溶瘤性hsv載體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種重組溶瘤性單純皰疹病毒(oHSV)，其包含特異性針對(duì)在細(xì)胞(例如癌細(xì)胞)表面上存在的分子(蛋白、脂質(zhì)或碳水化合物抗原決定簇)的非HSV配體，和插入到一個(gè)或多個(gè)HSV基因(優(yōu)選地為HSV在正常(即，非癌性)細(xì)胞中復(fù)制所需的一個(gè)或多個(gè)HSV基因)座中的一個(gè)或多個(gè)拷貝的一種或多種microRNA靶序列。本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含創(chuàng)新的oHSV的原液和藥物組合物，以及使用所述創(chuàng)新的oHSV殺滅腫瘤細(xì)胞的方法。
【專利說(shuō)明】溶瘤性HSV載體
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本專利申請(qǐng)要求于2013年10月28日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)61/896,497的優(yōu)先 權(quán)，其全部?jī)?nèi)容在此通過(guò)引用并入。
[0003] 關(guān)于聯(lián)邦政府資助的研究與開(kāi)發(fā)的聲明
[0004] 本發(fā)明是在由美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院授予的基金號(hào)CA119298、CA163205、CA175052、 NS040923和DK044935下借助政府支持而進(jìn)行的。政府在本發(fā)明中具有某些權(quán)利。
[0005] 發(fā)明背景
[0006] 即便應(yīng)用現(xiàn)有的聯(lián)合療法，多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)仍是一種致命性疾病。臨床 前研究表明具有復(fù)制能力的病毒載體(包括溶瘤性HSV( "oHSV"）載體)有望成為替代性的治 療方法，但其在患者的臨床試驗(yàn)中治療效果有限。實(shí)現(xiàn)載體安全性依賴于減毒載體突變，而 該突變還可能會(huì)危害在腫瘤細(xì)胞中的裂解復(fù)制。
[0007] 發(fā)明概述
[0008] 本發(fā)明提供了一種具有腫瘤選擇性擴(kuò)增能力但未減毒的oHSV，其可通過(guò)結(jié)合再靶 向腫瘤相關(guān)細(xì)胞表面受體的載體和由細(xì)胞microRNA( "miR"）導(dǎo)致的載體的復(fù)制抑制來(lái)實(shí) 現(xiàn)，其中所述細(xì)胞mi croRNA在正常腦中高度表達(dá)而在腫瘤細(xì)胞中幾乎是不存在的。miR反應(yīng) 性元件在裸鼠腦中阻礙載體的發(fā)病過(guò)程，而不妨礙在體外或異種腦腫瘤模型中的原代腫瘤 細(xì)胞中的胞溶性載體復(fù)制。該新載體設(shè)計(jì)將提供一種更安全且更有效的載體平臺(tái)，并可進(jìn) 一步開(kāi)發(fā)以應(yīng)用于患者腫瘤。
[0009] 附圖若干視圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明
[0010] 圖1呈現(xiàn)了來(lái)自T124元件的有效性和特異性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的數(shù)據(jù)。將在3'UTR中包含 T124(pfLuc-T124)或?qū)φ招蛄?pfLuc-Ctrl)的螢火蟲(chóng)熒光素酶(fLuc)表達(dá)質(zhì)粒與海腎熒 光素酶(prLuc)內(nèi)參質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入在24小時(shí)前已經(jīng)轉(zhuǎn)染了合成的pre-miR-124或pre-miR-21的HEK293AD細(xì)胞中。48小時(shí)后測(cè)定熒光素酶活性。結(jié)果表示為根據(jù)rLuc活性進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化 的fLuc活性的三次測(cè)定值的均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差。具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著性差異的數(shù)據(jù)對(duì)由相應(yīng)P 值(未配對(duì)t檢驗(yàn))下的方括號(hào)表示。
[0011] 圖2呈現(xiàn)了來(lái)自膠質(zhì)瘤細(xì)胞中病毒復(fù)制實(shí)驗(yàn)結(jié)果的數(shù)據(jù)。（A)載體圖。親本K0S-37BAC在病毒UL37和UL38基因之間包含ΙοχΡ側(cè)接的BAC序列、氯霉素抗性序列和lacZ序列 ("BAC"）（Gierasch等人，2006)。如下闡明了用于生成KGBAC和KG4: T124BAC的修飾：gB:NT， gB基因中的增強(qiáng)病毒進(jìn)入的雙重突變;gC-eGFP，經(jīng)由2A肽序列將完整gC 0RF融合至GFP; Δ Joint，刪除完整的內(nèi)部重復(fù)區(qū)，包括1個(gè)拷貝的所述ICP4基因；ICP4:T124,將T124插入剩余 的ICP4基因的3'UTR中。UL，病毒基因組的單一長(zhǎng)片段;US，單一短片段。（B)T124對(duì)于培養(yǎng)中 的來(lái)源于患者的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中病毒復(fù)制的作用。以0.01的Μ0Ι采用KG或KG4:T124病毒感染 G1 i68和GBM30細(xì)胞，并且一式三份進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)。在感染后的指定時(shí)間點(diǎn)，收集細(xì)胞裂解物 和上清液并在U20S細(xì)胞上測(cè)定滴度。值為均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差。（C)LV124感染的Gli68細(xì)胞中的 MiR-124表達(dá)。在5cfu/細(xì)胞感染細(xì)胞，之后三天在含嘌呤霉素培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選，并收獲總 RNA提取物。對(duì)照RNA來(lái)自未感染的Gli68和U20S細(xì)胞。通過(guò)qRT-PCR三重測(cè)定miR-124水平并 根據(jù)RNU43的水平進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化。所顯示的數(shù)據(jù)是相對(duì)于U20S細(xì)胞增加的倍數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏 差。所有數(shù)據(jù)對(duì)間的P〈〇.〇5(未配對(duì)t檢驗(yàn)）。0)在miR-124轉(zhuǎn)導(dǎo)和對(duì)照GBM30和Gli68細(xì)胞中 的KG和KG4:T124病毒復(fù)制。用LV124或LV137R以5cfu/細(xì)胞感染細(xì)胞，采用嘌呤霉素篩選3 天，并用KG或KG4: T124以0.01的MOI重復(fù)感染。在U20S細(xì)胞上測(cè)定在感染后72小時(shí)和96小時(shí) 收集的細(xì)胞裂解物和上清液中合并的感染性HSV的滴度。結(jié)果為來(lái)自三個(gè)HSV感染的平行實(shí) 驗(yàn)的均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。方括號(hào)指示具有顯著差異的數(shù)據(jù)對(duì)，同時(shí)示出了相應(yīng)P值(未配對(duì)t檢 驗(yàn))。
[0012]圖3呈現(xiàn)了來(lái)自裸鼠腦中KG4:T124病毒復(fù)制和毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果的數(shù)據(jù)。將4.8xl09基 因組拷貝的KG或KG4: T124顱內(nèi)注射入各4只BALB/c裸鼠 （η = 4/組）。（A)載體注射后的經(jīng)時(shí) 動(dòng)物重量。左，注射KG的動(dòng)物;X，動(dòng)物死亡。右，注射KG4: T124的小鼠；實(shí)心圓，動(dòng)物處死。（B) 載體注射后鼠腦中的經(jīng)時(shí)總病毒基因組拷貝。收集來(lái)自載體注射組的在第5、14、21和33天 處死的單只KG4:T124注射小鼠和來(lái)自KG注射組的在第5天安樂(lè)死的具有嚴(yán)重疾病癥狀的最 后存活動(dòng)物的腦，分離DNA，通過(guò)qPCR測(cè)定每個(gè)腦中的病毒載體基因組總數(shù)。（C)本實(shí)驗(yàn)中動(dòng) 物的Kaplan-Meier存活曲線。箭頭指示來(lái)自KG4 : T124注射組的單只動(dòng)物的處死日。P = 0.0058,對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)。
[0013]圖4呈現(xiàn)了來(lái)自人惡性膠質(zhì)瘤裸鼠模型的EGFR再靶向miR-124敏感性HSV載體治療 的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的數(shù)據(jù)。顏內(nèi)移植磨碎的GBM30細(xì)胞并在5天后在相同坐標(biāo)注射PBS或1.8xl08gc 的 KGE 或 KGE-4:T124 病毒。（A)Kaplan-Meier 存活曲線。對(duì)數(shù)秩統(tǒng)計(jì)：KGE 對(duì) PBS，P = 0.0188; KGE-4: T124 對(duì) PBS，P = 0.0009; KGE 對(duì) KGE-4:1124，？ = 0.8327。（8)腫瘤細(xì)胞移植后的經(jīng)時(shí)動(dòng) 物重量。X，動(dòng)物死亡或安樂(lè)死。
[0014] 圖5呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)證明KMMP9介導(dǎo)酶活性MMP9的過(guò)表達(dá)。（A)KMMP9和KGw的結(jié)構(gòu)。（B) 感染KMMP9、KGw或KG(M0I = 0.1)的Vero細(xì)胞的細(xì)胞裂解物的蛋白印跡分析。β-微管蛋白和 HSV糖蛋白Β分別可視化作細(xì)胞和病毒加載對(duì)照。采用KGw或ΚΜΜΡ9在MOI = 1下感染原代GBM 細(xì)胞系(C)或Vero細(xì)胞(D)。感染24小時(shí)后收集細(xì)胞裂解物和上清液并組合(C)或單獨(dú)加載 (D)在10%聚丙烯酰胺/0.1%明膠凝膠上。電泳后37°C下過(guò)夜培養(yǎng)所述凝膠，用0.05%考馬 斯藍(lán)染色并脫染，并記錄圖像。縮寫(xiě)1，冗麗?9;6，1??;1?，對(duì)照病毒;1111.，未感染$8，糖蛋白 B;Sup.，上清液。
[0015] 圖6呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)證明KMMP9和KGw顯示出可比的細(xì)胞進(jìn)入和生長(zhǎng)模式。(A)在圖上列 出的多種gc/細(xì)胞下采用病毒感染圖左所列細(xì)胞。6小時(shí)后固定細(xì)胞并免疫染色I(xiàn)CP4JB)分 離GBM30和(C)GBM169細(xì)胞并采用KMMP9或KGw在200gc/細(xì)胞下進(jìn)行感染。在1、2、4和6dpi下 收集細(xì)胞裂解物并通過(guò)qPCR測(cè)定病毒基因組拷貝滴度。在任一宿主細(xì)胞系中均未觀測(cè)到兩 種病毒間的顯著性差異(GBM30:P = 0.20;GBM169:P = 0.11)。
[0016]圖7呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)證明KMMP9在與KGw的比較中顯示出相似或更高的體外腫瘤細(xì)胞殺 滅。10或100gc/細(xì)胞下感染U87、SNB19或GBM30細(xì)胞3或7天。通過(guò)MTT試驗(yàn)測(cè)定相對(duì)于未感染 細(xì)胞的細(xì)胞存活百分?jǐn)?shù)(n = 3;星號(hào):P〈0.05，未配對(duì)學(xué)生t檢驗(yàn)）。
[0017] 圖8呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)證明MMP9改善oHSV在球狀體中的感染性。在懸浮液中生長(zhǎng)GBM30細(xì) 胞并用lxl〇3pfu的KMMP9或KGw對(duì)其進(jìn)行感染。2-6dpi下在整體球狀體中每日可視化兩種載 體中來(lái)自gC-T2a-eGFP盒的綠色熒光。(A)3和5dpi下的代表性圖像。（B)每種載體6個(gè)球狀體 中eGFP信號(hào)的平均量化證實(shí)了 KMMP9比KGw感染性增加約2倍斤=0.006)。（(^)在4xl07基 因組拷貝/球狀體下用KMMP9或KGw感染兩組GBM30球狀體。固定球狀體、用DAPI染色，并以5μ m間隔記錄Ζ面共焦圖像。圖（C)顯示了自Ομπι至150μπι 3D重建后的分別來(lái)自ΚΜΜΡ9和KGw組的 2個(gè)代表性球狀體。藍(lán)色，DAPI;綠色，eGFP。圖（D)顯示了來(lái)自各組的2個(gè)球狀體在Z = 1 ΟΟμπι 下的Ζ面。（Ε)根據(jù)Ζ軸深度將各球狀體分為5段（自下而上:0-20μm、25-50μm、55-80μm、85-100 μm、105-120μm和125-140μm)。通過(guò)用平均eGFP信號(hào)除以DAPI信號(hào)計(jì)算球狀體各段中的 相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度。η = 7;星號(hào):Ρ〈0.05.
