs, 其提取純化工藝遠(yuǎn)比從大型藻類和魚類中提取要簡(jiǎn)單得多；而且獲得的PUFAs制品不含魚 腥味，不含膽固醇，不受殺蟲劑和重金屬的污染，而魚油中卻可能含有送些物質(zhì)。
[0004] 湛江等鞭金藻（Isoc虹ysis zhangjiangensis)，屬于金藻口、普林藻綱、等鞭藻 目、等鞭藻科、等鞭藻屬。湛江等鞭金藻個(gè)體小，繁殖快，具無(wú)纖維素的細(xì)胞壁，營(yíng)養(yǎng)豐富，尤 其在藻體中富含多不飽和脂肪酸，是海洋中魚、奸和貝類的等幼體生長(zhǎng)發(fā)育過程中必需的 營(yíng)養(yǎng)成分。所W它作為一種優(yōu)質(zhì)的PUFA海洋生物資源，有很好的應(yīng)用前景。因此，找到一 種既能提高金藻油脂含量又能提高其多不飽和脂肪酸含量的培養(yǎng)方法是實(shí)現(xiàn)海洋微藻產(chǎn) 業(yè)化生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明是在反應(yīng)器培養(yǎng)的過程中，僅通空氣提高金藻油脂含量和多不飽與脂肪酸 產(chǎn)量的培養(yǎng)方法。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的培養(yǎng)方法包括W下步驟：
[0007] 1)藻種培養(yǎng)于錐形瓶中，培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期使用；
[0008] 2)將指數(shù)生長(zhǎng)期的藻細(xì)胞接種于滅菌的F/2培養(yǎng)基中，通空氣培養(yǎng)至平臺(tái)期收獲 藻細(xì)胞，測(cè)定干重；
[0009] ：3)總脂測(cè)定：氯仿-甲醇-水法測(cè)定（參考文獻(xiàn)；[l]Bli曲EG，Dyer WJ.A r曰pid method of total lipid extraction 曰nd puri円c曰tion[J]. C曰n曰di曰n Journal of Biochemistry and Physiology, 1959, 37(8):911 - 915. )〇
[0010] 4)脂肪酸成分分析；將收獲的藻細(xì)胞烘干得藻粉，采用酸催化轉(zhuǎn)醋化法，氣質(zhì)聯(lián) 用方法對(duì)金藻脂肪酸成分進(jìn)行測(cè)定（參考文獻(xiàn)：[2]馮迪娜，艾江寧，劉亞男，等.含氮 類培養(yǎng)基對(duì)海洋微藻Isochrysiszhanjiangensis油脂與碳水化合物積累的影響[J].中國(guó) 生物工程雜志，2011，31 (10) :29-34.)。
[0011] 培養(yǎng)參數(shù)：
[0012] 1)常規(guī)無(wú)額外〔化添加的空氣，W恒定通氣速率0. 16vvm~0. 24vvm培養(yǎng)金藻。
[0013] 2)反應(yīng)器培養(yǎng)的第3天起每24h添加12. 5mg/L的氮元素（F/2培養(yǎng)基中的NaN〇3)。
[0014] 3)所述培養(yǎng)環(huán)境溫度23~27°C，在反應(yīng)器培養(yǎng)的24h內(nèi)光強(qiáng)為25~55 μ mol. m2s 1，4她內(nèi)光強(qiáng)為45~85 μ mol. m 2s i，72h內(nèi)光強(qiáng)為85~140 μ mol. m 2s 1，7化~平臺(tái)期 內(nèi)光強(qiáng)為120~260 μ mol. m 2s 1。光暗比為14h: lOh。
[0015] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下：
[0016] 1、此培養(yǎng)體系藻細(xì)胞的油脂產(chǎn)量、多不飽和脂肪酸含量及產(chǎn)量，與通c〇2的培養(yǎng)體 系達(dá)到相當(dāng)?shù)乃?，其中油脂含量提?0% W上。
