一種利用低活性丁二酸生產(chǎn)菌株轉(zhuǎn)化合成蘋果酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種利用低活性下二酸生產(chǎn)菌株轉(zhuǎn)化合 成蘋果酸的方法，通過(guò)對(duì)微生物進(jìn)行特定的菌種活化、種子液制備后，進(jìn)行厭氧發(fā)酵生產(chǎn)下 二酸發(fā)酵結(jié)束后收集菌體細(xì)胞，在W下二酸鋼為底物的特定培養(yǎng)基和培養(yǎng)環(huán)境下，有氧轉(zhuǎn) 化合成蘋果酸。
【背景技術(shù)】
[0002] 蘋果酸是人體內(nèi)部循環(huán)的重要中間產(chǎn)物，易被人體吸收，因此作為優(yōu)異的食品添 加劑和功能性食品廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)療和保健等領(lǐng)域。目前蘋果酸生產(chǎn)W富馬酸或馬來(lái) 酸為原料，加壓與水蒸汽共熱形成化-蘋果酸，也可W慷醒為原料，經(jīng)雙氧水處理，在超聲波 作用下轉(zhuǎn)變而成。化學(xué)法由于生產(chǎn)工藝比較復(fù)雜，工藝條件要求高，分離精制技術(shù)難度大， 加之原料為化工產(chǎn)品，成本高和環(huán)境污染等原因使得蘋果酸的應(yīng)用受到限制。蘋果酸的生 物合成法具體包括酶催化轉(zhuǎn)化法和微生物發(fā)酵法。20世紀(jì)90年代中期出現(xiàn)的酶催化轉(zhuǎn)化法 一般都是W富馬酸為底物，利用具有高活性富馬酸酶的微生物細(xì)胞或富馬酸酶，采用細(xì)胞 反應(yīng)器或固定化酶，將富馬酸轉(zhuǎn)化成k蘋果酸。隨著石油危機(jī)的出現(xiàn)，使得人們加大了對(duì)微 生物發(fā)酵法制備蘋果酸的研究力度，運(yùn)一時(shí)期人們用來(lái)發(fā)酵制備蘋果酸的微生物主要是霉 菌，其中黃曲霉Asp. flavu為重點(diǎn)研究的對(duì)象，具體包括黃曲霉Asp. flavu，末曲霉 Asp.oryzae，寄生曲霉 Asp.parasiticus eTakao 等報(bào)道先用少根根霉（Rhizopus ahirrizus)或華根霉(化izopu chinensis)把糖質(zhì)原料轉(zhuǎn)化成富馬酸，然后利用膜釀畢赤 酵母（Picha membrane aefaciens faciens)、普通變形桿菌（proteus vulgaris)及宛氏擬 青霉(paeciomyces varioti)之一，把富馬酸轉(zhuǎn)化成レ蘋果酸的研究，但轉(zhuǎn)化率不高（J. 化rment. Techno, 1983,61:643-645)。山東食品發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室等人多年來(lái)致力于直接發(fā) 酵法生產(chǎn)レ蘋果酸的研究，并且從±壤中分離篩選、誘變獲得一株直接利用淀粉質(zhì)原料生 產(chǎn)心蘋果酸的高產(chǎn)菌株Aspergillus flavus HA5800,經(jīng)過(guò)發(fā)酵條件的優(yōu)化，7000升發(fā)酵罐 產(chǎn)酸達(dá)8.68%，糖酸轉(zhuǎn)化率達(dá)83.5%，發(fā)酵周期112小時(shí)，為k蘋果酸產(chǎn)業(yè)化奠定了基礎(chǔ)。（中 國(guó)食品添加劑，2003，3:52-56)。但霉菌生長(zhǎng)速度慢，產(chǎn)品生產(chǎn)強(qiáng)度偏低，開發(fā)對(duì)營(yíng)養(yǎng)條件需 求簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)迅速、收率高的蘋果酸酸生產(chǎn)菌株是加速生物法替代石化法生產(chǎn)的關(guān)鍵。
[0003] 利用大腸桿菌來(lái)發(fā)酵生產(chǎn)蘋果酸，是利用了大腸桿菌生長(zhǎng)快速、培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、安 全性好、易操作易改造等諸多優(yōu)點(diǎn)。目前，Soo化η Moon等人報(bào)道了一株生產(chǎn)蘋果酸的重組 大腸桿菌，其原理是敲除野生大腸桿菌中的憐酸轉(zhuǎn)乙酷酶基因（PTA)并過(guò)量表達(dá) Mannheimia succiniciproducens中憐酸締醇式丙酬酸簇化激酶(PCK)，結(jié)果在有氧條件下 1 化生產(chǎn)蘋果酸9.25 g L-i(Biochemical Engineering Journal ,2008，40: 312-320)。