[0018] 圖9呈現(xiàn)了關(guān)于GBM裸鼠模型的ΚΜΜΡ9治療的數(shù)據(jù)。顱內(nèi)移植GBM30細(xì)胞并在5天后 在相同坐標(biāo)(0 · 5mm前、2mm側(cè)（右）、3mm深)注射ΚΜΜΡ9、KGw或roS。每日監(jiān)控動(dòng)物并當(dāng)顯示發(fā) 病跡象時(shí)將其處死。數(shù)據(jù)呈現(xiàn)為Kaplan-Meier存活曲線。采用KMMP9或KGw治療的動(dòng)物相比 于采用PBS治療的那些動(dòng)物顯著存活更長(zhǎng)時(shí)間（P〈0.01)。在KMMP9和KGw之間未發(fā)現(xiàn)顯著差 異(n = 4;P = 0.61，對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)）。
[0019] 圖10描述了每個(gè)病毒或模擬(PBS)治療GBM30動(dòng)物治療組中的一個(gè)動(dòng)物的T2加權(quán) 腦MRI圖像。（A)在GBM30移植10天后進(jìn)行治療并在治療前1天(-1天)和治療后第3、6、9和13 天收集圖像。(B)相同天數(shù)計(jì)算的腫瘤體積。
[0020] 發(fā)明詳述
[0021] 本發(fā)明提供了一種重組oHSV，其包含特異性針對(duì)在細(xì)胞(例如癌細(xì)胞)表面上存在 的分子(蛋白、脂質(zhì)或碳水化合物抗原決定簇）的非HSV配體，和插入到一個(gè)或多個(gè)HSV基因 (優(yōu)選地為HSV在正常（即，非癌性)細(xì)胞中復(fù)制所需的一個(gè)或多個(gè)HSV基因）座中的一個(gè)或多 個(gè)拷貝的一種或多種mi croRNA祀序列。本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含所述創(chuàng)新的oHSV的原液和 藥物組合物，以及使用所述創(chuàng)新的〇HSV殺滅腫瘤細(xì)胞的方法。
[0022]所述創(chuàng)新的oHSV的非HSV配體被并入暴露在所述HSV表面上的糖蛋白（例如gD或 gC)中以使用所述配體促進(jìn)靶向目標(biāo)細(xì)胞。例如，所述配體可被并入至gD的殘基1和25之間。 用于靶向GBM和其它癌細(xì)胞的優(yōu)選配體包括靶向EGFR和EGFRvIII、CD133、CXCR4、癌胚抗原 (CEA)、ClC-3/膜聯(lián)蛋白-2/MMP-2、人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體和EpCAM的那些，且所述配體可靶向此受 體或細(xì)胞表面分子，即，所述配體能夠特異性結(jié)合此受體或細(xì)胞表面分子。文獻(xiàn)中已描述了 EGFR和EGFRvIII特異性配體，例如抗體，scFv(單鏈抗體）和VHH(單域抗體）（Kuan等人， Int .J · Cancer，88，962-69 (2000); Wicks trand 等人，Cancer Res.，55(14): 3140-8( 1995); Omidfar 等人，Tumor Biology，25:296-305(2004);還參見(jiàn) Uchi da 等人.Molecular Therapy ,21:561-9(2013);還參見(jiàn)Braidwood等人，Gene Ther.，15,1579-92(2008))。
[0023]所述oHSV通過(guò)結(jié)合配體也可以或可替代地是靶向與癌癥非必要相關(guān)的其它細(xì)胞 表面分子或受體。例如，配體可包含自天然配體結(jié)合域(例如，生長(zhǎng)因子(例如EGF，其可靶向 EGFR，NGF，其可靶向trkA等））、肽或非肽激素、選擇結(jié)合靶分子的肽(例如，預(yù)設(shè)計(jì)錨蛋白重 復(fù)蛋白（DARPins))等。所述創(chuàng)新的oHSV還可包含gB和/或gH的突變形式，所述gB和/或gH的 突變形式促進(jìn)載體通過(guò)非經(jīng)典受體進(jìn)入(且優(yōu)選地在所述oHSV的基因組內(nèi)這些基因的一種 或兩種中也具有此突變）。
[0024]包含在所述創(chuàng)新的載體中的優(yōu)選microRNA靶序列（優(yōu)選為其串聯(lián)多拷貝）是miR-124,其對(duì)于神經(jīng)應(yīng)用具有特殊應(yīng)用（例如，當(dāng)使用所述創(chuàng)新的oHSV用于治療神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤 (例如GBM)時(shí)保護(hù)非癌性神經(jīng)元）?？商娲褂闷渌黰icroRNA靶序列保護(hù)其它類型的組織， 且選擇適當(dāng)microRNA靶序列以保護(hù)期望的組織或細(xì)胞類型是在本領(lǐng)域的普通技術(shù)范圍內(nèi)。 例如，miR-122和miR-199在正常肝細(xì)胞中表達(dá)而不在原發(fā)性肝癌中表達(dá);因此，miR-122和/ 或miR-199microRNA祀序列中的一種或組合可用在應(yīng)用所述創(chuàng)新的〇HSV來(lái)治療肝癌的實(shí)施 方式中。類似地，miR-128和/或miR-137microRNA靶序列可用在用于保護(hù)正常腦部的oHSV 中。一種示例性microRNA革E1序列可為microRNA的反向互補(bǔ)序列。
[0025] 所述microRNA靶序列優(yōu)選包含在HSV基因的3'非翻譯區(qū)（"UTR"）中，以在所述 microRNA存在時(shí)沉默該基因。優(yōu)選地，串聯(lián)插入多拷貝（例如兩拷貝、三拷貝、四拷貝、五拷 貝、六拷貝、或更多)所述microRNA革E1序列。優(yōu)選地，所述多拷貝的所述microRNA革E1序列通過(guò) 四個(gè)或更多個(gè)核苷酸(更優(yōu)選地八個(gè)或更多個(gè)核苷酸）的間隔序列相分離。不希望受限于理 論，但據(jù)信更大的間隔(例如，大于約8個(gè)核苷酸)提供增加的穩(wěn)定性。
[0026]更優(yōu)選地，為幫助保護(hù)非癌細(xì)胞免受HSV感染的溶解效應(yīng)，所述多拷貝的microRNA 靶序列插入非癌細(xì)胞復(fù)制所必需的HSV基因的3'UTR中，其為普通技術(shù)人員所知的。優(yōu)選地， 所述位點(diǎn)為HSV基因組內(nèi)正常（或天然)基因座中mi croRNA靶基因的3 ' UTR。本發(fā)明的優(yōu)選 oHSV包含插入ICP4基因 3 'UTR中的多拷貝的所述microRNA靶序列，例如在具有兩個(gè)天然拷 貝的所述ICP4基因的載體中的一個(gè)或兩個(gè)拷貝的所述ICP4基因。
[0027]所述創(chuàng)新的HSV載體的基因組可另外包含一個(gè)或多個(gè)外源性表達(dá)盒（即，包含與啟 動(dòng)子、增強(qiáng)子和其它適當(dāng)調(diào)控元件可操作連接的編碼序列），例如編碼報(bào)告蛋白（例如綠色 熒光蛋白）、溶瘤因子或增強(qiáng)腫瘤殺滅活性的試劑(例如腫瘤壞死因子（"TNF"）或TNF-相關(guān) 性凋亡誘導(dǎo)配體（"TRAIL"）、或其它在治療上重要的基因產(chǎn)物(例如，肽、藥物活化酶、抗體、 治療性RNA等）。優(yōu)選的外源性表達(dá)盒編碼基質(zhì)金屬蛋白酶，例如基質(zhì)金屬蛋白酶9 ("MMP9"），其降解膠原IV型（細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)和惡性膠質(zhì)瘤基底膜的主要成分）（Mammato 等人，Am.J.Pathol.，183(4) : 1293-1305(2013)，doi: 10. 1016/ j .ajpath. 2013.06.026 .Epub 2013年8月5日），因此由于橫向擴(kuò)張?jiān)鰪?qiáng)所述創(chuàng)新的載體的 腫瘤細(xì)胞感染并增強(qiáng)腫瘤殺滅活性。還優(yōu)選編碼增強(qiáng)所述創(chuàng)新的HSV的橫向擴(kuò)張的其它基 因的表達(dá)盒。
[0028]其它優(yōu)選的外源性表達(dá)盒編碼誘導(dǎo)針對(duì)所述創(chuàng)新的HSV用于治療的癌癥或腫瘤的 患者免疫反應(yīng)的蛋白或多肽。例如，此表達(dá)盒可包含編碼因子（如細(xì)胞因子（例如，IL-2和 IFN B))、針對(duì)細(xì)胞毒性T-淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4( "CTLA-4"）的抗體（Hodi等人， N. Engl.J. Med.，363(8):711-23(2010))、針對(duì)程序性細(xì)胞死亡蛋白1 ( "PD Γ )配體或受體自 身的抗體（Topalian等人，N.Engl.J.Med.，366(26) :2443-54(2012))以及上皮細(xì)胞黏附分 子（"EpCAM"）（Patriarca等人，Cancer Treatment Rev.，38:68_75(2012))的一個(gè)或多個(gè)核 酸。如上所述，EpCAM還可用作被所述創(chuàng)新的載體所識(shí)別的靶向標(biāo)記。而且，在待治療癌癥不 是CNS癌癥時(shí)，且更具體地不是膠質(zhì)瘤或惡性膠質(zhì)瘤的情況下，另一轉(zhuǎn)基因可編碼粒細(xì)胞巨 噬細(xì)胞集落刺激因子（"GM-CSF")。
[0029]其它優(yōu)選的表達(dá)盒編碼催化前藥轉(zhuǎn)化為活性劑的蛋白或多肽。例如，此表達(dá)盒可 編碼酶，例如胞嘧啶脫氨酶，其可在感染所述創(chuàng)新的載體的腫瘤或癌細(xì)胞中局部轉(zhuǎn)化5-氟 胞嘧啶（"5-FC"）為5-氟尿嘧啶（"5-FU"）（參見(jiàn)例如，Akimoto等人，J.Ophthalmol ·，86(5): 581-86(2002))，以便允許5-FU在此細(xì)胞或腫瘤內(nèi)局部起效而最小化5-FU的系統(tǒng)暴露。類似 地，此表達(dá)盒可編碼胸苷激酶(tk)(例如，可操作地連接至HSV即刻早期啟動(dòng)子或強(qiáng)組成型 啟動(dòng)子），其可活化更昔洛韋，或嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)，其可阻斷或減弱核糖核苷酸還原 酶的活性。在某些實(shí)施方式中，所述創(chuàng)新的載體還可包含功能性天然HSV tk基因。
[0030] 在所述創(chuàng)新的載體內(nèi)，所述外源性表達(dá)盒內(nèi)的編碼序列可以可操作地與任何期望 的基因調(diào)節(jié)序列連接，例如組成型啟動(dòng)子或可誘導(dǎo)的或組織特異型啟動(dòng)子，其許多實(shí)例是 現(xiàn)有技術(shù)中已知的。例如，一種通常使用的組成型啟動(dòng)子是人巨細(xì)胞病毒(hCMV)啟動(dòng)子，并 且還可使用其它啟動(dòng)子，例如，CMV早期增強(qiáng)子/雞β-肌動(dòng)蛋白（CAG)啟動(dòng)子和HSV即刻早期 啟動(dòng)子(例如，ICP4啟動(dòng)子)等。
[0031] 并且，在某些實(shí)施方式中，所述創(chuàng)新的載體的基因組包含內(nèi)源重復(fù)(接合）區(qū)連同 所述ICP47基因的啟動(dòng)子的刪除，所述重復(fù)(接合）區(qū)包含一個(gè)拷貝的各種二倍體基因 ICP0、 ICP34.5、LAT和ICP4。在其它實(shí)施方式中，替代刪除所述接合，可通過(guò)刪除這些基因或另外 限制它們的突變形成而沉默所述接合區(qū)中基因（特別是ICP0和/或ICP47)的表達(dá)。
[0032]所述創(chuàng)新的載體可通過(guò)HSV病毒學(xué)領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法制備。然而， 為便于操作所述HSV基因組并制造所述創(chuàng)新的載體，本發(fā)明還提供了編碼所述創(chuàng)新的載體 的核酸。一種優(yōu)選的核酸是編碼所述創(chuàng)新的載體的細(xì)菌人工染色體（"BAC"），其便于操作細(xì) 菌系統(tǒng)中的所述HSV。
[0033] 應(yīng)當(dāng)意識(shí)到所述創(chuàng)新的oHSV可用于靶向并殺滅癌細(xì)胞，無(wú)論在體內(nèi)或在體外。一 種優(yōu)選的應(yīng)用是在治療上使用所述創(chuàng)新的載體，特別是在人類患者中和/或針對(duì)人類腫瘤/ 細(xì)胞(其可為各種哺乳動(dòng)物中的異種移植物）。然而，所述方法還可用于動(dòng)物中，例如伴侶動(dòng) 物(例如，貓和狗），或農(nóng)業(yè)上重要的動(dòng)物(例如牛、羊、馬等)或動(dòng)物學(xué)上重要的動(dòng)物。所述創(chuàng) 新的載體可用于治療的示例性腫瘤/癌細(xì)胞涉及中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌癥，且特別是多形性惡性 膠質(zhì)瘤。
[0034]通常，當(dāng)足量病毒可被遞送至細(xì)胞群體以確保所述細(xì)胞接觸適當(dāng)量的病毒時(shí)，所 述創(chuàng)新的〇HSV載體最為有用。因此，本發(fā)明提供了一種原液，優(yōu)選均質(zhì)原液，其包含所述創(chuàng) 新的〇HSV載體。HSV原液的制備和分析是本領(lǐng)域中公知的。例如，可在包含采用oHSV載體轉(zhuǎn) 導(dǎo)的細(xì)胞的滾瓶中制造病毒原液。然后可在連續(xù)Nycodenze梯度上純化所述病毒原液，并等 分和貯存至需要使用時(shí)。病毒原液在滴度上相差很大，主要取決于病毒基因型以及用于制 備它們的方案和細(xì)胞系。優(yōu)選地，此原液具有至少約1〇 5空斑形成單位(pfu)的病毒滴度，例 如至少約106pfu或甚至更優(yōu)選至少約10 7pfu。在又一更優(yōu)選實(shí)施方式中，所述滴度可為至少 約108pfu，或至少約109pfu，且至少約10 1()pfu或至少約10npfu的高滴度原液最為優(yōu)選。例如 可使用表達(dá)所述載體靶向的受體的細(xì)胞建立此滴度。