[0017] 2、培養(yǎng)過程中僅通空氣，無(wú)額外的C〇2通入，但可達(dá)到相同的效果，降低成本。
【附圖說明】：
[001引 圖1.金藻生長(zhǎng)曲線圖；
[0019] 圖2.培養(yǎng)體系氮含量消耗曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 實(shí)施例1 ;培養(yǎng)過程生長(zhǎng)階段判定
[0021] 每天用 Jasco V-530UV/VIS Spectrophotometer (JASC0, Tokyo, Japan)監(jiān)測(cè)金藻 細(xì)胞數(shù)和氮消耗量：
[0022] 細(xì)胞數(shù)的測(cè)定：利用0D法，在680nm處測(cè)定培養(yǎng)系統(tǒng)中的金藻吸光度，利用公式 "細(xì)胞密度（Xl〇4cells/mL) = (0DewX 1250-90. 125) X稀釋倍數(shù)"計(jì)算出對(duì)應(yīng)的細(xì)胞密度。 繪制生長(zhǎng)曲線，W判定細(xì)胞生長(zhǎng)至穩(wěn)定期。不同培養(yǎng)條件下，金藻的生長(zhǎng)曲線見圖1。
[0023] 培養(yǎng)體系氮測(cè)定；含量具體計(jì)算公式為；（0〇22。-〇〇27日）X6. 5397-0. 6642,（0〇22〇和 〇〇27日分別為220皿和275皿處的吸光值），見圖2。
[0024] 實(shí)施例2營(yíng)養(yǎng)鹽及培養(yǎng)基配制 [00巧]無(wú)娃酸鹽的F/2營(yíng)養(yǎng)鹽母液配制：
[002引 （1)氮源；稱取75g NaN03溶于1L去離子水；
[0027] 似磯源：稱取5g NaH2P〇4 · &0溶于1L去離子水；
[0028] (3)金屬元素：分別稱取 3. 15g 化CI3 · 6&0, 4. 36g 胞2邸TA, 0. 0098g CuS04·5H20,0.0063g化2Mo04·2H20,0.022gZnS04·7H20,0.01gCoCl2·細(xì)20,0.18g MnClz · 4&0溶于1L去離子水；
[0029] (4)維生素；0.0 Olg vitamin Bi2, 0. 2g vitamin Bi, 0.0 Olg D-生物素，溶于 1L 去 離子水；
[0030] F/2培養(yǎng)基的制備：
[0031] 天然海水經(jīng)莫氧殺菌，兩層0.45μm醋酸纖維濾膜過濾，ll(rC滅菌15min，冷卻后 備用；向海水中添加上述（1)，（2)，（3)，（4)制得的無(wú)娃酸鹽的F/2營(yíng)養(yǎng)鹽，其中氮源、磯源、 金屬元素各1血/L，維生素0. 5血/L。
[0032] 實(shí)驗(yàn)所用甘油：分析純甘油與經(jīng)0. 45 μ m醋酸纖維濾膜過濾的海水W體積比1 ;1 混勻，12rC滅菌20min后冷卻，常溫保存。
[003引實(shí)施例3 ;金藻培養(yǎng)
[0034] 采用實(shí)施例2中的F/2培養(yǎng)基，W等鞭金藻化zhangjiangensis)0D6s。= 0. 1~ 0. 2、藻液體積約1. 5~2.化接種于化Η角瓶，用日光燈做光源，光強(qiáng)為30~40 μ mol. m 2s 1，培養(yǎng)3~5天至指數(shù)生長(zhǎng)期；離必（3000~4000巧m，3~5min)，收獲藻細(xì)胞，棄上清 液，沉淀中添加約3~5mL滅菌的海水，使之重新懸浮，加至F/2培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基濃度為 3倍實(shí)施例1所述F/2培養(yǎng)基，即氮源、磯源、金屬元素、微量元素各添加常規(guī)F/2營(yíng)養(yǎng)鹽的 3倍，調(diào)至孤ew = 0. 28~0. 32, 500血藻液接種于60