但 其收率僅61%，且產(chǎn)物濃度較低。本發(fā)明利用回收的產(chǎn)下二酸重組大腸桿菌，W下二酸鋼為 原料有氧發(fā)酵制備蘋果酸的方法未見公開，而運(yùn)種應(yīng)用將有效提高產(chǎn)下二酸重組大腸桿菌 的利用效率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是在產(chǎn)下二酸重組大腸桿菌發(fā)酵結(jié)束時(shí)，通過(guò)一種溫 和、高效的方法回收菌體細(xì)胞，并最終能夠轉(zhuǎn)入新鮮培養(yǎng)基中W下二酸鋼為原料轉(zhuǎn)化合成 蘋果酸。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)目的，本發(fā)明采用W下技術(shù)方案： 一種利用低活性下二酸生產(chǎn)菌株轉(zhuǎn)化合成蘋果酸的方法，包括W下步驟： (1) 菌種活化:從甘油凍存管中取菌液，在LB平板上劃線后放置于37°C下培養(yǎng)12 h; (2) 種子液制備:從LB平板上取單菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基，在37°C，200 r/min條件 下?lián)u瓶培養(yǎng)6~8 h，至菌體密度(0D600)值在0.6~0.8之間； (3) 發(fā)酵產(chǎn)下二酸過(guò)程:按3~10%的接種量接種發(fā)酵培養(yǎng)基，先通空氣有氧培養(yǎng)至菌體 密度(0D600)值在30~40之間，再W0.1~0.2 vvm的通氣流量連續(xù)通二氧化碳?xì)怏w維持發(fā)酵 罐中厭氧環(huán)境，并W碳酸鋼作為酸中和劑控審虹Η值在6.4-7.0之間，控制溫度在35~40°C; (4) 在一次厭氧發(fā)酵結(jié)束時(shí)，回收菌體細(xì)胞，在轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中維持溶氧，溫度及發(fā)酵液 pH值，W下二酸二鋼為底物，轉(zhuǎn)化合成蘋果酸。
[0006] 進(jìn)一步地，所述的菌種為產(chǎn)下二酸重組大腸桿菌。
[0007] 進(jìn)一步地，所述的菌種為Escherichia coli AFP111。
[0008] 進(jìn)一步地，所述步驟(4)中厭氧發(fā)酵結(jié)束時(shí)，回收的菌體細(xì)胞轉(zhuǎn)化采用的轉(zhuǎn)化培養(yǎng) 基為JSM-CN培養(yǎng)基。
[0009] 進(jìn)一步地，所述的JSM-CN培養(yǎng)基含有：葡萄糖40 g · L-1;巧樣酸3 g · L-1; Na2HP〇4 · 7此0 3 邑· L-i;K此P〇4 8 邑· L-1;(畑4)2冊(cè)〇4 8 邑· L-i;NH4C1 0.2 邑· L-i;MgS〇4 · 7出0 1.00 邑· L-i;CaCl2 · 2出0 10.0 m邑· L-i;ZnS〇4 · 7出0 0.5 m邑· L-i;CuCl2 · 2此0 0.25 m邑· L-i;MnS〇4 ·此0 2.5 m邑· L-i;CoCl2 · 6出0 1.75 m邑· L-1;曲B03 0.12 m邑；A!2 (S〇4)3.xH2〇 1.77 mg.L-i;Na2Mo〇4.2H2〇 0.5 mg.L-i;巧樣酸鐵 16.1 mg.L-i;VBi 20 .mg L-i;生物素 2 mg · [1。
[0010] 進(jìn)一步地，步驟(4)中所述的溶氧>20%，所述溫度為33~36°C，所述pH在6.8~7.5之 間。
[0011] 本發(fā)明的有益效果在于： 本發(fā)明的技術(shù)方案W回收的低活性的產(chǎn)下二酸重組大腸桿菌為催化劑，下二酸鋼為底 物，有氧轉(zhuǎn)化合成蘋果酸，其轉(zhuǎn)化率達(dá)到90%w上，提高了細(xì)胞的利用效率，有效節(jié)約了成 本。
【附圖說(shuō)明】
[0012] 圖1蘋果酸生產(chǎn)過(guò)程曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0013] 本發(fā)明中所述的菌株及培養(yǎng)基： 菌株：Escherichia coli AFPl 11，菌株來(lái)源為：Appl ied and environmental microbiology ,2001,67(1): 148-154。申請(qǐng)人首先通過(guò)查閱到該生物材