[0035]本發(fā)明另外提供了包含所述創(chuàng)新的oHSV載體和運(yùn)載體(優(yōu)選生理學(xué)上可接受的運(yùn) 載體)的組合物。所述組合物的運(yùn)載體可為用于所述oHSV載體的任何適宜運(yùn)載體。所述運(yùn)載 體典型地為液體，但也可為固體，或者液體和固體組分的組合。所述運(yùn)載體理想地是藥學(xué)上 可接受的（例如，生理學(xué)上或藥理學(xué)上可接受的）運(yùn)載體(例如，賦形劑或稀釋劑）。藥學(xué)上可 接受的運(yùn)載體是公知的并易于獲得。運(yùn)載體的選擇將取決于(至少部分)用于給藥所述組合 物的特定載體以及特定方法。所述組合物可進(jìn)一步包含任何其它適當(dāng)組分，尤其用于增強(qiáng) 組合物的穩(wěn)定性和/或其最終用途。因此，具有多種本發(fā)明組合物的適當(dāng)制劑。以下制劑和 方法僅為示例性的且絕非限制。
[0036]適用于腸胃外給藥的制劑包括水性和非水性、等滲無(wú)菌注射溶液，其可包含抗氧 化劑、緩沖劑、抑菌劑以及使所述制劑與意圖接受者的血液等滲的溶質(zhì)，以及可包含懸浮 劑、增溶劑、增稠劑、穩(wěn)定劑和防腐劑的水性和非水性無(wú)菌懸浮液。所述制劑可呈現(xiàn)在單位 劑量或多劑量密閉容器中，例如安瓿和小瓶，并可貯存在僅需在即用前加入無(wú)菌液體賦形 劑(例如注射用水)的冷凍干燥(凍干)條件中。即用注射溶液和懸浮液可制自前述類型的無(wú) 菌粉末、顆粒和片劑。
[0037] 此外，所述組合物可包含附加的治療劑或生物活性劑。例如，可存在用于治療特定 適應(yīng)癥的治療因子。控制炎癥的因子(例如布洛芬或類固醇)可做為所述組合物的部分以減 少與體內(nèi)給藥所述載體相關(guān)的腫脹和炎癥以及生理痛苦。可連同組合物方法給藥免疫系統(tǒng) 抑制劑以減少針對(duì)所述載體自身的任何免疫反應(yīng)或相關(guān)紊亂?；蛘撸鼋M合物中可包含 免疫增強(qiáng)劑以上調(diào)機(jī)體對(duì)疾病，特別是對(duì)所述創(chuàng)新的載體用于針對(duì)的癌癥或腫瘤的自然防 御?？纱嬖诳股兀礆⒕鷦┖蜌⒄婢鷦┮越档团c轉(zhuǎn)基因程序相關(guān)的感染和其它紊亂的風(fēng) 險(xiǎn)。
[0038] 實(shí)施例1
[0039]目的：多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)是一種沒(méi)有有效療法的侵襲性腦瘤。已將oHSV載 體設(shè)計(jì)用于在動(dòng)物中治療人GBM模型，但在患者試驗(yàn)中證明其功效令人失望。我們?cè)噲D開(kāi)發(fā) 一種實(shí)現(xiàn)高選擇性腫瘤裂解而無(wú)載體減毒的新型〇HSV設(shè)計(jì)。
[0040] 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì):我們報(bào)道了在腫瘤細(xì)胞中選擇性感染和復(fù)制的工程化oHSV，所述選擇 性是通過(guò)憑借EGFR的完全再靶向感染以及通過(guò)憑借將多拷貝的神經(jīng)元特異性miR-124的識(shí) 別序列引入必需的ICP4即刻早期HSV基因的3'UTR以在正常神經(jīng)元中阻斷載體復(fù)制。選擇 miR-124是因?yàn)槠湓谏窠?jīng)元中高度表達(dá)但在GBM中幾乎檢測(cè)不到。在異種腦瘤治療實(shí)驗(yàn)中測(cè) 試載體功效。
[0041] 結(jié)果:采用miR-124敏感性病毒高劑量顱內(nèi)接種裸鼠未產(chǎn)生發(fā)病或病毒復(fù)制跡象， 這與通過(guò)miR-124與ICP4mRNA的相互作用在正常腦中阻塞病毒復(fù)制相符。采用EGFR再靶向、 miR124敏感性HSV在裸鼠中治療原代人GBM的原位模型證明了與采用親本EGFR再靶向病毒 治療相當(dāng)?shù)拈L(zhǎng)期存活率(彡50%)，因此表明miR-124識(shí)別元件未導(dǎo)致降低的療效。
[0042]結(jié)論:我們總結(jié)認(rèn)為通過(guò)組合載體感染的腫瘤靶向與通過(guò)在腫瘤中不存在而在正 常組織中高度表達(dá)的細(xì)胞microRNA實(shí)現(xiàn)的脫靶載體復(fù)制的消除可最大化未減毒oHSV的特 異性。
[0043] 介紹
[0044] GBM是有效療法依舊難以捉摸的最為惡性的癌癥形式之一。標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)學(xué)實(shí)踐(例如外 科手術(shù)以及放療和化療）已顯示出有限的長(zhǎng)期臨床收益。許多實(shí)驗(yàn)室中正在開(kāi)發(fā)包括來(lái)源 于單純皰疹病毒1型(oHSV-ι)的那些在內(nèi)的溶瘤性載體作為潛在的替代治療策略(i) wHSV 載體已顯示出治療原代GBM動(dòng)物模型的前景，但除了提供良好安全性以外，來(lái)自早期臨床試 驗(yàn)的結(jié)果未證實(shí)有效的腫瘤殺滅或患者存活的一致改善(2) (3)。
[0045] 實(shí)現(xiàn)HSV減毒的最常見(jiàn)方法是功能性刪除規(guī)避宿主針對(duì)感染的先天免疫反應(yīng)的非 必需基因，提供用于在非分裂細(xì)胞（如神經(jīng)元)復(fù)制的核苷酸池，以及預(yù)防細(xì)胞凋亡（2)。癌 細(xì)胞中病毒復(fù)制受到某些先天免疫反應(yīng)喪失(4)以及快速細(xì)胞分裂和失活的凋亡途徑(2) 的促進(jìn)。然而，這些特性對(duì)于當(dāng)前oHSV在多種腫瘤中的大量復(fù)制并非都是足夠的。
[0046] 作為改善載體功效的第一步，我們之前開(kāi)發(fā)了用于完全再靶向HSV的方法以將感 染從經(jīng)典HSV進(jìn)入受體重定向至高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞表面受體(例如EGFR和EGFRvIII) (5)。再 靶向的〇HSV顯示出強(qiáng)大的溶瘤活性以及對(duì)人GBM細(xì)胞的高度特異性，導(dǎo)致原位小鼠模型中 高水平的人類腫瘤破壞。此外，該治療載體產(chǎn)生了大多數(shù)受治療動(dòng)物的長(zhǎng)期存活且無(wú)載體 相關(guān)性毒性。然而，大多數(shù)高度表達(dá)的腫瘤相關(guān)性細(xì)胞表面標(biāo)記均以一定程度存在于正常 細(xì)胞類型中，因此，我們尋求通過(guò)獨(dú)立機(jī)制在正常腦中阻斷病毒復(fù)制而不減少在腫瘤中的 復(fù)制，以增加腫瘤靶向性非減毒載體的安全性。
[0047]近期研究已運(yùn)用正常和癌細(xì)胞間micr〇RNA(miRNA)表達(dá)模式的差異作為腫瘤靶向 的替代途徑(6)。已確定有至少30種miRNA在惡性膠質(zhì)瘤、神經(jīng)元和神經(jīng)前體細(xì)胞(NPCs)中 差異表達(dá)(7)(8)，提示這些差異可用于限制正常腦細(xì)胞中病毒復(fù)制而允許腫瘤細(xì)胞中的無(wú) 阻復(fù)制。在此我們證實(shí)將miR-124識(shí)別元件并入基本上野生型病毒的必需ICP4基因阻止了 高度表達(dá)miR-124的正常腦組織中HSV的復(fù)制。此外，我們顯示所述miR-124反應(yīng)元件未降低 EGFR再靶向載體的溶瘤活性。重要的是，因?yàn)槟[瘤表型取決于miR-124的持續(xù)缺失，所以潛 在上調(diào)miR-124作為從裂解病毒復(fù)制的細(xì)胞逃逸機(jī)制將限制細(xì)胞不受控制的增殖能力并因 此不會(huì)危害載體功效。在缺乏miR-124的細(xì)胞中進(jìn)行載體的生成，因此在原液制備期間沒(méi)有 產(chǎn)生miR-124抗性病毒突變體的選擇壓力?？偠灾@些特征賦予了載體安全性和腫瘤選 擇性，并提示了適用于多種腫瘤類型的溶瘤性載體設(shè)計(jì)的總體策略。
[0048] 結(jié)果
[0049] miR-124反應(yīng)元件的驗(yàn)證。在神經(jīng)元內(nèi)表達(dá)水平高于GBM細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平的多種 miRNA中，miR-124是最為豐富的在GBM中具有最小表達(dá)的一種(6)。我們?cè)O(shè)計(jì)了由不同的8個(gè) 核苷酸(nt)間隔序列相分離的成熟miR-124反向互補(bǔ)序列的4個(gè)串聯(lián)拷貝組成的miR-124反 應(yīng)元件(T124)。為評(píng)估此序列的功能性，我們將其插入螢火蟲(chóng)熒光素酶(fLuc)表達(dá)質(zhì)粒的 3'UTR并在經(jīng)報(bào)道很少表達(dá)或不表達(dá)miR-124的U20S骨肉瘤細(xì)胞中用特異性(pre-miR-124) 或非特異性(pre-miR-21)前體miRNA同其進(jìn)行共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)(9);包含海腎熒光素酶(rLuc)表 達(dá)質(zhì)粒用于標(biāo)準(zhǔn)化。結(jié)果(pfLuc-T124,圖1)顯示在24小時(shí)時(shí)在采用pre-miR-124共轉(zhuǎn)染的 細(xì)胞中fLuc活性相比于模擬共轉(zhuǎn)染細(xì)胞或采用pre-miR-21共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞嚴(yán)重降低。相反， 在采用包含4個(gè)拷貝的反向miR-21序列的對(duì)照f(shuō)Luc質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(pfLuc-Ctrl，模 擬)和采用pre-miR-21或pre-miR-124的pfLuc-Ctrl共轉(zhuǎn)染之間僅觀測(cè)到很小的fLuc表達(dá) 差異（圖1)。這些結(jié)果證實(shí)了 T124元件作為miR-124-介導(dǎo)的基因表達(dá)限制的有效和特異靶 點(diǎn)的功能性。
[0050] 針對(duì)miR-124表達(dá)的T124修飾HSV的復(fù)制敏感性。我們?cè)诖竽c桿菌中使用雙Red重 組（10)將一系列修飾引入K0S-37BAC，所述K0S-37BAC為細(xì)菌人工染色體(BAC)上的HSV-1K0S菌株的全長(zhǎng)基因克?。?1)。刪除產(chǎn)物KG BAe(圖2A)的包含一個(gè)拷貝的各種二倍體基因 1〇?0、10?34.5、1^1'和10?4的內(nèi)源重復(fù)(接合）區(qū)以及所述10?47基因的啟動(dòng)子。該刪除有助 于對(duì)4個(gè)刪除基因的剩余拷貝的操作、提供了用于增強(qiáng)病毒溶瘤活性的轉(zhuǎn)基因的潛在并入 的充?？臻g、并通過(guò)降低神經(jīng)毒性因子ICP34.5的表達(dá)增加了腫瘤特異性（12);消除ICP47 表達(dá)有益于病毒特異性T細(xì)胞對(duì)經(jīng)感染癌細(xì)胞的免疫識(shí)別（4)。隊(duì)^還包含經(jīng)由2A肽序列 (13)(14)融合至糖蛋白C(gC)0RF的GFP開(kāi)放閱讀框(0RF)以允許監(jiān)控后期（復(fù)制后）病毒基 因的表達(dá)。最后，我們顯示在gB基因中包含一對(duì)突變的KG bag增強(qiáng)HSV通過(guò)非經(jīng)典受體的進(jìn)入 (15) (16)。我們將所述T124序列重組入KGbag的剩余ICP4基因的3 'UTR中以產(chǎn)生KG4: T124bac (圖2A)。通過(guò)轉(zhuǎn)染U20S-Cre細(xì)胞，兩種BAC構(gòu)建體均轉(zhuǎn)化為病毒顆粒，伴隨同時(shí)除去位于 loxP位點(diǎn)間的BAC序列。斑塊純化后，制備KG和KG4: T124病毒原液并在U20S細(xì)胞上測(cè)定滴 度。
[0051 ]我們首先測(cè)定ICP4 3'UTR中4個(gè)串聯(lián)miR-124靶向位點(diǎn)的引入是否會(huì)在培養(yǎng)中影 響人GBM細(xì)胞中的病毒復(fù)制。結(jié)果（圖2B)顯示在兩種原代惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系Gli68和GBM30 的球狀體中KG4:T124以與KG相似的動(dòng)力學(xué)進(jìn)行復(fù)制，且所述2種病毒的產(chǎn)率在任何時(shí)間點(diǎn) 均無(wú)實(shí)質(zhì)差異。我們接著測(cè)定復(fù)制和病毒產(chǎn)率是否對(duì)用人miR-124表達(dá)慢病毒(LV124)轉(zhuǎn)導(dǎo) 這些細(xì)胞系敏感。圖2C顯示了 U20S、Gli68和Gli68-LV124細(xì)胞中的miR-124相對(duì)水平，其測(cè) 定是通過(guò)在逆轉(zhuǎn)錄小RNA上進(jìn)行實(shí)時(shí)qPCR并標(biāo)準(zhǔn)化至內(nèi)源性RNU43水平。KG在采用表達(dá)人 miR-137(LV137R)的反向互補(bǔ)序列(LV137R)的慢病毒構(gòu)建體轉(zhuǎn)導(dǎo)的Gli68-LV124和Gli68細(xì) 胞中同樣良好地生長(zhǎng)并具有相似滴度（圖2D)。相反，KG4:T124在前者中相比于在后者中生 長(zhǎng)不良，且采用LV124-相較于LV137R-轉(zhuǎn)導(dǎo)GBM30細(xì)胞也獲得了相似結(jié)果（圖2D)。結(jié)合來(lái)說(shuō)， 這些觀測(cè)強(qiáng)烈表明（i) ICP4基因中的T124元件作為以miR-124依賴性方式限制HSV復(fù)制的手 段是有效的，和（ii)2種GBM細(xì)胞系中內(nèi)源性miR-124的水平足夠低以最小化該作用。此外， qRT-PCR數(shù)據(jù)證實(shí)了 KG4: T124與KG相比，U20S細(xì)胞更適用于KG4: T124的未受損生長(zhǎng)和滴度 測(cè)定。
[0052] KG4:T124未在鼠腦中復(fù)制或?qū)е录膊　Ｒ呀?jīng)顯示在培養(yǎng)中的原代膠質(zhì)瘤細(xì)胞中外 源性miR-124表達(dá)在阻止KG4:T124載體生長(zhǎng)方面高度有效的情況下，我們接著測(cè)試鼠腦中 miR-124的內(nèi)源性水平是否足以預(yù)防載體復(fù)制以及與野生型病毒相關(guān)的典型神經(jīng)發(fā)病;我 們注意到成熟人和小鼠 miR-124在序列上相同（17)。我們這些實(shí)驗(yàn)中使用裸鼠以限制宿主 抗病毒反應(yīng)效應(yīng)并因而便于鑒定將T124插入病毒中的直接效應(yīng)。選擇BALB/c nu/nu小鼠，因?yàn)?這些動(dòng)物對(duì)于HSV復(fù)制和發(fā)病高度敏感（18) (19) (20)且已在之前用于針對(duì)人腫瘤細(xì)胞的腫 瘤治療功效實(shí)驗(yàn)（21) (12，22) (5)。我們比較KG對(duì)照載體和miR-124敏感性測(cè)試載體KG4: T124的以下兩種能力：在裸鼠腦中復(fù)制以及在將相等基因組拷貝（gc)數(shù)目（4.8xl09gc)顱 內(nèi)接種入右半球后導(dǎo)致致死感染。結(jié)果顯示注射對(duì)照載體導(dǎo)致動(dòng)物在5天內(nèi)快速死亡（圖 3A，C)，經(jīng)感染的腦內(nèi)存在的總gc數(shù)增加2倍（圖3B)。相反，如其直至處死的正常增重所例證 的，KG4: T124注射小鼠在33天觀測(cè)期間不具有可觀測(cè)的健康改變（圖3A)，且病毒gc含量在 此時(shí)間期間穩(wěn)定下降至約輸入量的0.4% (圖3B)。采用對(duì)照或測(cè)試載體接種的動(dòng)物之間的 存活差異（圖3C)是高度顯著的(P = 0.0058,對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)），表明插入ICP4基因3'UTR中的4個(gè) 拷貝的miR-124識(shí)別序列能夠在高度HSV敏感性裸鼠的腦中阻斷致死載體復(fù)制。因此，單獨(dú) 的這些序列足以預(yù)防腦中的載體毒性。
[0053]為證實(shí)來(lái)自這些結(jié)果的啟示（即，在病毒原液制備期間miR-124靶向位點(diǎn)的喪失或 突變滅活是極其稀少的），從KG4:T124病毒原液分離DNA并將其置于覆蓋ICP4 3'UTR中T124 插入位點(diǎn)的PCR。通過(guò)凝膠電泳的產(chǎn)物分析和DNA測(cè)序顯示沒(méi)有異常的PCR產(chǎn)品尺寸或核苷 酸變異性證據(jù)（數(shù)據(jù)未示出）。同樣地，采用KG4:T124病毒顱內(nèi)接種正常BALB/c小鼠 (1.5xl0 1()gC)3小時(shí)或21天后分離的全腦DNA的PCR和序列分析顯示整個(gè)T124區(qū)沒(méi)有異常(數(shù) 據(jù)未示出）。這些結(jié)果減輕了對(duì)于在KG4:T124病毒生長(zhǎng)期間或在體內(nèi)的miR-124不敏感性變 體潛在的選擇的顧慮。
[0054] miR-124反應(yīng)元件未損害EGFR靶向的溶瘤性HSV的活性。我們接著尋求確定保護(hù)性 miR-124識(shí)別元件是否會(huì)不利地影響人GBM的裸鼠模型中的病毒性腫瘤殺滅活性。因?yàn)楫?dāng)接 種入這些動(dòng)物的腦中時(shí)，KG是高度有毒的（圖3C)，使用該病毒作為荷瘤小鼠存活實(shí)驗(yàn)中的 治療對(duì)照可能會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物因所述病毒而非腫瘤死亡，因此其不具吸引力。取而代之，基于我 們發(fā)表的完全EGFR再靶向的野生型HSV-1K0S對(duì)裸鼠腦部無(wú)毒性但在裸鼠中原位人GBM的治 療中有效的發(fā)現(xiàn)(5)，我們將4拷貝的miR-124結(jié)合位點(diǎn)引入KG的完全EGFR再靶向衍生物。因 此，KG的EGFR再靶向版本和KG4: T124(分別稱作KGE和KGE-4: T124)的比較應(yīng)能確定miR-124 位點(diǎn)對(duì)病毒溶瘤活性的任何限制效應(yīng)。我們使用患者來(lái)源的成球GBM30細(xì)胞在裸鼠中建立 侵襲性顱內(nèi)腫瘤(5)。每日觀測(cè)動(dòng)物并當(dāng)其顯示發(fā)病跡象時(shí)將其安樂(lè)死。和我們發(fā)表的結(jié)果 相似，腫瘤細(xì)胞接種5天后在相同立體定位坐標(biāo)注射PBS的小鼠在腫瘤細(xì)胞移植數(shù)周內(nèi)死亡 (中位數(shù)21.5;圖4A，B)。相反，使用EGFR再靶向?qū)φ詹《綤GE或包含T124的再靶向載體KGE-4:T124的腫瘤治療在實(shí)驗(yàn)持續(xù)期間（90天)保護(hù)了半數(shù)的動(dòng)物且這兩組的中位生存期是可 比的（分別為79.5和85.5天;Ρ = 0.83，對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)）。這些結(jié)果表明KGE-4: T124ICP4基因中 的miR-124位點(diǎn)未損害GBM30腫瘤治療功效。
[0055] 討論
[0056] 我們的目標(biāo)是構(gòu)建一種溶瘤性HSV載體，其表達(dá)完全補(bǔ)足的病毒功能，但可僅感染 表達(dá)GBM相關(guān)受體的細(xì)胞并僅在腫瘤而非正常腦細(xì)胞中進(jìn)行高效復(fù)制。腫瘤選擇性感染和 裂解性病毒生長(zhǎng)依賴于完全病毒進(jìn)入再革E向（complete viral entry retargeting) (5)和 在正常腦組織中細(xì)胞miRNA介導(dǎo)的病毒復(fù)制限制的組合。此轉(zhuǎn)錄和翻譯后腫瘤靶向的組合 有望提供非常安全和有效的〇HSV，因?yàn)榱呀庑愿腥拘枰獙?duì)于維持腫瘤表型而言重要的靶細(xì) 胞的兩個(gè)單獨(dú)特性:革G向受體和腫瘤特異性miRNA表達(dá)模式。使用適合不同癌癥的革E1向和 miRNA反應(yīng)元件，該總體策略是廣泛可適用的;通過(guò)考慮相同類型的個(gè)體腫瘤間特異性抗原 和miRNA表達(dá)的差異可將其應(yīng)用優(yōu)化以用于個(gè)體化治療。
[0057] 在GBM中，改變的基因表達(dá)包括多種miRNA相比于正常腦組織的實(shí)質(zhì)性下調(diào)（23-25)，表明若干可能的miRNA可用于在正常腦中優(yōu)先減毒工程化病毒的復(fù)制。因?yàn)閙iR-124被 認(rèn)為是神經(jīng)元分化的潛在誘導(dǎo)物(26)且在GBM中最為高度下調(diào)(6)，我們將此miRNA聚焦為 在正常腦組織中阻斷〇HSV復(fù)制的手段。將miR-124的重復(fù)識(shí)別位點(diǎn)（T124)引入病毒ICP4基 因的3'UTR中，其中ICP4基因的產(chǎn)物是啟動(dòng)HSV裂解周期所絕對(duì)需要的。我們發(fā)現(xiàn)在膠質(zhì)瘤 細(xì)胞中，T124+病毒可與缺乏T124的對(duì)照病毒一樣強(qiáng)力地進(jìn)行實(shí)質(zhì)復(fù)制而miR-124的慢病毒 表達(dá)選擇性地阻斷其復(fù)制。此外，T124元件足以完全保護(hù)裸鼠免受非常高的顱內(nèi)載體劑量 (4.8xl0 9顆粒)的影響而對(duì)照載體在5天內(nèi)殺滅所有動(dòng)物。這些動(dòng)物腦中總病毒基因組拷貝 數(shù)的測(cè)定未顯示出T124+載體復(fù)制的證據(jù)而是病毒基因組含量的經(jīng)時(shí)逐漸減少。如通過(guò)在 來(lái)自病毒原液和感染動(dòng)物的純化DNA中擴(kuò)增的ICP43 ' UTR的尺寸和序列分析所評(píng)估的，所述 T124序列是穩(wěn)定的，這與在無(wú)腫瘤動(dòng)物中或在來(lái)自我們腫瘤治療實(shí)驗(yàn)的長(zhǎng)期幸存者中缺乏 明顯的神經(jīng)發(fā)病學(xué)相符。最后，我們使用一種不能感染小鼠細(xì)胞的再靶向病毒以證實(shí)T124 元件未降低此病毒在人GBM裸鼠模型中的溶瘤功效。
[0058]病毒靶向腫瘤受體和miRNA介導(dǎo)的正常細(xì)胞中病毒復(fù)制的阻斷的組合通過(guò)阻斷可 與腫瘤共享靶向受體(例如，EGFR)的正常細(xì)胞的生產(chǎn)性感染而增強(qiáng)裂解病毒的靶向特異 性。雖然我們的結(jié)果顯示將四拷貝的miR-124靶序列插入ICP4基因3'UTR中完全阻斷了裸鼠 中非常高劑量的病毒的神經(jīng)發(fā)病，但并非所有腦細(xì)胞都表達(dá)miR-124。例如，預(yù)期位于海馬 體和室下區(qū)（SVZ)中的神經(jīng)元前體細(xì)胞(NPC)不被所述miR-124靶序列保護(hù)，因?yàn)檫@些細(xì)胞 具有與GBM細(xì)胞相似的miRNA表達(dá)模式，包括miR-124的最小表達(dá)（27)。然而，若干miRNA在 NPC中以比在膠質(zhì)瘤中高至100倍的水平表達(dá)(27) (28) (29) (30)，提示將附加的miRNA的靶 向位點(diǎn)構(gòu)建入相同病毒的相同或其它必需基因處以在更廣范圍的腦細(xì)胞內(nèi)阻斷復(fù)制而不 損害腫瘤特異性病毒復(fù)制的可能性。
[0059]雖然我們的研究提示病毒靶向腫瘤抗原和miRNA限制正常組織中復(fù)制的組合是一 種有效且高特異性腫瘤病毒療法的有吸引力的策略，但很有可能個(gè)體腫瘤對(duì)于治療的反應(yīng) 將由于腫瘤抗原水平以及可能的miRNA含量的可變性而不同。例如，在歸類為GBM的腫瘤間 存在顯著差異，且甚至是在分子定義的GBM亞型內(nèi)，基因表達(dá)模式的異質(zhì)性保留（31)。因此， 單一再靶向病毒將不能有效針對(duì)所有GBM或相同亞型的所有GBM。此外，可預(yù)期由于腫瘤內(nèi) 預(yù)先存在或治療誘導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞(cell-to-cell)變異性而在大量oHSV敏感性腫瘤中可出 現(xiàn)抗性細(xì)胞群體。過(guò)去若干年的發(fā)展提示在許多不同腫瘤類型中認(rèn)定的小群體的自我更 新、化療和放療抗性癌癥干細(xì)胞(CSC)是治療的最相關(guān)靶點(diǎn)（32)。雖然比較給定腫瘤和個(gè)體 CSC是有問(wèn)題的，但很有可能其在腫瘤內(nèi)的變異性相對(duì)于完全腫瘤細(xì)胞群體是受限的。文獻(xiàn) 中報(bào)道描述了不同的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(GSC)標(biāo)記(33)且再靶向溶瘤性病毒可用于區(qū)分這些中 的每種對(duì)于在裸鼠中建立和維持人GBM的意義。我們預(yù)期再靶向不同GSC候選標(biāo)記的載體的 組合能夠更為有效地治療對(duì)個(gè)體再靶向載體顯示出部分反應(yīng)的腫瘤。因?yàn)槊糠N這些載體還 可靶向某些正常細(xì)胞，類似于我們的EGFR再靶向病毒，因此在這些正常細(xì)胞中miRNA介導(dǎo)的 病毒復(fù)制阻斷將越發(fā)重要。此外，如由Kambara和同事在oHSV領(lǐng)域中所倡導(dǎo)的（34)，可使用 細(xì)胞類型或發(fā)育階段特異性啟動(dòng)子獲得進(jìn)一步的特異性以控制關(guān)鍵病毒復(fù)制功能的表達(dá)。 雖然這些特征可提供高活性和特異性的溶瘤性載體混合物，但值得注意的是載體（例如 KGE-4:T124)具有充足空間以容納可增強(qiáng)治療功效的轉(zhuǎn)基因，例如基因編碼免疫調(diào)節(jié)劑、月中 瘤細(xì)胞迀移抑制劑或降解腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)并因而促進(jìn)瘤內(nèi)病毒擴(kuò)張的蛋白水解酶。
[0060]總而言之，本實(shí)施例中所述KGE-4:T124載體代表了一種新型OHSV，其包含病毒復(fù) 制功能的完全補(bǔ)足，但由再靶向腫瘤相關(guān)受體的病毒包膜和對(duì)在正常組織而非腫瘤中表達(dá) 的miRNA的復(fù)制敏感性的組合獲得了腫瘤特異性。此控制系統(tǒng)的組合可應(yīng)用于其它腫瘤類 型，但之前尚未在溶瘤性載體中進(jìn)行描述。我們的策略的關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)是（i)所述載體不包含任 何缺陷基因，可在腫瘤中最大化病毒復(fù)制以提供優(yōu)化的溶瘤病毒療法，以及（ii)載體復(fù)制 同時(shí)需要重要腫瘤相關(guān)細(xì)胞表面標(biāo)記的表達(dá)以及實(shí)質(zhì)上不同于正常組織的腫瘤特異性的 miRNA表達(dá)模式。我們策略的最引人注目的論據(jù)在于經(jīng)選擇的在正常腦中控制載體復(fù)制的 miRNA不能在不損害腫瘤表型的情況下在惡性膠質(zhì)瘤中上調(diào)(7,25,35);損失靶向受體，例 如被我們的載體所識(shí)別的腫瘤特異性EGFRvIII變體，可具有相似效果。因此，雖然在大多數(shù) 癌癥療法中腫瘤發(fā)展了逃逸治療的能力，但采用腫瘤抗原靶向性、miRNA調(diào)節(jié)病毒不大可能 發(fā)生此結(jié)果?？偠灾?，這些論據(jù)支持以下預(yù)期:我們的方法將提供用于治療GBM和其它癌 癥的高度選擇性、安全和有效的溶瘤性HSV載體系統(tǒng)。
[0061 ]材料和方法
[0062]細(xì)胞培養(yǎng)。U20S、HEK293T 和 HEK293AD 細(xì)胞來(lái)自 ATCC(Manassas，VA)并在 37°C 下5% C〇2培養(yǎng)器中在添加了5-10% (v/v)胎牛血清(FBS; Sigma，St. Louis，M0)的ATCC推薦培養(yǎng)基 中生長(zhǎng)。通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)生成穩(wěn)定表達(dá)Cre重組酶(U20S-Cre)的U20S細(xì)胞系（Y. Μ.和 J. C. G.，未發(fā)表結(jié)果）ΑΒΜ30和Gli68患者來(lái)源的原代膠質(zhì)瘤球狀體細(xì)胞系由E. A. Chiocca (哈佛醫(yī)學(xué)院，ΜΑ)慷慨提供，并生長(zhǎng)在添加了 2%(V/v)B27w/〇維生素 A、2mg/mL兩性霉素 B (Lonza，Walkersville，MD)、100yg/mL慶大霉素（Lonza)、2mM L-谷氛醜胺（Cellgro， Manassas，VA)、加 10ng/mL重組人表皮生長(zhǎng)因子(rhEGF)和10ng/mL重組人堿性成纖維細(xì)胞 生長(zhǎng)因子（bFGF)(均來(lái)自 Shenandoah Biotechnology，Warwick，PA)的Neurobasal培養(yǎng)基 (Gibco/Invitrogen/Life Technologies，Carlsbad，CA)中。
[0063] 質(zhì)粒。pfLuc-T124包含通過(guò)8個(gè)核苷酸相分離的hsa-miR-124序列的反向互補(bǔ)序列 的四個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列，而pfLuc-ctrl包含通過(guò)8個(gè)核苷酸相分離的hsa-miR-21反向序列的 四個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列。兩種質(zhì)粒的構(gòu)建均是通過(guò)將退火的互補(bǔ)寡核苷酸插入PMIR-REP0RT? (miRNA Expression Reporter載體系統(tǒng);Ambion，Austin，TX)中焚光素酶基因的3 ' UTR。寡 核苷酸為T124-F、T124-R、TconF和TconR(表1)。退火的寡核苷酸采用Spel和SacI消化，并連 接到 Spe I-Sac I 消化的 pMIR-REPORT?。
[0064] HSV基因組工程化。在細(xì)菌人工基因組(BAC)上包含完整菌株KOS HSV-1基因組的 K0S-37BAC(11)由David Leib(達(dá)特茅斯醫(yī)學(xué)院，NH)友善提供。該BAC中的HSV短獨(dú)特(Us)區(qū) 相對(duì)于 HSV-lK0S(36)(GenBank 登記號(hào) JQ673480)公開(kāi)序列（132、275-145、608位）（36)為反 方向。以下進(jìn)一步詳述的修飾是通過(guò)雙Red重組引入，其基本如Tischer等人（10)所述。質(zhì)粒 pEPkan-S和pBAD-I-scel(lO)是由Nikolaus 0sterrieder(柏林自由大學(xué)，德國(guó)）慷慨提供。 通過(guò)PCR分析、限制性內(nèi)切酶消化的FIGE分析和局部DNA測(cè)序核實(shí)改變。
[0065] 如下所示，按順序得到本研究中使用的載體。KGBAe來(lái)源于K0S-37BAC，其通過(guò)刪除 完全HSV內(nèi)部重復(fù)區(qū)或"接合"（IRL，IRs)獲得，經(jīng)由Thosea asigna病毒2A(T2A)翻譯終止/再 起始序列（13)(37)將綠色熒光蛋白（GFP)開(kāi)放閱讀框(0RF)融合至糖蛋白C(gC)0RF，以及在 gB編碼序列（gB: N/T; (15)中引入兩個(gè)錯(cuò)義突變。KG4: T124BAe是從KGBAe通過(guò)將來(lái)自pfLuc-T124的T124元件插入ICP4基因的3'UTR創(chuàng)建得到的。再靶向載體KGE bag來(lái)源于KGbag，其通過(guò) 在gD 1位和25位之間包含人EGFR特異性單鏈抗體序列的gD-scEGFR的相應(yīng)區(qū)域替換gD基因 的氨基末端區(qū)以及密碼子38處的錯(cuò)義突變(5)獲得。KGE-4:T124 bag結(jié)合了來(lái)自KG4:T124bac 和KGEbag的修飾。
[0066] 病毒生長(zhǎng)和純化。通過(guò)使用Lipof ectamine?LTX試劑（Invitrogen)轉(zhuǎn)染U20S_Cre 細(xì)胞將BAC DNA轉(zhuǎn)為感染性病毒;這些細(xì)胞中表達(dá)的Cre重組酶可除去病毒生長(zhǎng)抑制性BAC 元件以及鄰近的位于K0S-37BAC中的lacZ基因和ΙοχΡ重組信號(hào)之間的衍生物（11)。通過(guò)有 限稀釋分離單一斑塊并通過(guò)X-gal染色測(cè)試lacZ基因的消除（38)。使無(wú)色斑塊經(jīng)受兩個(gè)附 加循環(huán)的有限稀釋并通過(guò)純化病毒體DNA的局部DNA測(cè)序證實(shí)BAC/lacZ區(qū)的準(zhǔn)確移除。在 U20S細(xì)胞上確立病毒原液的生物滴度(PFU/mL);如下所述，通過(guò)針對(duì)病毒gD基因的定量實(shí) 時(shí)PCR (qPCR)測(cè)定基因組拷貝的物理滴度(gc) /mL。
[0067] 焚光素酶試驗(yàn)。使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)將海腎焚光素酶表達(dá)質(zhì)粒 prLuc連同不同的螢火蟲(chóng)焚光素酶表達(dá)質(zhì)粒和口代-11111?1'%11?財(cái)前體(41]113；[011)的組合轉(zhuǎn)染 HEK293AD細(xì)胞。第二天，裂解細(xì)胞并使用Berthold LB_953AutoLumat光度計(jì)（Berthold Technologies USA，0ak Ridge，TN)測(cè)定螢火蟲(chóng)-海腎熒光素酶表達(dá)比率。
[0068] miRNA的慢病毒表達(dá)。將來(lái)自U-87人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的基因組DNA用作模板來(lái)使用 PCR擴(kuò)增來(lái)自hsa-miR-124-3基因的人pri-miR-124序列，所述擴(kuò)增使用高保真Accuprime富 GC DNA聚合酶（Invitrogen)和表1中所列的miR-124引物對(duì)。用BamHI和Nhel消化320-bp產(chǎn) 物，在miRNASelect pEP-miR載體(Cell Biolabs，San Diego，CA)內(nèi)含子中的相應(yīng)位點(diǎn)間克 隆，并確認(rèn)序列。隨后通過(guò)替換固有EF1啟動(dòng)子將所述啟動(dòng)子-內(nèi)含子-pri-miR-124區(qū)轉(zhuǎn)入 pCDH-CMV-MCS-EFl-Puro(System Biosciences，Mountain View，CA)以產(chǎn)生慢病毒表達(dá)質(zhì) 粒pCDH-miR-124。使用相同程序構(gòu)建包含反方向pri-miR-137序列的對(duì)照慢病毒質(zhì)粒 (pCDH-miR-137R);用于pri-miR-137克隆的PCR引物在表1中列出。通過(guò)采用包裝質(zhì)粒pLPl、 pLP2、pLP-VSVG(Invitrogen)將 pCDH-miR-124 或 pCDH-miR-137R 分別共轉(zhuǎn)染入 HEK293T 細(xì)胞 產(chǎn)生慢病毒LV124和LV137RJ2小時(shí)后收獲上清液，通過(guò)0·45μπι濾器（Millipore， Billerica，MA)并在4°C和6,800x g下離心濃縮16小時(shí)。將球丸再懸在DMEM中并將其滴度表 示為對(duì)HEK293T細(xì)胞每ml的嘌呤霉素抗性集落形成單位(cfu)。
[0069] 在存在8yg/mL聚凝胺的情況下在具有5cfu/細(xì)胞的LV124或LV137R的懸浮液中感 染2xl05磨碎的Gli68或GBM30細(xì)胞90min并點(diǎn)板。次日用包含30yg/mL嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng) 基喂養(yǎng)細(xì)胞并在72小時(shí)后用KG或KG4: T124病毒以0.0 lpfu/細(xì)胞的Μ0Ι重復(fù)感染。HSV感染后 72和96小時(shí)時(shí)從細(xì)胞和上清液收集感染性病毒顆粒并在U20S細(xì)胞上計(jì)算滴度。如下所述， 72小時(shí)嘌呤霉素選擇后從LV124感染的Gli68細(xì)胞的平行培養(yǎng)液分離RNA用于通過(guò)qRT-PCR 測(cè)定miR-124水平。
[0070] RNA分離和逆轉(zhuǎn)錄(RT)-qPCR。根據(jù)制造商的說(shuō)明使用TRIzol試劑（Invitrogen)從 U20S、Gli68和LV124Gli68感染細(xì)胞提取總RNA。采用DNA酶I(Invitrogen)處理RNA樣本、使 用NanoDrop 2000c分光光度計(jì)（Thermo-Fisher，Pittsburgh，PA)定量并在MOPS-甲酸凝膠 上可視化用于質(zhì)量保證。根據(jù)TaqMan Small RNA試驗(yàn)方案（Applied Biosystems/Life Technologies，Carlsbad，CA)相對(duì)于 RNU43測(cè)定成熟 hsa-miR-124 水平。TaqMan 引物和探針 來(lái)自Applied Biosystems。所有TaqMan PCR反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行三次。
[0071 ]動(dòng)物。3-4周齡BALB/c無(wú)胸腺nu/nu小鼠購(gòu)自Charles River實(shí)驗(yàn)室(Wilmington， Μ)并飼養(yǎng)在BSL2設(shè)施中。根據(jù)如匹茲堡大學(xué)機(jī)構(gòu)動(dòng)物管理及使用委員會(huì)(IACUC)批準(zhǔn)的實(shí) 驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理及使用指南(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所，1985)中的要求和建議進(jìn)行所有動(dòng)物程序。 [00 72]盧頁(yè)內(nèi)毒性。如同所述(5)進(jìn)行盧頁(yè)內(nèi)病毒接種。小鼠接受4.811098(：1(6或1(64:1'124病 毒(n = 4/組）。每日監(jiān)控動(dòng)物的發(fā)病跡象并隔日稱重。KG組的所有小鼠死于第5天且其它組 的一只小鼠在相同天數(shù)處死。KG4: T124組的剩余動(dòng)物在第14、21和33天處死。從安樂(lè)死小鼠 收集全腦用于如下所述的總DNA提取和病毒基因組qPCR。
[0073] 病毒基因組qPCR。根據(jù)制造商程序使用DNeasy Blood&Tissue試劑盒（Qiagen， Valencia，CA)從鼠腦或病毒原液提取DNA。使用Applied Biosystems Step One?和 StepOnePlus?實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)手冊(cè)中描述的方案在來(lái)自包含完全HSV-1 (菌株K0S)gD編碼序列 (pE-gD18)的pENTRlA(Invitrogen)質(zhì)粒的DNA上產(chǎn)生qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。引物和探針序列在表1 中列出。
[0074] 表 1
[0076]
[0077]
[0078] 腫瘤模型和治療。根據(jù)描述(5)將人GBM30細(xì)胞顱內(nèi)移植入裸鼠。在第5天時(shí)，也如 所述(5)在相同坐標(biāo)處接種病毒（1 · 8xl08gc KGE或KGE-4: T124，η = 8/組)或PBS (η = 2)。如 上所述在"顏內(nèi)毒性"項(xiàng)下監(jiān)控動(dòng)物健康狀況。當(dāng)顯示發(fā)病跡象時(shí)將動(dòng)物安樂(lè)死。
[0079] 統(tǒng)計(jì)分析。使用用于Windows的GraphPad Prism 6.01版（GraphPad Software，La Jol la，CA; www.graphpad.com)進(jìn)行具有Welch修正的未配對(duì)t檢驗(yàn)。將動(dòng)物存活數(shù)據(jù)繪制為 Kap lan-Me i er曲線并使用相同軟件通過(guò)Mant e 1 -Cox對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)進(jìn)行比較。
[0080] 實(shí)施例1的參考文獻(xiàn)
[0081] 1.Parker JN,Bauer DF,Cody JJ,Markert JM.Oncolytic viral therapy of malignant glioma.Neurotherapeutics.2009；6:558-69.
[0082] 2.Grandi P，Peruzzi P，Reinhart B，Cohen JB，Chiocca EA，Glorioso JC. Design and application of oncolytic HSV vectors for glioblastoma therapy.Expert Rev Neurother.2009;9:505-17.
[0083] 3.Markert JM，Medlock MD，Rabkin SD，Gillespie GY，Todo T，Hunter TO等人， Conditionally replicating herpes simplex virus mutant?G207for the treatment of malignant glioma:results of a phase I trial.Gene therapy.2000；7:867-74.
[0084] 4.Todo T.Oncolytic virus therapy using genetically engineered herpes simplex viruses.Frontiers in bioscience : a journal and virtual library.2008； 13:2060-4.
[0085] 5.Uchida H，Marzulli M，Nakano K，Goins WF，Chan J，Hong CS等人，Effective treatment of an orthotopic xenograft model of human glioblastoma using an EGFR-retargeted oncolytic herpes simplex virus.Molecular therapy:the journal of the American Society of Gene Therapy.2013；21:561-9.
[0086] 6 · Gaur A，Jewe 11 DA，L i ang Y，Ri dzon D，Moor e JH，Chen C等人， Characterization of microRNA expression levels and their biological correlates in human cancer cell lines.Cancer research.2007；67:2456-68.
[0087] 7.Karsy M，Arslan E，Moy F.Current Progress on Understanding MicroRNAs in Glioblastoma Multiforme.Genes&cancer.2012;3:3-15.
[0088] 8.Riddick G?Fine HA.Integration and analysis of genome-scale data from gliomas.Nature reviews Neurology.2011；7:439-50.
[0089] 9·Kumar MS，Lu J，Mercer KL，Golub TR，Jacks T·Impaired microRNA processing enhances cellular transformation and tumorigenesi s. Nature genetics.2007;39:673-7.
[0090] lO.Tischer BK?von Einem J?Kaufer B?Osterrieder N.Two-step red-mediated recombination for versatile high-efficiency markerless DNA manipulation in Escherichia coli.Biotechniques.2006；40:191-7.
[0091] ll.Gierasch ffff?Zimmerman DL，Ward SL?Vanheyningen TK，Romine JD，Leib DA. Construction and characterization of bacterial artificial chromosomes containing HSV-lstrains 17and K0S.J Virol Methods.2006；135:197-206.
[0092] 12.Bennett JJ，Delman KA，Burt BM，Mariotti A，Malhotra S，Zager J等人， Comparison of safety,delivery,and efficacy of two oncolytic herpes viruses (G207and NV1020)for peritoneal cancer.Cancer gene therapy.2002;9:935-45.
[0093] 13·Szymczak AL，Vignali DA.Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors.Expert Opin Biol Ther.2005；5:627-38.
[0094] 14.Doronina VA?ffu C?de Felipe P?Sachs MS?Ryan MD?Brown JD.Site-specific release of nascent chains from ribosomes at a sense codon.Mol Cell Biol.2008；28:4227-39.
[0095] 15.Uchida H，Chan J，Goins WF，Grandi P，Kumagai I，Cohen JB等人，A double mutation in glycoprotein gB compensates for ineffective gD-dependent initiation of herpes simplex virus type 1 infection.Journal of virology.2010； 84:12200-9.
[0096] 16.Uchida H，Chan J，Shrivastava I，Reinhart B，Grandi P，Glorioso JC等人， Novel Mutations in gB and gH Circumvent the Requirement for Known gD Receptors in Herpes Simplex Virus lEntry and Cell-to-Cell Spread.Journal of virology.2013;87:1430-42.
[0097] 17.Cao X，Pfaff SL，Gage FH.A functional study of miR_124in the developing neural tube.Genes&development.2007；21:531-6.
[0098] 1 8 · Fu j i oka N，Akazawa R，Ohash i K，F(xiàn)u j i i Μ，I keda M，Kur imo t o M.Interleukin-18protects mice against acute herpes simplex virus type 1 infection.Journal of virology.1999；73:2401-9.
[0099] 19.Manickan E，Rouse RJ，Yu Z，Wire WS，Rouse BT.Genetic immunization against herpes simplex virus . Protection is mediated by CD4 + T lymphocytes.Journal of immunology.1995；155:259-65.
[0100] 20.Sethi KK?0mata Y?Schneweis KE.Protection of mice from fatal herpes simplex virus type linfection by adoptive transfer of cloned virus-specific and H-2-restricted cytotoxic T lymphocytes .The Journal of general virology.1983；64(Pt 2):443-7.
[0101] 21.Currier MA，Gillespie RA，Sawtell NM，Mahller YY，Stroup G，Collins MH 等人，Efficacy and safety of the oncolytic herpes simplex virus rRp450alone and combined with cyclophosphamide.Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy.2008；16:879-85.
[0102] 22.Hong CS，F(xiàn)ellows W，Niranjan A，Alber S，Watkins S，Cohen JB等人， Ectopic matrix metalloproteinase-9expression in human brain tumor cells enhances oncolytic HSV vector infection.Gene therapy.2010；17:1200-5.
[0103] 23.Zhang Y，Chao T，Li R，Liu W，Chen Y，Yan X等人，MicroRNA_128inhibits glioma cells proliferation by targeting transcription factor E2F3a.J Mol Med.2009；87:43-51.
[0104] 24.Shi L，Cheng Z，Zhang J，Li R，Zhao P，F(xiàn)u Z等人，hsa-mir_181a and hsa-mir_181b function as tumor suppressors in human glioma cells.Brain Res.2008； 1236:185-93.
[0105] 25 · Silber J，Lim DA，Petritsch C，Persson AI，Maunakea AK，Yu M等人，miR-124and miR_137inhibit proliferation of glioblastoma multiforme cells and induce differentiation of brain tumor stem cells.BMC Med.2008；6:14.
[0106] 26.Maiorano NA，Mallamaci A.The pro-differentiating role of miR-124: indicating the road to become a neuron.RNA Biol.7:528-33.
[0107] 27 .Lavon I，Zrihan D，Granit A，Einstein 0，F(xiàn)ainstein N，Cohen MA等人， Gliomas display a microRNA expression profile reminiscent of neural precursor cells.Neuro Oncol.12:422-33.
[0108] 28.Karpowicz P，Willaime_Morawek S，Balenci L，DeVeale B，Inoue T，van der Kooy D.E-Cadherin regulates neural stem cell self-renewal.J Neurosci.2009；29: 3885-96.
[0109] 29.Katoh Y?Katoh M.Hedgehog signaling ? epithelial-t〇-mesenchymal transition and miRNA(review).Int J Mol Med.2008;22:271-5.
[0110] 30.0cana 0H?Nieto MA. A new regulatory loop in cancer-cell invasion.ΕΜΒ0 Rep.2008;9:521-2.
[0111] 31 · Verhaak RG，Hoadley KA，Purdom E，Wang V，Qi Y，Wilkerson MD 等人， Integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities in PDGFRA，IDH1，EGFR，and NF1.Cancer cell.17:98-110.
[0112] 32.Nduom EK?Hadjipanayis CG?Van Meir EG.Glioblastoma cancer stem-like cells: implications for pathogenesis and treatment. Cancer journal.2012；18:100-6.
[0113] 33. He J，Liu Y，Lubman DM. Targeting glioblastoma stem cells : cell surface markers. Current medicinal chemistry.2012；19:6050-5.
[0114] 34.Kambara H，0kano H，Chiocca EA，Saeki Y.An oncolytic HSV-lmutant expressing ICP34.5under control of a nestin promoter increases survival of animals even when symptomatic from a brain tumor. Cancer research.2005；65 : 2832-9.
[0115] 35.Xia H，Cheung WK，Ng SS，Jiang X，Jiang S，Sze J等人，Loss of brain- enriched miR_124microRNA enhances stem-like traits and invasiveness of glioma cells.The Journal of biological chemistry.2012；287:9962-71.
[0116] 36.Macdonald SJ,Mostafa HH,Morrison LA,Davido DJ.Genome sequence of herpes simplex virus lstrain KOS.Journal of virology.2012；86:6371-2.
[0117] 37.Kaji K,Norrby K,Paca A,Mileikovsky M,Mohseni P,ffoltjen K.Virus-free induction of pluripotency and subsequent excision of reprogramming factors. Nature.2009；458:771-5.
[0118] 38.Krisky DM,Marconi PC,01igino T,Rouse RJ,Fink DJ,Glorioso JC.Rapid method for construction of recombinant HSV gene transfer vectors.Gene therapy.1997；4:1120-5.
[0119] 實(shí)施例2
[0120] 本實(shí)施例描述了裝載基質(zhì)金屬蛋白酶9的腫瘤靶向I型oHSV以用于增強(qiáng)載體分布 和殺滅活性。
[0121] 材料和方法
[0122] 細(xì)胞系。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法培養(yǎng)人惡性膠質(zhì)瘤SNB19、U251、U87(由匹茲堡大學(xué)H Okada 博士友善提供）、J/A、J/C、J/EGFR[9]、非洲綠猴腎臟Vero細(xì)胞和7b[ 15]。
[0123] 在補(bǔ)充了10%胎牛血清（Sigma.St.Louis，M0)的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基 (Life technologies，Grand Island，NY)中培養(yǎng)細(xì)胞。在補(bǔ)充了Glutamax、B27、人β-FGF、 EGF、肝素和青霉素-鏈霉素的Neurobasal培養(yǎng)基中，以球狀體形式培養(yǎng)原代惡性膠質(zhì)瘤細(xì) 胞系GBM169、0G2(由俄亥俄州立大學(xué)Balveen Kaur博士友善提供）、GBM30。
[0124] 質(zhì)粒。通過(guò)在KGE-4: T124BAC中插入采用如下引物擴(kuò)增自pcDNA3 · 1GW的Gateway盒 以產(chǎn)生KGw BAC: 5 ' -TGCCCGTCGCGCGTGTTTGATGTTAATAAATAACACATAAATTTGGCTGGCCACTAGTCC AGTGTGGTGG-3 '（SEQ ID NO:12)和5 '-CTGAAATGCCCCCCCCCCCTTGCGGGCGGTCCATTAAAGACAACA AACAAATCCCCAGCATGCCTGCTATTGT-3 '·（SEQ ID NO:13)。
[0125] 通過(guò)將來(lái)自質(zhì)粒pCAGH[10]的CAG啟動(dòng)子克隆入pEntr-MMP9制備pEnCiLpEntr-MMP9的制備是通過(guò)將來(lái)自之前報(bào)道的質(zhì)粒pCMV6-XL4-MMP9的mmp9cDNA克隆入pEntrlA質(zhì)粒 [13]。
[0126] HSV基因組工程化。K0S-37BAC包含在細(xì)菌人工基因組(BAC)上完整菌株KOS HSV-1 基因組[14]，其由David Leib(達(dá)特茅斯醫(yī)學(xué)院，NH)友情提供。使用大腸桿菌內(nèi)雙Red重組 [24]將一系列修飾引入K0S-37BAC，所述K0S-37BAC為細(xì)菌人工染色體(BAC)上的HSV-1K0S 菌株的全長(zhǎng)基因克隆[14]。刪除產(chǎn)物KGBAC(圖5)的內(nèi)源重復(fù)(接合）區(qū)連同所述ICP47基因 的啟動(dòng)子，所述重復(fù)(接合)區(qū)包含一個(gè)拷貝的各種二倍體基因 ICP0、ICP34.5、LAI^PICP4。
[0127] KGwG4:T124BAC(稱作KGw)創(chuàng)建自KGE-4:T124BAC(在實(shí)施例1中討論過(guò)），上述創(chuàng)建 是通過(guò)經(jīng)由Red/ET重組技術(shù)（Gene Bridges GmbH，Heidelberg)將Gateway盒（來(lái)自 pcDNA3. 1GW)和牛生長(zhǎng)激素聚腺苷酸化序列插入U(xiǎn)L3-UL4基因間隔區(qū)。MMP9表達(dá)載體 KMMP9G4: T124BAC(稱作KMMP9)來(lái)源于KGwG4: T124BAC，其產(chǎn)生是通過(guò)Clonase反應(yīng)采用來(lái)自 pEnCM的CAG啟動(dòng)子-MMP9盒替換GW盒。為產(chǎn)生所述病毒，用KGwG4:T124BAC或KMMP9G4: T124BAC轉(zhuǎn)染Vero 7b細(xì)胞。利用通過(guò)相關(guān)修飾區(qū)的FIGE繪圖、PCR和DNA測(cè)序確證所有重組 載體。
[0128] 病毒生長(zhǎng)和純化。通過(guò)使用Lipofectamine?LTX試劑（Invitrogen)轉(zhuǎn)染Vero 7b細(xì) 胞將BAC DNA轉(zhuǎn)化為感染性病毒。在Vero細(xì)胞上確立病毒原液的生物滴度(PFU/mL);如下所 述，通過(guò)針對(duì)病毒gD基因的定量實(shí)時(shí)PCR( qPCR)測(cè)定基因組拷貝的物理滴度(gc) /mL。
[0129] 病毒基因組qPCR。根據(jù)制造商程序使用DNeasy Blood&Tissue試劑盒（Qiagen， Valencia，CA)從病毒原液提取DNA。使用Applied Biosystems StepOne?和StepOnePlus? 實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)手冊(cè)中描述的方案在來(lái)自包含完全HSV-1 (菌株KOS) gD編碼序列(pE-gDl 8)的 pENTRlA(Invitrogen)質(zhì)粒的DNA上產(chǎn)生qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。引物和探針序列列出如下:gD正向： 5'-CCCCGCTGGAACTACTATGACA-3'（SEQ ID N0:14) ;gD反向：5'-GCATCAGGAACCCCAGGTT-3' (SEQIDN0:15);探針 ：5'-FAM-TTCAGCGCCGTCAGCGAGGA-TAMRA-3'（SEQIDN0:16)。
[0130] 免疫印跡。在1 % NP40緩沖液中溶解細(xì)胞，溶解產(chǎn)物通過(guò)10 % SDS-聚丙烯酰胺凝膠 電泳，并使蛋白印跡與多克隆抗MMP-9抗體（1:1000稀釋）（Abeam，Cambridge，MA)或與抗gD 抗體（1:2000) (Santa Cruz，CA)以及HRP偶聯(lián)的抗兔第二抗體（Sigma，St .Louis，M0)反應(yīng)。 用化學(xué)發(fā)光底物(Amersham Pharmacia，Piscataway，NJ)顯色印跡。使各印跡的下部與多克 隆抗β微管蛋白抗體（1: 3000) (Sigma，St .Louis，M0)反應(yīng)以檢測(cè)裝載差異。用SuperSignal West Dura化學(xué)發(fā)光底物（Thermo Scientific，Rockford，IL)顯色印跡。
[0131] 明膠酶譜。在包含0.2%明膠的10%SDS_聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行分離前，即不對(duì)樣 本進(jìn)行還原劑處理也不對(duì)其進(jìn)行加熱處理。在酶譜洗滌緩沖液（10mM Tris pH 7.5,2.5% Triton X-100)中洗滌所述凝膠，在孵育緩沖液（50mM Tris pH 7.5,5mM CaC12，lyM ZnCl2)中37 °C下培養(yǎng)16小時(shí)，用1 %考馬斯亮藍(lán)R-250染色并用脫染緩沖液(4 %甲醇，8 %醋 酸)脫染[13]。
[0132] 進(jìn)入試驗(yàn)。用 KMMP9、KGw 或 KG(表達(dá) gD:wt)以 10,000、1，000或10(^(：/細(xì)胞感染1^、 J/C和J/EGFR細(xì)胞6小時(shí)并用單克隆鼠抗ICP4(1:300;Santa Cruz Biotechnology)和Cy3偶 聯(lián)羊抗鼠 IgG( 1:400; Sigma)免疫染色[9]。
[0133] MTT試驗(yàn)。將細(xì)胞點(diǎn)種在48孔板中并以100gc/細(xì)胞(Μ0Ι 0.2)感染3或6天。然后在 37°C下用0.5mg/ml MTT(Sigma)溶液處理細(xì)胞3小時(shí)。除去MTT溶液后，加入100%DMS0并通 過(guò)Wallac酶標(biāo)儀(Perkin Elmer，Waltham，MA)記錄0D570。將細(xì)胞存活百分?jǐn)?shù)計(jì)算為100% X0D(感染)/0D(未感染）。
[0134] 球狀體培養(yǎng)和共焦成像。分離球狀體并計(jì)數(shù)。在懸浮液中單獨(dú)生長(zhǎng)3,000細(xì)胞2天 直至球狀體形成。在微量分析板中用l〇〇〇pfu或4X10 7gc的KMMP9或KGw分別感染各球狀體。 用熒光顯微鏡每日獲得eGFP圖像。對(duì)于共焦成像，感染時(shí)將球狀體轉(zhuǎn)移至玻璃底培養(yǎng)皿 (Willco wells，Amsterdam，荷蘭）。5dpi下在4%多聚甲酸中固定球狀體，用具有DAPI (Vector Laboratories，Bur 1 ingame，CA)的封片劑處理并用FV1000共焦成像系統(tǒng) (Olympus，Miami，F(xiàn)L)獲得Z面圖像。
[0135] 腫瘤模型和治療。3-4周齡BALB/c無(wú)胸腺nu/nu小鼠購(gòu)自Charles River實(shí)驗(yàn)室 (Wilmington，ΜΑ)并飼養(yǎng)在BSL2設(shè)施中。根據(jù)如匹茲堡大學(xué)機(jī)構(gòu)動(dòng)物管理及使用委員會(huì) (IACUC)批準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理及使用指南(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所，1985)中的要求和建議進(jìn) 行所有動(dòng)物程序。
[0136] 根據(jù)描述[9]將人GBM30細(xì)胞顱內(nèi)移植入裸鼠。在5或10dpi下，也如所述[9]在注射 腫瘤細(xì)胞的相同坐標(biāo)處（前〇.5mm前2mm側(cè)（右）3mm深）接種5·65χ109基因組拷貝的KMMP9、 KGw或PBS(n = 3-4/組）。監(jiān)控動(dòng)物健康狀況并當(dāng)顯示發(fā)病跡象時(shí)將動(dòng)物安樂(lè)死。
[0137] MRI成像。從各治療組(KMMP9、KGw、PBS)隨機(jī)選擇若干小鼠。在治療前1天(GBM30移 植后9天）和治療后第3、6、9和13天對(duì)動(dòng)物進(jìn)行成像。使用Bruker BioSpec 94/30磁體 (Bruker BioSpin，Karlsruhe，德國(guó)）、2 · 0cm直徑僅接受(receive-only)鼠腦線圈和70mm直 徑線性卷線圈進(jìn)行成像。向麻醉小鼠腹膜內(nèi)注射0 · lmmol/kg Magnevist(Bayer Health Care Pharmaceuticals，Wayne，NJ)并在運(yùn)行Paravision 4.0的400MHz Bruker水平孔磁體 (Bruker Biospin，Bill erica，MA)上呈冠狀穿過(guò)感興趣區(qū)域獲得T2加權(quán)圖像(重復(fù)時(shí)間= 3，500ms，回聲時(shí)間=12ms，rare因數(shù)=8，navgs = 4)。
[0138] 統(tǒng)計(jì)分析。使用用于Windows的GraphPad Prism 6.01版（GraphPad Software，La Jol la，CA; www.graphpad.com)進(jìn)行具有Welch修正的未配對(duì)t檢驗(yàn)。將動(dòng)物存活數(shù)據(jù)繪制為 Kap lan-Me i er曲線并使用相同軟件通過(guò)Mant e 1 -Cox對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)進(jìn)行比較。
[0139] 結(jié)果
[0140] 表達(dá)MMP9的再靶向miR控制載體的構(gòu)建和表征
[0141] 圖5A中圖解了用于本研究的載體工程化和設(shè)計(jì)，且其包括意圖避免改變?nèi)魏尾《?裂解功能并因此最大化腫瘤細(xì)胞中的復(fù)制和裂解活性而避免正常腦中的病毒生長(zhǎng)的多處 修飾。
[0142] 將Gateway盒(Gw)和牛生長(zhǎng)激素聚腺苷酸化序列插入KGE_4:T124(實(shí)施例1中所 述）的UL3和UL4基因座之間以創(chuàng)建KGwG4: T124BAC(在此稱作KGw，對(duì)照載體）；通過(guò)使用在 CAG(CMV雞β肌動(dòng)蛋白）啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下的MMP9基因替換所述Gateway盒獲得表達(dá)MMP9的溶瘤 性載體(KMMP9G4: T124BAC在此稱作KMMP9)。
[0143] 對(duì)感染KMMP9的Vero細(xì)胞的免疫印跡分析證實(shí)了麗P9的正確表達(dá)（圖5B)。明膠酶 譜顯示出感染KMMP9的三個(gè)原代GBM細(xì)胞系GBM30、GBM169和0G2中相比于感染對(duì)照載體的細(xì) 胞具有更高的明膠酶活性（圖5C)，并且KMMP9感染Vero細(xì)胞的上清液相比于對(duì)照感染的 Vero細(xì)胞的上清液具有更高的明膠酶活性(圖?)。
[0144] 我們?nèi)缓鬁y(cè)定MMP9表達(dá)是否影響病毒通過(guò)識(shí)別表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)的進(jìn)入。 測(cè)試了如下細(xì)胞系的病毒進(jìn)入，由于不存在gD受體而抵抗wt HSV的EGFR轉(zhuǎn)導(dǎo)的J1.1-2細(xì)胞 (J/EGFR)(Nakano等人，Virol. ,413:12-18(2011 ))、表達(dá)人HVEM的J/A細(xì)胞（Uchida等人， J. Virol .83 :2951-2961(2009))以及表達(dá)人粘連蛋白-1的J/C細(xì)胞（Frampton等人， J. Virol.，81:10879-889(2007)) ;HVEM和粘連蛋白-1是wt gD的天然受體。感染6小時(shí)后通 過(guò)針對(duì)即刻早期HSV蛋白ICP4的免疫染色檢測(cè)病毒進(jìn)入。如圖6A中所示，EGFR再靶向病毒 KMMP9和KGw進(jìn)入J/EGFR細(xì)胞和表達(dá)gD: wt的親本HSV-1載體進(jìn)入J/A或J/C細(xì)胞一樣高效。即 便是在高病毒輸入（l〇,〇〇〇gc/細(xì)胞)下也沒(méi)有一種再靶向病毒可檢測(cè)地進(jìn)入J/A或J/C細(xì) 胞，證實(shí)所述MMP9表達(dá)未影響再祀向載體感染的功效或特異性。
[0145] 我們還評(píng)估了MMP9表達(dá)是否可能影響培養(yǎng)中的人GBM細(xì)胞中的病毒復(fù)制。結(jié)果（圖 6B和6C)顯示在兩種原代惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系GBM169和GBM30的球狀體中KMMP9以與KGw相似 地動(dòng)力學(xué)進(jìn)行復(fù)制，且所述2種病毒的產(chǎn)率(通過(guò)qPCR測(cè)定)在任何時(shí)間點(diǎn)均無(wú)實(shí)質(zhì)差異。
[0146] 為評(píng)估KMMP9的溶瘤活性，采用0.005M0I (100gc/細(xì)胞)感染已知表達(dá)EGFR的HSV可 進(jìn)入的人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系（包括U87MG、SNB19和GBM30)并在感染后第3天（圖7A)和第7天（圖 7B)通過(guò)溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四氮唑(MTT)試驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞活力。在晚 一些的時(shí)間點(diǎn)，KMMP9相比于KGw顯示出顯著更高的2種所述細(xì)胞系的殺滅，提示MMP9可增加 載體介導(dǎo)的溶瘤作用。
[0147] MMP-9在球狀體中培養(yǎng)中增加 HSV感染性。
[0148] 為評(píng)估增加的麗P-9的細(xì)胞表達(dá)對(duì)HSV在腫瘤細(xì)胞球狀體中擴(kuò)張的影響，將GBM30 和GBM169細(xì)胞培養(yǎng)為單一球狀體并用KMMP9或KGw病毒感染（圖8A)。在5dpi下，KMMP9相比于 KGw顯示出增強(qiáng)的載體表達(dá)的eGFP的分布。對(duì)各球狀體中eGFP陽(yáng)性細(xì)胞的定量證實(shí)了在 6dpi下KMMP9感染球狀體相對(duì)于KGw感染球狀體有約1.5倍的增加（圖8B; P = 0.006)。
[0149] 為進(jìn)一步量化麗P9對(duì)原發(fā)腫瘤來(lái)源球狀體的HSV感染性的影響，用KMMP9或KGw感 染GBM30細(xì)胞，并通過(guò)共聚焦顯微鏡成像由所述載體表達(dá)的eGFP表達(dá)作為評(píng)估病毒滲透和 感染性的手段。來(lái)自5μπι Z截面堆疊的3D重建顯示出KMMP9相比于KGw在球狀體內(nèi)增強(qiáng)的相 對(duì)感染性（圖8C)。我們還檢查了各球狀體根據(jù)Z軸深度的5段（自下而上0-20μπι、25-50μπι、 55-80μm、85-100μm、105-120μm和125-140μm)的感染性差異（圖8D和8E)。雖然在最外層段 (0-20μπι)未發(fā)現(xiàn)差異（圖8D和8Ε)，但深入球狀體內(nèi)，ΚΜΜΡ9顯示出相比于KGw顯著更高的感 染性(25-50和50-85μπι，P〈0.05)，提示MMP9增強(qiáng)載體擴(kuò)張貫穿所述球狀體。當(dāng)在球狀體之間 比較所有段時(shí)也發(fā)現(xiàn)了顯著性差異(配對(duì)t檢驗(yàn)，P = 0.013)。
[0150] MMP9溶瘤性載體在小鼠 GBM治療中高度有效。
[0151]我們之前顯示GBM30在裸鼠中能穩(wěn)定地建立致死腫瘤，其導(dǎo)致動(dòng)物在腫瘤細(xì)胞接 種后20天內(nèi)死亡[9]。我們使用患者來(lái)源的成球GBM30細(xì)胞在裸鼠中建立侵襲性顱內(nèi)腫瘤
[9]。每日觀測(cè)動(dòng)物并當(dāng)顯示發(fā)病跡象時(shí)將其安樂(lè)死。和我們發(fā)表的結(jié)果相似，腫瘤細(xì)胞接 種5天后在相同立體定位坐標(biāo)注射roS的小鼠在腫瘤細(xì)胞移植數(shù)周內(nèi)死亡（中位數(shù)18天；圖 9)。相反，使用MMP9表達(dá)病毒KMMP9或?qū)φ詹《綤Gw的腫瘤治療保護(hù)半數(shù)動(dòng)物至少35天且這 兩組的中位生存期是可比的（分別為29和31.5天;P = 0.61，對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)）。這些結(jié)果顯示 50%的MMP9治療動(dòng)物存活直至35天，相比而言無(wú)治療動(dòng)物則為18天（圖9)。
[0152]在平行獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)在腫瘤接種10天后在原位GBM30異種移植模型中注射載 體以將KMMP9和KGw的抗腫瘤功效與模擬(PBS)治療進(jìn)行比較。在治療前1天并再在治療后第 3、6、9和13天通過(guò)磁共振成像(MRI)對(duì)小鼠成像以觀測(cè)腫瘤大小變化。圖10A顯示了來(lái)自各 組的一個(gè)實(shí)例的T2加權(quán)圖像。對(duì)在治療起始時(shí)具有可比腫瘤體積的來(lái)自各組的單個(gè)動(dòng)物進(jìn) 行比較，顯而易見(jiàn)MMP9相比于KGw載體具有更強(qiáng)的溶瘤作用（圖10B)。
[0153]實(shí)施例2的參考文獻(xiàn)
[0154] 1 · Grossman，S.A.等人，Survival of patients with newly diagnosed glioblastoma treated with radiation and temozolomide in research studies in the United States.Clin Cancer Res，2010.16(8):p.2443-9.
[0155] 2 · Assi，H.等人，Gene therapy for brain tumors :basic developments and clinical implementation.Neurosci Lett?2012.527(2):p.71-7.
[0156] 3 · Friedman，G · K ·等人，Herpes simplex virus oncolytic therapy for pediatric malignancies.Mol Ther?2009.17(7):p.1125-35.
[0157] 4.Mohyeldin，A.和E.A.Chiocca，Gene and viral therapy for glioblastoma:a review of clinical trials and future directions.Cancer J?2012.18(1):p.82-8.
[0158] 5.Campadelli_Fiume，G·等人，Rethinking herpes simplex virus:the way to oncolytic agents.Rev Med Virol?2011.21(4):p.213-26.
[0159] 6.Broberg，E.K.和V.Hukkanen，Immune response to herpes simplex virus and gammal34.5deleted HSV vectors.Curr Gene Ther?2005.5(5):p.523-30.
[0160] 7 .Aghi，M.等人，Oncolytic herpes virus with defective ICP6specif ically replicates in quiescent cells with homozygous genetic mutations in pl6·Oncogene，2008·27(30):p·4249-54·
[0161] 8.Navaratnarajah，C.K.等人，Targeted entry of enveloped viruses:measles and herpes simplex virus I.Curr Opin Virol?2012.2(1):p.43-9.
[0162] 9.Uchida，H.等人，Effective treatment of an orthotopic xenograft model of human glioblastoma using an EGFR-retargeted oncolytic herpes simplex virus.Mol Ther?2013.21(3):p.561-9.
[0163] 10.Uchida，H.等人，A double mutation in glycoprotein gB compensates for ineffective gD-dependent initiation of herpes simplex virus type linfection.J Virol,2010.84(23):p.12200-9.
[0164] 11·Payne，L.S.和P·Η·Huang，The pathobiology of collagens in glioma.Mol Cancer Res，2013.11(10):p.1129-40.
[0165] 12.Mok，W.，Y.Boucher和R.K.Jain，Matrix metalloproteinases-land-8improve the distribution and efficacy of an oncolytic virus.Cancer Res?2007.67(22): p.10664-8.
[0166] 13 · Hong，C · S ·等人，Ectopic matrix metalloproteinase-9expression in human brain tumor cells enhances oncolytic HSV vector infection.Gene Ther， 2010.17(10):p.1200-5.
[0167] 14.Gierasch，W.W.等人，Construction and characterization of bacterial artificial chromosomes containing HSV-lstrains 17and K0S.J Virol Methods， 2006.135(2):p.197-206.
[0168] 15.Krisky，D.M.等人，Deletion of multiple immediate-early genes from herpes simplex virus reduces cytotoxicity and permits long-term gene expression in neurons.Gene Ther?1998.5(12):p.1593-603.
[0169] 16·Szymczak，A·L·和D·A·Vignali，Development of 2A pept ide-based strategies in the design of multicistronic vectors. Expert Opin Biol Ther， 2005.5(5):p.627-38.
[0170] 17 .Miao，H ·等人，EphA2promotes infiltrative invasion of glioma stem cells in vivo through cross-talk with Akt and regulates stem cell properties. Oncogene ? 2014.
[0171] 18.Yin，A.A.等人，The treatment of glioblastomas:a systematic update on clinical Phase III trials.Crit Rev Oncol Hematol?2013.87(3):p.265-82.
[0172] 19.Wong，J.等人，Targeted oncolytic herpes simp lex viruses for aggressive cancers.Curr Pharm Biotechnol?2012.13(9):p.1786-94.
[0173] 20.Wakimoto，H.等人，Effects of innate immunity on herpes simplex virus and its ability to kill tumor cells.Gene Ther?2003.10(11):p.983-90.
[0174] 21 · McKee，T · D ·等人，Degradation of fibrillar collagen in a human melanoma xenograft improves the efficacy of an oncolytic herpes simplex virus vector.Cancer Res，2006.66(5):p.2509-13.
[0175] 22.Yun?C.0.^Overcoming the extracellular matrix barrier to improve intratumoral spread and therapeutic potential of oncolytic virotherapy.Curr Opin Mol Ther?2008.10(4):p.356-61.
[0176] 23 · Dmitrieva，N ·等人，Chondroitinase ABC I-mediated enhancement of oncolytic virus spread and antitumor efficacy.Clin Cancer Res，2011·17(6): p.1362-72.
[0177] 24.Tischer，B.K.等人，Two-step red-mediated recombination for versatile high-efficiency markerless DNA manipulation in Escherichia coli.Biotechniques，2006·40(2):ρ·191_7·
[0178] 25. Ishida，D.等人，Enhanced cytotoxicity with a novel system combining the paclitaxel-2'-ethylcarbonate prodrug and an HSV amplicon with an attenuated replication-competent virus ?HF10as a helper virus. Cancer Lett， 2010.288(l):p.17-27.
[0179] 本文中所引用的所有參考文獻(xiàn)，包括公開(kāi)、專利申請(qǐng)和專利都在此通過(guò)引用并入本 文，就如同每個(gè)參考文獻(xiàn)個(gè)別并特定地指示通過(guò)引用并入本文中并且整體記載于本文中。已 公開(kāi)為US 2013/0096186和W0 2011/130749且要求美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)61/325,137的優(yōu)先權(quán)的 美國(guó)專利申請(qǐng)13/641，649(PCT/US2011/032923的國(guó)家階段）的內(nèi)容也在此以其整體并入， 且特別關(guān)注US 2013/0096186的[0039]、[0040]和[0041]段。還通過(guò)參照以其整體并入的是 Mazzacurati等人，Mol · Ther · 2014Sep 9 · doi : 10 · 1038/mt · 2014.177[Epub在印刷之前]。
[0180] 除非本文中另外指示或上下文明顯相矛盾，否則在描述本發(fā)明的上下文中（特別 是在以下權(quán)利要求書(shū)的上下文中）術(shù)語(yǔ)"一(a)"和"一(an)"和"所述(the)"以及類似指示物 的使用視為既涵蓋單數(shù)也覆蓋復(fù)數(shù)。除非另作說(shuō)明，否則術(shù)語(yǔ)"包含(comprising)"、"具有 (having)"、"包括（including)"以及"含有(containing)"應(yīng)理解為開(kāi)放術(shù)語(yǔ)（即，意指"包 括，但不限于"）。除非本文中另外指示，否則本文中數(shù)值范圍的敘述僅意圖充當(dāng)個(gè)別提及在 所述范圍內(nèi)的每一各別值的速記方法，并且每一各別值并入本說(shuō)明書(shū)中就如同在本文中分 別記載了這些值。除非本文中另外指示或另外上下文明顯相矛盾，否則本文所述的所有方 法可按任何適當(dāng)次序進(jìn)行。本文所提供的任何和所有實(shí)例或示例性措辭(比如"例如"）的使 用僅意圖更好地說(shuō)明本發(fā)明，并且除非另外要求，否則不會(huì)對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成限制。本說(shuō) 明書(shū)中的任何措辭都不應(yīng)理解為指示任何未要求的要素對(duì)本發(fā)明的實(shí)施而言是不可或缺。 [0181]本文中描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，包括本發(fā)明人已知用于進(jìn)行本發(fā)明的最佳 模式。通過(guò)閱讀以上描述，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠顯而易見(jiàn)獲得那些優(yōu)選實(shí)施方式的變 體。發(fā)明人預(yù)期技術(shù)人員能夠適當(dāng)?shù)厥褂盟鲎凅w，并且發(fā)明人也要求以除本文中特定描 述以外的方式實(shí)施本發(fā)明。因此，如適用法律允許，本發(fā)明包括隨附權(quán)利要求書(shū)中敘述的主 題的所有修飾和同等物。此外，除非本文中另外指示或另外上下文明顯相矛盾，否則其所有 可能變體中的上述要素的任何組合都涵蓋在本發(fā)明中。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種重組溶瘤性單純皰疹病毒(oHSV)，其包含： (a) 呈現(xiàn)在所述oHSV衣殼表面上的非HSV配體，其對(duì)癌細(xì)胞表面上存在的分子具有特異 性;和 (b) 插入HSV在正常(非癌性)細(xì)胞中復(fù)制所需的HSV基因的基因座中的多個(gè)拷貝的一種 或多種microRNA革E序列。2. 權(quán)利要求1所述oHSV，其中所述配體并入暴露在所述HSV表面上的糖蛋白中。3. 權(quán)利要求1或2所述oHSV，其中所述病毒包膜蛋白是gD或gC。4. 權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述oHSV，其中所述配體并入gD的殘基1和25之間。5. 權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述oHSV，其中所述配體能夠特異性結(jié)合EGFR或EGFRvII I。6. 權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述oHSV，其中所述配體是結(jié)合細(xì)胞受體的單鏈抗體(scFv)或 者肽或非肽激素或者生長(zhǎng)因子。7. 權(quán)利要求1_6任一項(xiàng)所述oHSV，其中所述microRNA革E1序列是microRNA的反向互補(bǔ)序 列。8. 權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述oHSV，其包含插入所述HSV基因的基因座中的兩個(gè)或多個(gè) (串聯(lián)的2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)或6個(gè))所述mi croRNA靶序列。9. 權(quán)利要求8所述oHSV，其包含插入所述HSV基因的基因座中的4個(gè)串聯(lián)拷貝的所述 mi croRNA革E1序列。10. 權(quán)利要求8或9所述oHSV，其中所述多拷貝的所述microRNA靶序列通過(guò)所述oHSV基 因組內(nèi)的四個(gè)或更多個(gè)核苷酸的間隔序列相分離。11. 權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)所述〇HSV，其中插入所述microRNA靶序列的所述HSV基因是 ICP4〇12. 權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)所述oHSV，其中所述microRNA靶序列插入所述HSV基因的3 '非 翻譯區(qū)（3'UTR)。13. 權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)所述oHSV，其中所述microRNA是miR-124。14. 權(quán)利要求 1-12 任一項(xiàng)所述 oHSV，其中所述 microRNA 是 miR-122、miR-124、miR-128、 miR-137和/或miR-199,或其兩種或多種的組合。15. -種重組oHSV，其包含 (a) 針對(duì)癌細(xì)胞表面上存在的蛋白具有特異性的非HSV配體，其為特異性結(jié)合EGFR或 EGFRvIII的scFv，且其插入所述oHSV gD糖蛋白的殘基1和25之間，和 (b) 插入所述oHSV基因組的ICP4的3'UTR中的4個(gè)拷貝的microRNA miR-124的反向互補(bǔ) 序列，每個(gè)所述拷貝通過(guò)8個(gè)核苷酸的間隔序列相分離。16. 權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)所述oHSV，其包含內(nèi)源重復(fù)(接合)區(qū)連同所述ICP47基因的啟 動(dòng)子的刪除，所述重復(fù)（接合）區(qū)包含一個(gè)拷貝的各種二倍體基因 ICP0、ICP34.5、LAI^P ICP4〇17. 權(quán)利要求1-16任一項(xiàng)所述oHSV，其進(jìn)一步包含促進(jìn)載體通過(guò)非經(jīng)典受體的進(jìn)入的 gB或gH基因突變。18. 權(quán)利要求1-17任一項(xiàng)所述oHSV，其進(jìn)一步包含轉(zhuǎn)基因。19. 權(quán)利要求18所述oHSV，其中所述轉(zhuǎn)基因編碼溶瘤因子。20. 權(quán)利要求18所述oHSV，其中所述轉(zhuǎn)基因編碼增強(qiáng)所述oHSV的橫向擴(kuò)張的蛋白或多 肽。21.權(quán)利要求20所述oHSV，其中所述轉(zhuǎn)基因編碼金屬蛋白酶9( "MMP9"）。21. 權(quán)利要求18所述oHSV，其中所述轉(zhuǎn)基因編碼誘導(dǎo)患者抗癌免疫反應(yīng)的蛋白或多肽。22. 權(quán)利要求18所述oHSV，其中所述轉(zhuǎn)基因編碼催化前藥轉(zhuǎn)化的蛋白或多肽。23. 權(quán)利要求22所述oHSV，其中所述轉(zhuǎn)基因編碼胞嘧啶脫氨酶或胸苷激酶。24. 權(quán)利要求18所述oHSV，其中所述轉(zhuǎn)基因編碼嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)。25. 權(quán)利要求1所述oHSV，其為KGE-4: T124。26. 編碼權(quán)利要求1-25任一項(xiàng)所述oHSV的核酸。27. 權(quán)利要求26所述核酸，其為細(xì)菌人工染色體(BAC)。28. -種病毒原液，其包含權(quán)利要求1-25任一項(xiàng)所述oHSV載體。29. -種組合物，其包含權(quán)利要求1-25任一項(xiàng)所述oHSV和藥學(xué)上可接受的載體。30. -種組合物，其包含權(quán)利要求28所述病毒原液和藥學(xué)上可接受的載體。31. -種殺滅癌細(xì)胞的方法，其包括在足以使所述oHSV感染所述癌細(xì)胞的條件下將所 述細(xì)胞暴露至權(quán)利要求1-25任一項(xiàng)所述oHSV、權(quán)利要求28所述原液或者權(quán)利要求29或30所 述組合物，從而在所述癌細(xì)胞內(nèi)所述oHSV的復(fù)制導(dǎo)致細(xì)胞死亡。32. 權(quán)利要求31所述方法，其中所述細(xì)胞是在體內(nèi)。33. 權(quán)利要求31或32所述方法，其中所述細(xì)胞是在腫瘤內(nèi)。34. 權(quán)利要求33所述方法，其中所述腫瘤是多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤。35. 權(quán)利要求31-34任一項(xiàng)所述方法，其中所述細(xì)胞是人細(xì)胞。36. 權(quán)利要求33或34所述方法，其中所述腫瘤是在動(dòng)物腦內(nèi)。37. 權(quán)利要求36所述方法，其中通過(guò)顱內(nèi)注射所述oHSV、原液或組合物至所述動(dòng)物將所 述oHSV暴露至所述細(xì)胞。38. 權(quán)利要求37所述方法，其中所述動(dòng)物是人。
【文檔編號(hào)】C12N7/00GK106068326SQ201480071446
【公開(kāi)日】2016年11月2日
【申請(qǐng)日】2014年10月28日 公開(kāi)號(hào)201480071446.1, CN 106068326 A, CN 106068326A, CN 201480071446, CN-A-106068326, CN106068326 A, CN106068326A, CN201480071446, CN201480071446.1, PCT/2014/62676, PCT/US/14/062676, PCT/US/14/62676, PCT/US/2014/062676, PCT/US/2014/62676, PCT/US14/062676, PCT/US14/62676, PCT/US14062676, PCT/US1462676, PCT/US2014/062676, PCT/US2014/62676, PCT/US2014062676, PCT/US201462676
【發(fā)明人】?jī)?nèi)田宏昭, J·科恩, J·C·格洛廖索三世, P·格蘭迪
【申請(qǐng)人】聯(lián)邦高等教育系統(tǒng)-匹茲堡大學(xué)